Сбор и обработка данных нейтронной кристаллографии для моделирования атомов водорода в белковых структурах

Summary

Кристаллография нейтронного белка является структурным методом, который позволяет локализовать атомы водорода, тем самым обеспечивая важные механистические детали функции белка. Здесь представлен рабочий процесс монтажа кристалла белка, сбор данных о дифракции нейтронов, уточнение структуры и анализ карт плотности длин рассеяния нейтронов.

Abstract

Нейтронная кристаллография – это структурный метод, который позволяет определять положения атомов водорода в биологических макромолекулах, давая механистически важную информацию о состояниях протонации и гидратации, не вызывая радиационного повреждения. Рентгеновская дифракция, напротив, дает лишь ограниченную информацию о положении атомов света, а рентгеновский пучок быстро индуцирует радиационное повреждение светочувствительных кофакторов и металлических центров. Здесь представлен рабочий процесс, используемый для лучевых линий IMAGINE и MaNDi в Национальной лаборатории Оук-Ридж (ORNL) для получения структуры дифракции нейтронов после выращивания кристалла белка подходящего размера (> 0,1 ^мм3). Показано монтирование гидрогенизированных кристаллов белка в кварцевых капиллярах для сбора данных о нейтронной дифракции. Также представлен процесс парообмена смонтированных кристаллов с _{D2O-содержащим} буфером для обеспечения замещения атомов водорода в обменных местах дейтерием. Включение дейтерия уменьшает фон, возникающий в результате некогерентного рассеяния атомов водорода, и предотвращает подавление плотности, вызванное их отрицательной когерентной длиной рассеяния. Стратегии выравнивания образцов и сбора данных о комнатной температуре иллюстрируются с использованием квази-Лауэ сбора данных в IMAGINE на изотопном реакторе с высоким потоком (HFIR). Кроме того, установка кристаллов и быстрое замораживание в жидком азоте для сбора криоданных для улавливания промежуточных продуктов лабильной реакции демонстрируется на приборе MaNDi по времени пролета в источнике нейтронов spallation (SNS). Также будет рассмотрен вопрос о подготовке файлов координатных и дифракционных данных модели и визуализации карт плотности плотности рассеяния нейтронов (SLD). Наконец, будет обсуждаться уточнение структуры по нейтронным данным только или по совместным рентгеновским/нейтронным данным для получения полноатомной структуры интересующего белка. Процесс определения нейтронной структуры будет продемонстрирован с использованием кристаллов литического полисахарида монооксигеназы Neurospora crassa LPMO9D, медьсодержащего металлопротеина, участвующего в деградации непокорных полисахаридов посредством окислительного расщепления гликозидной связи.

Introduction

Нейтронная макромолекулярная кристаллография – это метод, который обеспечивает уникальное окно в структуру и основную химию белков. Концептуально похожая на рентгеновскую дифракцию, нейтронная дифракция обеспечивает атомистические детали макромолекулярной структуры, однако взаимодействие нейтронов с ядрами позволяет локализовать атомы света, которые часто трудно обнаружить при рентгеновской дифракции1. Во время дифракции рентгеновских лучей рентгеновские лучи рассеиваются из электронного облака, делая легкие атомы, такие как водород (H), плохо видимыми на картах электронной плотности, которые не имеют почти суб-Ångström ^{разрешения2}. Напротив, интенсивность рассеяния нейтронов зависит от сложных взаимодействий с ядром, при этом изотопы одного и того же элемента демонстрируют разную длину рассеяния. Таким образом, легкие атомы и их изотопы, такие как водород (^1H) и дейтерий (^2H или D), имеют сопоставимую видимость с основными атомами углерода, азота и кислорода в картах плотности рассеяния нейтронов (SLD). Кроме того, поскольку величина рассеяния нейтронов не зависит от количества электронов, рассеяние от легких элементов не затемняется тяжелыми элементами, когда они находятся в непосредственной близости друг от друга, как это наблюдается при рентгеновском рассеянии. Улучшенная видимость H и его изотопа D при использовании нейтронной дифракции дает ценную информацию о состоянии протонирования каталитически важных остатков, кофакторов и лигандов и облегчает ориентацию молекул воды, раскрывая важную информацию о каталитических механизмах и химии ^белка3. Нейтронная дифракция также предлагает преимущество в том, что она является неразрушающей техникой, особенно подходящей для биологических образцов, чувствительных к ионизации, таких как белки с металлическими центрами или светочувствительные окислительно-восстановительные кофакторы2. Основное внимание в этой статье уделяется обзору рабочего процесса для получения высококачественной кристаллической структуры нейтронного белка. Мы отсылаем заинтересованного читателя к Podjarny et ^al.4, ^Blakeley5, Blakeley et ^al.6 и O’Dell et ^al.3 для отличного обзора дифракции нейтронного белка и Ashkar et ^al.7 для дальнейшего применения рассеяния нейтронов.

Нейтроны в основном образуются в ходе ядерных реакций с использованием одного из двух процессов: ядерного деления в реакторных источниках или расщепления в ускорительных ^{источниках8}. Реакторные источники обеспечивают непрерывный пучок нейтронов, используя ядерное деление изотопа ^235U, в то время как спальтационные источники нейтронов производят импульсный пучок нейтронов, бомбардируя мишень, например жидкий металл, такой как ртуть, протонами9. Национальная лаборатория Оук-Ридж (ORNL) в Оук-Ридже, штат Теннесси, содержит как стационарный источник нейтронов в изотопном реакторе с высоким потоком (HFIR), так и импульсный источник 60 Гц в источнике нейтронов сползания (SNS). Лучевая линия IMAGINE, расположенная в HFIR, представляет собой нейтронный дифрактометр, оптимизированный для биологических макромолекул (дополнительный рисунок 1)¹⁰. IMAGINE использует детектор нейтронных изображений для измерения квази-лауэских данных с использованием узкой полосы пропускания в диапазоне 2,8 – 4,5 Å от монокристаллов с единичными краями ячейки <150 Å. Макромолекулярный нейтронный дифрактометр (MaNDi), расположенный в SNS, представляет собой нейтронный дифрактометр времени пролета (TOF) Лауэ, оснащенный сферической системой детекторной решетки (DAF) (дополнительный рисунок 2)¹¹. MaNDi измеряет данные от монокристаллов с краями элементных ячеек в диапазоне 10 – 300 Å, используя перестраиваемую полосу пропускания 2 Å-длин волны между 2,0 – 6,0 ^Å12.

Процесс генерации нейтронов является высокоэнергоемким, что приводит к относительно слабым потокам пучка нейтронов при контрастировании с потоками рентгеновского пучка на источниках синхротронов13. Для обеспечения достаточного соотношения сигнал/шум при сборе данных необходимо выращивать кристаллы подходящего размера и ^{качества14}. Как правило, кристаллы с объемами > 0,1 ^мм3 нужны для сбора данных с адекватной ^{статистикой15}. В дополнение к более низким потокам необходимо учитывать неотъемлемые свойства взаимодействия между нейтронами и ядрами ^{образца16}. Длина рассеяния нейтронов различается для изотопов одного и того же элемента, свойство, которое может быть выгодно использовано в рассеянии нейтронов под малым углом (SANS) для маскировки или выделения областей образца – процесс, известный как контрастное ^{сопоставление17}. В дифракционных экспериментах длина отрицательного когерентного рассеяния нейтронов H (-3,741 fm для ^1H) может привести к подавлению характеристик карты плотности рассеяния нейтронов, поскольку длина рассеяния когерентных нейтронов других биологически значимых атомов, включая углерод (6,6511 fm для ^12C), азот (9,37 fm для ^14N), кислород (5,803 fm для ^16O), фосфор (5,13 fm для ^31P) и сера (2,804 fm для ^32S), являются положительными (таблица 1)^12,14. Кроме того, большая некогерентная длина рассеяния H (25,274 fm) увеличивает фон во время сбора данных, затрудняя качество набора данных и ставя под угрозу разрешение ^{данных7}. Чтобы обойти эти ограничения, введенные H, необходимо для дифракции нейтронов обменять H на его изотоп дейтерия^{, 2H}(D), который имеет положительную длину когерентного рассеяния нейтронов (6,671 fm) и значительно меньшую длину некогерентного рассеяния (4,04 fm)¹⁹. Это может быть достигнуто путем пердеутерации, процесса, в котором белок экспрессируется организмами, выращенными в полностью дейтерированных средах, обеспечивая полное включение D в H-участки20. Также возможно частично дейтерировать белок, заменив H на D исключительно на обменных участках (титруемых группах), в то время как необменяемые углерод-связанные участки остаются ^{гидрированными21}. Это может быть достигнуто путем роста гидрогенизированных кристаллов белка в дейтерированном материнском ^{ликворе22}. Однако чаще всего H/D обмен гидрогенизированных белков осуществляется путем парообмена после роста достаточно крупных кристаллов в буфере на основе _H2O23. В таких случаях кристаллы устанавливаются в кварцевый капилляр и уравновешиваются парами материнским щелоком на основе _D20.

Ограниченные потоки нейтронов в источниках нейтронов приводят к увеличению времени сбора данных, от нескольких дней до нескольких ^{недель24}. В ORNL и IMAGINE, и MaNDi используют узкую полосу пропускания длин волн в диапазоне 2–6 Å для оптимизации сбора ^{данных25}. Данные могут собираться при комнатной температуре или при криотемпературе. Сбор криозданных может потенциально улучшить качество данных и открывает возможность для замораживания каталитических промежуточных продуктов. После сбора данных о нейтронной дифракции набор рентгеновских данных обычно собирается на одном кристалле при той же температуре или на кристалле, выращенном в идентичных ^{условиях26}. Сбор данных при одинаковой температуре позволяет выполнять уточнение структуры как по рентгеновским, так и по нейтронным данным, предотвращая любые потенциальные артефакты, вызванные температурой, такие как изменения видимости и положения вод или заполнение остатков с альтернативными ^{конформациями27}. Совместная уточнение рентгеновских нейтронных данных увеличивает отношение данных к параметрам и обеспечивает преимущество, позволяющее уточнять координаты белковой магистрали по сравнению с данными рентгеновского излучения, в то время как данные дифракции нейтронов используются для уточнения положения атомов H/^D28. Это особенно полезно при использовании частично дейтерированных образцов, где присутствует подавление плотности из-за атомов Н в необменяемых участках белка. Хотя количество рентгеновских структур намного превышает количество нейтронных структур, депонированных в Банке белковых данных (PDB), пакеты программного обеспечения, первоначально предназначенные для уточнения рентгеновских данных, были расширены, чтобы охватить нейтронные данные, а также ^3,29,30. После сбора данных модели могут быть уточнены с использованием пакетов уточнения, таких как phenix.refine, CNSsolve (nCNS) или SHELXL28,31,32,33. В процессе уточнения карты плотности рассеяния нейтронов могут быть визуализированы для ручной установки с использованием ^COOT34. Следуя структурному решению, координаты и файлы данных нейтронной и/или рентгеновской дифракции могут быть представлены в PDB, который проверит и депонирует модель, сделав ее доступной для публичного доступа18,29,30.

Структурный анализ белков представляет собой многогранный подход, в котором используются многочисленные методы для исследования их функции и ^{механизма35}. Кристаллография нейтронного белка дает ценную химическую информацию для расширения и дополнения результатов дополнительных исследований, таких как рентгеновская дифракция, спектроскопия, ядерный магнитный резонанс (ЯМР) или микрокристаллическая дифракция электронов (microED)³⁶. Дифракция нейтронного белка обладает уникальными возможностями для понимания ферментативных механизмов, поскольку атомы H занимают центральное место в их химии. Отсутствие радиационных повреждений, индуцированных нейтронами, делают их зондом, исключительно подходящим для изучения металлопротеинов37. Здесь мы представляем репрезентативный пример процесса дифракции нейтронного белка от подготовки образца до сбора, уточнения и анализа данных (рисунок 1). Кристаллы достаточного размера для экспериментов по дифракции нейтронов были выращены из металлопротеина Neurospora crassa LPMO9D (NcLPMO9D). Nc LPMO9D представляет собой медьсодержащий металлопротеин, участвующий в деградации непокорной целлюлозы путем введения атома кислорода в гликозидную ^{связь38,39}. Активный сайт NcLPMO9D содержит мононуклеарный медный центр в характерной «гистидин-скобке», состоящей из N-концевого гистидина и второго законсервированного гистидина (дополнительный рисунок 3)⁴⁰. N-терминал грибковых ЛПМО метилирован, но постпереходная модификация не происходит во время рекомбинантной экспрессии в дрожжах. В состоянии покоя NcLPMO9D медный центр присутствует в состоянии окисления ^Cu2+ и активируется восстановлением одиночных электронов до ^Cu1+, что позволяет молекулярному кислороду связываться и активироваться путем быстрого восстановления до супероксидных ^{частиц41,42}. Общая реакция NcLPMO9D требует дальнейшего добавления одного электрона и двух протонов для образования гидроксилированного полисахаридного ^{продукта43}. Идентичность активированных форм кислорода, ответственных за абстракцию атомов водорода (HAA), из полисахаридной подложки не была идентифицирована, и в настоящее время продолжаются интенсивные структурные и вычислительные ^{исследования44,45}. Учитывая окислительно-восстановительную химию на активном объекте NcLPMO9D, смягчение радиационного ущерба особенно актуально. Здесь мы проиллюстрировали сбор данных о комнатной температуре и криомпературе на кристаллах NcLPMO9D для определения структуры NcLPMO9D в состоянии покоя и в активированном восстановленном виде ^{соответственно46}. Особое внимание будет уделяться монтажу кристаллов белка, настройке прибора лучевой линии для сбора данных, подготовке данных и файлов координат, а также этапам уточнения, необходимым для моделирования полноатомной нейтронной структуры.

Protocol

1. Оценка размера кристалла

1. Измерьте размер кристаллов с помощью микроскопа, оснащенного нормальным и поляризованным светом. Выберите кристаллы с минимальным объемом ~0,1 ^мм3 (дополнительный рисунок 4).
2. Маркируйте скважины с достаточно крупными кристаллами и отмечайте условия кристаллизации, используемые для генерации этих кристаллов.

2. Подготовка дейтерированного кристаллизационного буфера

1. Растворите компоненты кристаллизационного буфера в _D2O для создания дейтерированного буфера кристаллизации.
2. Отрегулируйте pH буфера, вычислив pD решения с помощью следующего уравнения:
   (1)
   где _pHmeas – pH, измеренный стандартным стеклянным электродом. Первоначальный pH буфера кристаллизации NcLPMO9D составлял 6,0, поэтому мы _{будем использовать pHmeas} 5,6 для дейтерированного буфера кристаллизации при pD 6,0.
3. Погрузите электрод рН-метра в _D2O на десять минут перед использованием (дополнительный рисунок 5).
4. Отрегулируйте _pHmeas до 5,6 с помощью основания NaOD или кислоты DCl.

3. Сбор кристаллов

1. Поместите силиконизированные круглые стеклянные слайды диаметром 22 мм рядом с кристаллизационным лотком, из которого будут собираться кристаллы. Используйте чистый стеклянный слайд на кристалл (рисунок 2A).
2. Откройте запечатанную сэндвич-коробку, содержащую кристаллы белка, в 9-луночной силиконизированной стеклянной пластине большого объема.
3. Удалите 10-20 мкл из кристаллизационного резервуарного раствора с помощью микропипетки и поместите раствор на стеклянный слайд (рисунок 2B).
4. Соберите кристалл с помощью микролупа соответствующего размера и поместите кристалл в резервуарную каплю раствора на стеклянную горку, чтобы удалить мусор, который часто собирают вместе с кристаллом (рисунок 2C и рисунок 2D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо будет работать быстро, так как капли малого объема могут испаряться. Собранные кристаллы также подвержены риску высыхания при воздействии атмосферы. Возможно, потребуется добавить некоторый резервуарный раствор к белковой капле, чтобы предотвратить высыхание кристаллов в небольших кристаллизационных каплях.

4. Хрустальный монтаж

ПРИМЕЧАНИЕ: Протоколы капиллярного монтажа варьируются в зависимости от предпочтений экспериментаторов. Чтобы предотвратить повреждение кристаллов, капилляры, которые необходимо укоротить, должны быть забиты режущим камнем или наждачной бумагой, чтобы обеспечить плавный разрыв.

1. Заполните один конец кварцевого капилляра диаметром 2 мм длиной 50 мм резервуарным буфером путем капиллярного действия или путем непосредственного пипетирования ~10 мкл резервуарного буфера в капилляр (рисунок 3A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пользователям рекомендуется использовать кварцевые капиллярные трубки, поскольку, помимо их механической прочности, важно ограничить поглощение пучка нейтронов и снизить фоновые вклады капилляра. Стеклянные капилляры вносят высокий фон и поглощают нейтроны, снижая качество данных.
2. Аккуратно поместите кристалл в резервуарный буфер в кварцевом капилляре с помощью монтажной петли (рисунок 3B и рисунок 3C).
3. Осторожно постучите по трубке, чтобы переместить резервуарный буфер и погруженный в него кристалл вниз по капилляру (рисунок 3D).
4. Поместите кристалл не ближе 13,5 мм и не более чем на 27,5 мм от одного конца капилляра; это будет монтажный конец (дополнительный рисунок 6).
5. Аспирируйте буферный раствор вокруг кристалла, используя длинный тонкий наконечник пипетки, оставляя кристалл слегка влажным. Не прикасайтесь к кристаллу (дополнительный рисунок 7А).
6. Высушите стенки капилляров тонким бумажным фитилем (дополнительный рисунок 7B).
7. Пипетка 20-50 мкл дейтерированного буферного раствора в конец капилляра напротив монтажного конца (рисунок 4А).
8. Расплавите пчелиный воск тепловой «палочкой» и аккуратно вставьте капилляр в этот расплавленный пчелиный воск. Повторяйте до тех пор, пока не образуется герметичное уплотнение (рисунок 4B и рисунок 4C).
9. Пипетка очень небольшого количества дейтерированного буфера, примерно 5 мкл в монтажном конце капилляра, чтобы действовать как «радиатор» для горячего пчелиного воска. Окуните этот конец в расплавленный пчелиный воск, чтобы создать герметичное уплотнение, как описано ранее, чтобы сформировать капилляр, герметизированный на обоих концах (рисунок 4D).
10. Осмотрите установленный кристалл с помощью микроскопа после установки, чтобы обеспечить герметичность (рисунок 4E).
11. Тщательно закрепите установленные кристаллы салфетками Kim в контейнере, таком как 15-мл Falcon tube или Petri Dish, и храните горизонтально при температуре, при которой кристаллы были выращены (рисунок 4F).

5. Парообмен

1. Замените дейтерированный буфер на свежий буфер через два дня после монтажа кристалла.
2. Расплавьте восковую печать дальше всего от кристалла с помощью нагревательной петли и используйте пипетку и бумажные фитили, чтобы удалить буфер.
3. Залейте капилляр 20-50 мкл дейтерированного буферного раствора и запечатайте воском.
4. Повторите замену дейтерированного буфера еще дважды с интервалом в четыре дня, чтобы убедиться, что обмен дейтерированным буферным паром завершен и позволяет парообмен в течение не менее двух недель.

6. Дифракция нейтронного белка

ПРИМЕЧАНИЕ: Читателям, заинтересованным в особенностях линии луча IMAGINE, рекомендуется обратиться к Meilleur et al. 2013, Meilleur et al. 201810,47.

1. Сбор данных о комнатной температуре на линии луча IMAGINE в HFIR
   1. Монтаж образцов
      1. Закрепите капиллярный кристалл на гониометре шпаклевкой.
      2. Установите гониометр на палочку образца и центрируйте кристалл в луче с помощью автономной станции выравнивания.
      3. Закрепите рукоятку образца на сцене образца прибора (дополнительный рисунок 1В).
      4. Убедитесь, что экспериментальная хижина освобождена, и откройте затвор лучевой линии для сбора нейтронных данных.
   2. Сбор данных
      1. Откройте программу сбора данных на компьютере управления линией луча и перейдите на вкладку Настройка , чтобы настроить стратегию сбора данных. В разделе Параметры эксперимента введите имя образца рядом с полем Имя образца и введите номер предложения рядом с полем Предложение. В разделе Именование изображений выберите Шаблон папки и задайте место назначения для сохраненных полученных данных, а затем выберите Префикс изображения и введите соответствующее имя кадра (дополнительный рисунок 8).
      2. Откройте графический интерфейс Optics и нажмите 2,78 для _λmin и 4,78 для _λmax , чтобы установить квази-Laue диапазон для сбора данных (дополнительный рисунок 9).
      3. Переключитесь на вкладку Сбор и в разделе Параметры следующего сканирования вставьте время экспозиции в секундах в поле Экспозиция, количество кадров в разделе N кадров и углы сбора данных в разделе Δ φ/кадр. Назовите кадр, который будет собираться, в поле Image Prefix и начните сбор данных, нажав кнопку Start Scan (дополнительный рисунок 10).
      4. Дифрагированные нейтроны будут обнаружены детектором имиджевых пластин. В конце каждой экспозиции будет считываться пластина изображения и отображаться рисунок на графическом интерфейсе сбора данных (дополнительный рисунок 11).
      5. Кадры индексируются, интегрируются, нормируются по длине волны и масштабируются с использованием Lauegen, ^Lscale50 и Scala ответственным ученым по лучевой линии, который предоставит пользователю объединенный файл отражения после сбора данных (дополнительный рисунок 12).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Сбор данных как в IMAGINE, так и в MaNDi будет осуществляться в квазилауэ-режиме с использованием методологии и программного обеспечения, разработанных для сбора дифракционных данных Лауэ, как это было разработано Helliwell et ^al.48 и Nieh et ^al.49.
      6. Сбор соответствующего набора рентгеновских данных на том же кристалле при той же температуре после сбора данных о нейтронной дифракции (дополнительный рисунок 13).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Кристалл, выращенный из той же капли или в тех же условиях кристаллизации, также может быть использован для сбора данных рентгеновской дифракции для совместного нейтронно-рентгеновского уточнения.
2. Сбор криозданных на лучевой линии MaNDi в социальных сетях
   ПРИМЕЧАНИЕ: Читателям, заинтересованным в особенностях линии луча, рекомендуется проконсультироваться с Coates et al. (2015), Meilleur et al. 201810,11.
   1. Монтаж образцов
      1. Приготовьте раствор для замачивания дейтерированного аскорбата для восстановления кристаллов и дейтерированного криопротектора. Поместите 20 мкл капель каждого из этих растворов в сидячие лунки в кристаллизационной пластине.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор криопротектора обычно является криопротектором, который доказал свою эффективность для сбора криомпературных рентгеновских дифракционных данных, приготовленных в _D2O. Этот криопротектор может быть дополнительно оптимизирован (например, концентрация) для сбора нейтронных данных, если это необходимо.
      2. Выберите петли для монтажа образца и прикрепите их к магнитному крио-основанию в соответствии с рекомендациями MaNDi (дополнительный рисунок 14).
      3. Наполните пену крио-Дьюара жидким азотом. Поместите металлическую криозащитную втулку в жидкий азот для охлаждения (дополнительный рисунок 15А).
      4. Снимите восковые пробки с обоих концов капилляра и постучите по капилляру, чтобы переместить буферную пробку так, чтобы установленный кристалл был погружен в буфер. Вымойте кристалл в 20 мкл раствора капли в сидячем капельном колодце (дополнительный рисунок 15B и дополнительный рисунок 15C).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап не требуется, если H/D обмен был выполнен путем уравновешивания капель кристаллизации против дейтерированного буфера или путем прямого замачивания кристалла в дейтерированном буфере.
      5. Погрузите кристалл в раствор для замачивания аскорбата на два часа. Установите кристалл в микротрубрику, прикрепленную к магнитному криоосновну. Погрузите установленный кристалл в криопротектор на 10 секунд и погрузите кристалл и криомонтаж в жидкий азот для замораживания (дополнительный рисунок 15D).
      6. После замораживания кристалла используйте предварительно охлажденный криоконтафтовый щипц и установите кристалл на ступень образца MaNDi, оснащенную криопотоком. Осторожно откройте криоконтафтовый щипц и убедитесь, что кристалл остается в криотоке (дополнительный рисунок 2C).
   2. Сбор данных
      1. Откройте программное обеспечение для сбора данных, в котором информация об эксперименте будет заполняться автоматически.
      2. Нажмите на центр кристалла, чтобы центрировать его с помощью управляемого компьютером гониометра (дополнительный рисунок 16).
      3. В разделе Таблица настройте стратегию сбора данных, введя углы сбора данных под “phi”, а также общую экспозицию пучка нейтронов на кадр в поле Value (Дополнительный рисунок 17).
      4. Нажмите кнопку Отправить , чтобы начать сбор данных.
      5. По мере сбора данных будут видны дифрагированные нейтроны (дополнительный рисунок 17). Дифракционные пятна станут более четкими по мере увеличения времени экспозиции, улучшая отношение сигнал/шум (рисунок 5).
      6. Кадры будут индексироваться, интегрироваться, нормироваться и масштабироваться с использованием Mantid и Lauenorm ответственным ученым по линии луча, который предоставит пользователю объединенный файл интенсивности после сбора ^{данных51}.

7. Уточнение структуры

1. Совместная уточнение рентгеновских и нейтронных данных
   1. Подготовка структуры
      1. Уточните рентгеновские данные для получения структуры белка с помощью программного пакета phenix.refine и Coot для ручного построения для получения завершенной структуры.
      2. Откройте CCP4 и выберите программу Convert to/modify/extend MTZ , чтобы сопоставить флаги данных нейтронных данных без R с флагами рентгеновских данных. Выберите для импорта файла отражения в формате MTZ . В разделе В загрузите полученный нейтронный MTZ-файл и загрузите рентгеновский mtz-файл в разделе Импорт FreeR MTZ (Дополнительный рисунок 18). Присвойте имя новому MTZ-файлу в разделе Выход и нажмите кнопку Выполнить.
      3. Откройте пакет программного обеспечения Phenix и нажмите ReadySet в разделе Инструменты уточнения. Рядом с PDB-файлом загрузите файл координат PDB, уточненный по данным рентгеновского излучения. Выберите Добавить водород в модель, если он отсутствует , и выберите H/D на заменяемых участках, H в другом месте в раскрывающемся меню. Выберите Добавить дейтерий к молекулам растворителя и оставьте оставшиеся параметры на их значениях по умолчанию (дополнительный рисунок 19A).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Если используется пердойтерированный белок, выберите опцию Добавить водород в модель, если она отсутствует , и выберите H/D в обменных местах, D в другом месте.
   2. Уточнение структуры
      1. Откройте программу phenix.refine на вкладке Уточнение , чтобы настроить уточнение с использованием как рентгеновских, так и нейтронных данных. На вкладке Настройка во входных файлах введите PDB-файл из рентгеновской структуры, которая была обработана с помощью ReadySet, и необходимый файл CIF удерживает для любых соответствующих лигандов. Загрузите файл MTZ из нейтронных данных с флагами Rfree, назначенными с помощью CCP4, и назначьте его как «Нейтронные данные» и «Нейтрон R-свободный» под заголовком Тип данных. Загрузите файл MTZ из рентгеновских данных и назначьте его как «Рентгеновские данные» и «X-ray R-free» под заголовком Тип данных. Метки Space group и Data будут автоматически заполняться после загрузки данных (дополнительный рисунок 19B).
         ПРИМЕЧАНИЕ: При выполнении уточнения и вводе информации о кристалле используйте единичную ячейку, определенную по рентгеновским данным.
      2. На вкладке Настройка в параметрах Уточнения сохраните стандартную стратегию уточнения. Увеличение числа циклов до пяти (дополнительный рисунок 20)
      3. Выберите Все параметры, нажмите «Дополнительно» и выберите «Водороды…». Измените модель очистки водорода на индивидуальную и отключите Force riding adp (Дополнительный рисунок 20).
      4. Выберите Все параметры и откройте опцию Поиск параметров . Найдите слово ядерный и выберите Использовать ядерные расстояния для X-H/D (дополнительный рисунок 20).
      5. Выберите Выполнить , чтобы инициировать уточнение.
   3. Модельное строительство
      1. После уточнения в Phenix нажмите «Открыть в Coot» на вкладке «Результаты», чтобы визуализировать карты электронной плотности рентгеновского излучения и SLD нейтронов. Перейдите на вкладку Display Manager и в разделе Maps нажмите удалить карту рядом с картами _neutron, чтобы удалить нейтронные карты (дополнительный рисунок 21). Нажмите файл > Открыть MTZ, mmCIF fcf или phs…. Выберите текущие файлы уточнения и откройте MTZ-файл. Для опции Амплитуды и Фазы выберите данные 2FOFC WT_no_fill_neutron в раскрывающемся меню. Повторите это и откройте данные _FOFC WT_neutron. Откройте Display Manager и переключите кнопку Scroll для карт нейтронов и рентгеновских лучей 2FOFCWT, затем прокрутите, чтобы уменьшить rmsd карт _2FOFCWT до 1,00 (дополнительный рисунок 21). Переключите прокрутку для нейтронных и рентгеновских карт _FOFCWT и прокрутите, чтобы уменьшить rmsd карт _FOFCWT до 3,00.
      2. Выполните визуальный осмотр остатков, чтобы определить, соответствует ли модель данным. Определите правильную ориентацию и заполненность H/D всех сменных участков, проанализировав пики карты разностной плотности. Сюда входят гидроксильные группы серинов, треонинов и тирозинов; азот гистидина, глутамина, аспарагина и лизина; сульфгидрил цистеина; карбоксильные группы аспартата и глутамата; магистральные амидные группы; лиганды; кофакторы и любые потенциальные функционализированные остатки (рисунок 6).
      3. Переориентируйте молекулы воды в соответствии с плотностью нейтронов и взаимодействиями водородных связей, вращая их с помощью функции Rotate Translate Zone/Chain/Molecule (дополнительный рисунок 22A и дополнительный рисунок 22B). Отрегулируйте положения заменяемых участков H/D белкового остатка с помощью инструмента «Редактировать углы ши » и функции «Повернуть зону/цепь/молекулу » (дополнительный рисунок 22C и дополнительный рисунок 22D).
2. Уточнение структуры – уточнение только нейтронных данных
   1. Подготовка структуры
      1. Откройте Phenix и выберите «Молекулярная замена» и выберите «Phaser-MR (полнофункциональный)», чтобы получить фазу масштабированных интенсивностей, предоставленных ученым-прибором путем молекулярной замены для генерации исходного файла координат в формате pdb. Введите начальную структуру pdb на вкладке «Ввод и общие параметры » и заполните параметры Ансамбли, содержимое ASU и Процедура поиска .
      2. Откройте Инструменты моделирования и выберите Инструменты PDB. Вставьте pdb-файл в качестве входного файла. Перейдите на вкладку Параметры и в разделе Удалить выделение атома выберите названия растворителя, лигандов, кофакторов и металлов. Это удаляет все молекулы воды, кофакторы, лиганды и ионы металлов для создания минимальной модели. Кроме того, установите флажок Удалить альтернативные конформеры из модели (дополнительный рисунок 23).
      3. Выберите Уточнение в Phenix и откройте ReadySet. Введите отредактированный файл координат pdb рядом с PDB-файлом. Выберите Добавить водород в модель, если он отсутствует , и выберите H/D на заменяемых участках, H в другом месте из раскрывающегося меню параметров нейтронной очистки (дополнительный рисунок 23).
   2. Уточнение структуры
      1. Откройте программу phenix.refine на вкладке Уточнение в Phenix. На вкладке Настройка введите PDB-файл, который был обработан с помощью ReadySet, в поле Входные файлы . В поле Входные файлы загрузите MTZ-файл из нейтронных данных и назначьте его как рентгеновские данные и X-ray R-free в столбце Тип данных , даже если это данные нейтронов. Конфигурация уточнения, настроенная на следующем шаге, будет использоваться для обработки файла отражения как нейтронных данных. Метки Space group и Data будут автоматически заполняться после загрузки данных (дополнительный рисунок 24A).
      2. На вкладке Настройка в параметрах Уточнения сохраните стандартную стратегию уточнения. Увеличьте количество циклов до пяти. В разделе Другие параметры выберите нейтрон в раскрывающемся меню Таблица рассеяния . Снимите флажок Обновить воды (дополнительный рисунок 24B).
      3. Выберите Все параметры>Расширенные>Водороды. В новом окне выберите Individual из выпадающего меню Модель уточнения водорода и отключите Force riding adp (Дополнительный рисунок 20).
      4. Выберите Все параметры > Параметры поиска… выбор. Найдите слово ядерный и выберите Использовать ядерные расстояния для X-H/D (дополнительный рисунок 20).
      5. Выберите Выполнить , чтобы инициировать уточнение.
         ПРИМЕЧАНИЕ: После первоначальной доработки необходимо будет визуально осмотреть карты SLD нейтронов и выполнить ручное построение модели в Coot. Может потребоваться вставить лиганды/кофакторы, присутствующие в модели. Последующие уточнения потребуют необходимого файла ограничений CIF для любых соответствующих лигандов, и они должны быть загружены на вкладке Configure (Настройка ) phenix.refine.
   3. Модельное строительство
      1. После уточнения в Phenix нажмите «Открыть в Coot» на вкладке «Результаты», чтобы визуализировать карты и структуру SLD нейтронов. Перейдите на вкладку Менеджер отображения и в разделе Карты щелкните Удалить карту, чтобы удалить карты 2FOFCWT и _FOFCWT (дополнительный рисунок 25). Нажмите на Файл > Открыть MTZ, mmCIF fcf или phs…. Выберите текущую папку уточнения и выберите MTZ-файл. Для опции Амплитуды и Фазы выберите данные 2FOFC WT_no_fill в раскрывающемся меню. Повторите это, щелкнув Файл > Открыть MTZ, mmCIF fcf или phs… и выберите данные FOFCWT в раскрывающемся меню для опции Амплитуды и Фазы. Откройте Display Manager и переключитесь на прокрутку для карты 2FOFC WT_no_fill затем прокрутите, чтобы уменьшить rmsd данных _2FOFC WT_no_fill до 1,00 (дополнительный рисунок 25). Переключите кнопку Прокрутка для карты _FOFCWT и прокрутите, чтобы уменьшить rmsd данных _FOFCWT до 3.00.
      2. Выполните визуальный осмотр структуры белка, чтобы определить, соответствует ли модель нейтронной карте SLD.
      3. Как описано в пункте 7.1.3.2, определить правильную ориентацию и заполненность H/D остатков и групп с заменяемыми H/D участками. Отрегулируйте положение остатков с помощью инструмента «Поворот перевода» и «Редактирование углов chi» (рисунок 6). При необходимости можно использовать Real Space Refine Zone . Исправление атомов D, которые взрываются от остатка вручную с помощью текстового редактора для вставки правильных координат атомов
         ПРИМЕЧАНИЕ: Зона уточнения реального пространства не оптимизирована для нейтронных карт SLD в Coot и может привести к нерегулярным длинам связи для атомов, связанных с D, называемых взрывающимися остатками (дополнительный рисунок 26). Предпочтительно вручную редактировать необходимые атомные координаты и избегать использования Real Space Refine Zone.
      4. Вставляйте и переориентируйте молекулы воды в соответствии с плотностью нейтронов. Чтобы добавить воды в Coot, выберите значок Поместить атом в указатель и выберите вставку молекулы воды (дополнительный рисунок 27A). По умолчанию Coot вставляет атом O в это положение.
      5. Чтобы добавить атомы D к атомам O вод, вставленных в Coot, используйте Phenix. Откройте меню Уточнение и нажмите ReadySet. Рядом с параметрами нейтронного уточнения выберите только опцию Добавить дейтерии в молекулы растворителя. Снимите флажок Добавить водород в модель, если он отсутствует (дополнительный рисунок 27B и дополнительный рисунок 27C).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Построение модели с использованием только нейтронных данных отличается от построения модели совместной рентгеновско-нейтронной структуры тем, что нет рентгеновских данных, способствующих уточнению координат позвоночника и более тяжелых атомов. При совместном уточнении карта электронной плотности первоначально используется для определения координат белковой магистрали и боковой цепи. Эта модель впоследствии используется при совместной уточнении рентгеновских/нейтронных данных, в которой ориентация и занятость атомов H/D выводится из карты нейтронных SLD. При уточнении только нейтронов вся структура выводится из анализа карт SLD нейтронов, требующих построения молекул воды, основы, боковых цепей и лигандов в дополнение к атомам H/D (рисунок 6). Отношение данных к параметрам является низким в уточнениях только по сравнению с нейтронными данными, и следует проявлять осторожность, чтобы не переусердствовать с данными.

Representative Results

Discussion

Кристаллография нейтронного белка является высокочувствительным методом для зондирования состояний протонирования и ориентации молекул воды в белках. Эта информация проливает свет на белковые каталитические механизмы, поскольку изменения в протонировании и взаимодействиях водородных связей часто занимают центральное место в химии ^{ферментов10}. Кристаллография нейтронного белка, хоть и информативная методика, имеет ряд факторов, которые следует учесть перед планированием проведения эксперимента по дифракции нейтронов, а именно:

1. Потребность в крупных кристаллах белка для сбора данных.
2. Рассеивающие свойства водорода и других элементов, таких как ионы металлов.
3. Ограничения в программном обеспечении для уточнения структуры и построения моделей при работе с дейтерированными образцами.

Кристаллография нейтронного белка является методом ограниченного потока. В отличие от наборов данных дифракции рентгеновских лучей, для наборов данных нейтронов ожидаются более высокие R-факторы и более низкая полнота, избыточность и отношение сигнал-шум из-за присущих методу ограничений (ограниченный поток, квази-Лауэ, более длинные волны). Сбор данных одного кадра обычно занимает 12–18 часов. Успех эксперимента в значительной степени зависит от размера и качества образца, причем кристаллы размером 0,1 ^мм3 часто являются минимальным ^{требованием3}. Нейтронная дифракция требует производства большого количества белка для создания кристаллизационных капель в диапазоне от 10 до 800 мкл. Минимальный объем для выращивания достаточно крупных кристаллов можно оценить с помощью калькулятора объема с учетом параметров кристалла и образца (https://neutrons.ornl.gov/imagine). Рост крупных кристаллов чаще всего осуществлялся путем диффузии ^пара3. Кристаллизация подвесных капель позволяет выращивать кристаллы в больших каплях в диапазоне от 10-25 мкл, в то время как более крупные капли в диапазоне до ~ 50 мкл могут быть настроены с использованием коммерчески доступного оборудования для сидячей ^{капли14,54}. Силиконизированные девятилуночные стеклянные пластины можно использовать для установки очень больших капель с объемом до 800 мкл. Эти стеклянные пластины помещаются в «сэндвич-боксы», коммерчески доступные от Hampton Research. Дальнейшие методы кристаллизации включают пакетную кристаллизацию, при которой предел размера капли диктуется сосудом. Эксперимент по периодической кристаллизации может варьироваться от микролитров до ^{миллилитров55}. Кристаллизация также может быть выполнена с использованием метода диализа, в котором белок уравновешивается с осадком через мембрану диализа или путем контрдиффузии вдоль градиента концентрации осадка или через пористую пробку, такую как агароза56,57. Посев предлагает еще одну альтернативу получению кристаллов нужного объема. Микро- и макропосев успешно применяются для роста крупных кристаллов, в том числе крупных кристаллов NcLPMO9D45. Некоторые знания о диаграмме фаз белка, включая влияние температуры на растворимость, помогают в большом росте кристаллов.

При планировании эксперимента по дифракции нейтронов необходима оптимизация препарата белка для максимизации отношения сигнал/шум при сборе дифракционных ^{данных7}. Чтобы обойти подавление плотности и высокое некогерентное рассеяние, вызванное атомами H, карты SLD нейтронов могут быть улучшены путем обмена атомов H на его изотоп D, который обладает положительной длиной когерентного рассеяния и низкой длиной некогерентного рассеяния. Для этого осуществляется парообмен гидрогенизированного кристалла белка против дейтерированного кристаллизационного буфера. Это обеспечивает H/D обмен молекул растворителя и лабильных, титруемых атомов H белка ^H23. Парообмен осуществляется путем монтажа гидрогенизированного кристалла в кварцевый капилляр с дейтерированными кристаллизационными буферными «заглушками» на основе _D2O и представляет собой эффективный, щадящий метод, который чаще всего применяется14,23,35. Обмен может занять несколько недель и предпочтительно требует, чтобы дейтерированный буфер часто менялся для обеспечения максимального обмена H/D. H/D обмен также может быть выполнен путем непосредственного замачивания кристалла в дейтерированном буфере. Чтобы избежать напряжения кристалла из-за воздействия _D2O, процесс замачивания следует выполнять постепенно, постепенно увеличивая соотношение _D2O: _H2O58. В дополнение к этому, кристаллизация гидрогенизированного белка также может быть выполнена в дейтерированном буфере для обмена H/D на лабильных участках ^H22,59. Следует, однако, отметить, что буфер на основе _D2O оказывает влияние на растворимость белка, требуя дальнейшей корректировки известных условий на основе H2O3,59. Было также замечено, что буферы на основе _D2O в некоторых случаях приводят к образованию кристаллов ^{меньшего размера59}. Полный обмен титруемых и связанных с углеродом атомов H на D может быть достигнут путем экспрессии белков в дейтерированных средах для получения пердоутерированного ^{образца20}. Полученные нейтронные карты SLD пердоутерированного образца будут значительно улучшены, больше не отображая подавление плотности гидрогенизированного образца. Это полезно при характеристике H/D, связанного в необменяемых участках в белке или кофакторе. Тем не менее, экспрессия пердойтерированного белка является как высокой по стоимости, так и низкой по ^{выходу60}. Центр структурной молекулярной биологии (CSMB) Национальной лаборатории Оук-Ридж (ORNL) предлагает механизм дейтерации для пользователей, стремящихся создать пердевтерированный образец (https://www.ornl.gov/facility/csmb). Пердойтерированная экспрессия обычно выполняется в биореакторе на шкале 1 л, получая ~50 мг очищенного ^белка61.

После сбора данных о дифракции нейтронов выполняется уточнение и построение интерактивной модели. Уточнение может быть выполнено с использованием нескольких пакетов программного обеспечения, включая phenix.refine, nCNS или SHELXL28,31,32,33. Пакет Phenix является наиболее часто используемым программным обеспечением для уточнения данных о дифракции нейтронов в сочетании с Coot, которое используется для ручного построения модели из нейтронных карт ^SLD34. Хотя и Phenix, и Coot позволяют обрабатывать данные о дифракции нейтронов, им могут не хватать определенных функций, необходимых для обработки особенностей, связанных с нейтронными данными и дейтерированными образцами. Например, Coot не содержит оптимизации геометрии для дейтерированных остатков, что может привести к осложнениям во время построения модели, поскольку функция «Real Space Refine» приводит к «взрывающимся» остаткам (дополнительный рисунок 26)⁶². Это может быть решено путем создания файлов ограничений для всех дейтерированных остатков. Однако это интенсивный процесс, и такие библиотеки в настоящее время не являются общедоступными. При выполнении доработок в Фениксе сменные H/D участки первоначально будут установлены на 0,50 заполняемости для H и D. По мере выполнения уточнений заполняемость H и D будет уточняться в соответствии с нейтронными картами SLD. Во время построения интерактивных моделей карты разной плотности _Fo-Fc очень информативны при оценке занятости H/D. Карты могут быть использованы для определения того, какие участки обладают высокой заполняемостью D, что особенно информативно на активном участке, где состояния протонирования каталитически ^{значимы63}. Однако неоднозначные ситуации возникают, когда H:D Заполняемость близка к 0.70:0.30, что приводит к полному подавлению сигнала в нейтронных SLD ^maps64. Следует также учитывать, что квази-лауэ нейтронные наборы данных часто имеют полноту около 80%, что ниже, чем обычно наблюдаемые ≥ 98% для данных рентгеновской дифракции. Поэтому при уточнении данных о дифракции нейтронов в Фениксе недостающие наблюдаемые амплитуды (_Fo) вычисляются из модели для заполнения списка отражений, что приводит к смещению модели. Чтобы учесть это потенциальное смещение, «no_fill» карты должны быть изучены во время интерактивного построения моделей, а не «заполненные» карты.

Пользователи могут выбрать совместное уточнение рентгеновских/нейтронных данных своей структуры или только уточнение нейтронных данных. Визуализация нейтронных карт SLD, особенно при более низком разрешении, может первоначально сбивать с толку, особенно для гидрогенизированного белка, в котором H все еще присутствует в необменяемых участках, несмотря на парообмен H/D. Это приводит к отмене карт плотности нейтронов, создавая впечатление прерывистых ^{карт65,66}. Сбор соответствующего набора рентгеновских данных выгодно дополняет эти отмены в совместном уточнении (рисунок 13A и рисунок 13B). Стратегия совместного уточнения обычно включает уточнение координат белковой магистрали по рентгеновским данным, в то время как данные нейтронной дифракции используются для уточнения положения и занятости атомов H/D в обменных ^{местах28}. Поскольку введение совместного заполнения H/D на обменных участках увеличивает количество уточняемых параметров, совместная доработка с рентгеновскими данными также увеличивает отношение данных к параметрам. Совместная очистка требует, чтобы соответствующий набор рентгеновских данных был собран при той же температуре на том же кристалле или кристалле, выращенном в тех же условиях. Для данных о нейтронной дифракции, собранных при комнатной температуре (300 К), соответствующий набор рентгеновских данных должен быть собран при комнатной температуре с использованием стратегии сбора данных с низкой дозой для ограничения радиационного ущерба. Пердойтерированные образцы, напротив, обеспечивают улучшенные и непрерывные нейтронные SLD-карты, поскольку они не обладают одинаковой величиной подавления сигнала H/D. Однако длина рассеяния нейтронов некоторых элементов, включая металлы и серу, делает их плохо видимыми на картах SLD нейтронов, даже если белок был пердойтерирован (рисунок 13C-F)¹⁸. Если металл нуждается в характеристике, лучше всего использовать рентгеновскую дифракцию в совместном уточнении или применять спектроскопические методы для дополнения дифракционных экспериментов. Уточнение данных только нейтронами часто выполняется, когда набор данных нейтронов имеет высокое разрешение или если использовался пердоутерированный белок. Кроме того, уточнение данных только на нейтронах особенно полезно, если изучается белок, высокочувствительный к радиационному повреждению, поскольку структура, полученная из рентгеновского излучения, может обладать радиационно-индуцированными артефактами. Если необходимо выполнить уточнение только нейтронных данных, необходимо выяснить, обладает ли соответствующий набор нейтронных данных достаточной полнотой и разрешением.

ORNL предлагает два средства для сбора данных о дифракции нейтронов: лучевую линию IMAGINE на HFIR, а также лучевую линию MaNDi на ^SNS36,67. Хотя оба прибора обеспечивают эффективные средства для сбора набора данных о дифракции нейтронов с использованием аналогичных принципов, каждый прибор имеет уникальные спецификации, которые следует учитывать при подаче заявки на время луча. IMAGINE собирает квази-Лауэ данные и оптимизирован для сбора данных о комнатной температуре кристаллов с единичными ячейками до ~100 Å. MaNDi может использоваться для сбора данных о комнатной температуре и криотемпературе с использованием сбора TOF-Laue на кристаллах с единичными ячейками до ~ 300 Å. Перед сбором полного набора данных на кристалле проводится тест для оценки качества полученной дифракционной картины, в которой кристалл подвергается воздействию пучка нейтронов в течение одного кадра. Если кристалл имеет достаточное качество, полный набор данных нейтронной дифракции будет собран, проиндексирован, интегрирован, масштабирован и объединен в процессе, аналогичном обработке рентгеновских данных. IMAGINE использует Lauegen и Lscale, а MaNDi использует пакет Mantid и использует трехмерную подгонку профиля48,50,51,68,69,70. Ученым, которые станут пользователями любого из этих объектов, будет предоставлен набор данных в формате MTZ или HKL для дальнейшего анализа.

Нейтронная дифракция является неразрушающим, высокочувствительным методом зондирования состояния протонации и взаимодействия водородных связей биологических макромолекул. Он особенно полезен для фоточувствительных белков и металлопротеинов. Перед проведением эксперимента необходимо принять во внимание несколько соображений, касающихся метода, а также обработки данных, однако результат дает результаты, которые могут дать ценное представление о каталитическом механизме интересующего белка. Кристаллография нейтронного белка дополняет вычислительные, структурные, биохимические и спектроскопические исследования, что делает ее ценным инструментом в наборе методов биолога, используемых для характеристики биологических макромолекул.

Materials

Absorbent Paper Points Size #30-#40, 60 mm length	DiaDent/DiaVet	218-292
Capillary wax	Hampton	HR4-328
CCP4		Version 7.0.077
Conical Centrifuge Tubes (15 mL)	Corning	CLS430790
Conical Centrifuge Tubes (50mL)	Corning	CLS430828
Coot		Version 0.8.9.2
CrystalCap ALS	Hampton	HR4-779
Curved-Tip Forceps	Mitegen	TW-CTF-1
Deuterium chloride solution, 35 wt. % in D2O, ≥99 atom % D	Sigma-Aldrich	543047
Deuterium oxide 99.9 atom % D	Sigma-Aldrich	151882
Dual Thickness MicroLoops 1000 µm	Mitegen	M5-L18SP-1000
FiveEasy pH meter F20-Std-Kit	Mettler Toledo	30266626
Foam Dewars Standard Vessel 800 ml	Spearlab	M-FD-800
Four Color Mounting Clay	Hampton	HR4-326
HEPES, BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (T),	Sigma-Aldrich	54457
High flux rotating anode X-ray diffractomemeter with EIGER 4M detector	Rigaku, Oxford Cryostream and Dectris	XtaLAB Synergy-R	Home source X-ray diffractometer
Magnetic Wand Straight	Mitegen	M-R-1013198
Microloader, tip for filling Femtotips and other glass microcapillaries (for research use only), 0.5 – 20 µL, 100 mm, light gray, 192 pcs. (2 racks × 96 pcs.)	Eppendorf	930001007
Microtubes volume 1.5 mL	Eppendorf	Z606340
Petri Dishes with Clear Lid 100 mm diameter	Fischerbrand	FB0875713
Phenix		Version 1.14-3260
Pin Tong 18 mm	Mitegen	M-R-1013196
Pipette Volume 0.1-2.5 μL	Eppendorf Research	Z683779
Pipette Volume 100-1000 μL	Eppendorf Research	Z683825
Pipette Volume 10-100 μL	Eppendorf Research	Z683809
Pipette Volume 20-200 μL	Eppendorf Research	Z683817
Poly(ethylene glycol) BioXtra, average mol wt 3,350, powder	Sigma-Aldrich	P4338
Quartz Capillary , 1.00 mm inner diameter, 80 mm length	Hampton	HR6-146	Thin-walled capillary
Research Stereomicroscope System	Olympus	SZX16
Reusable B3 (SSRL/SAM Style) Goniometer Bases	Mitegen	GB-B3-R
Round – Miniature Hollow Glass Tubing (VitroTubes) Clear Fused Quartz / 1.00 mm inner diameter, 100 mm length	VitroCom	CV1012	Thick-walled capillary
Sandwich Box with cover	Hampton	HR3-132
Siliconized 9 Well Glass Plate	Hampton	HR3-134
Sitting Drop Crystallization Plate (24 Big Well)	Mitegen	XQ-P-24S-A
Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99 atom % D	Sigma-Aldrich	176788
Thick Siliconized circle cover slides (22 mm x 0.96 mm)	Hampton	HR3-247
Universal Pipet Tips, 0.1 – 10 µL	VWR	76322-528
Universal Pipet Tips, 1 – 100 µL	VWR	76322-136
Universal Pipet Tips, 100 – 1000 µL	VWR	76322-154
Universal Pipet Tips, 20 – 200 µL	VWR	76322-150
Universal Pipet Tips, 1 – 20 µL	VWR	76322-134
Wax pen	Hampton	HR4-342