Method Article

Выделение фекальной (микро) РНК

DOI:

10.3791/61908

⸱

October 28th, 2020

 ,  , 
1Ann Romney Center for Neurologic Diseases, Department of Neurology, Partners Multiple Sclerosis Center, Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School, 2Evergrande Center for Immunologic Diseases, Harvard Medical School and Brigham and Women's Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол изолирует высококачественную общую РНК из образцов фекалий животных и людей. Коммерческий набор для изоляции миРНК используется со значительной адаптацией для выделения чистой РНК с оптимизированным количеством и качеством. Изоляты РНК хороши для большинства последующих анализов РНК, таких как секвенирование, микромассив и ОТ-ПЦР.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Становится ясно, что РНК существует в просвете кишечника и фекалиях у животных и человека. Протокол, описанный ниже, изолирует общую РНК, включая микроРНК, из фекальных образцов животных и людей. Цель состоит в том, чтобы изолировать общую РНК с высокой чистотой и количеством для последующих анализов, таких как секвенирование РНК, ОТ-ПЦР и микромассив. Преимуществами этого оптимизированного протокола при выделении миРНК являются возможности выделения высокоочищенных РНК-продуктов с описанными дополнительными этапами промывки, увеличенное количество РНК, полученной улучшенным методом при повторном суспензии образца, и важные советы по обеззараживанию. Одним из ограничений является невозможность обработки и очистки более крупной выборки более 200 мг, поскольку эти размеры выборки вызовут трудности в четком формировании интерфазы. Следовательно, большой размер выборки может загрязнить водную фазу, подлежащую извлечению, как описано в протоколе, органическими веществами, которые влияют на качество РНК, выделенной в конце. Тем не менее, изоляты РНК из образца до 200 мг достаточны для большинства последующих анализов.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внеклеточная РНК признается значимым фактором, опосредующим многие биологические процессы1. Внеклеточная РНК в кале была впервые зарегистрирована в 2008 году как маркер рака толстой кишки и активного язвенного колита2, и недавно она была выявлена как нормальный компонент просвета кишечника и кала и опосредует связь хозяина с микробом 3,4,5. Целью этого протокола выделения РНК является извлечение высококачественной внеклеточной РНК из образцов фекалий, собранных у животных и людей. Протокол был адаптирован из коммерческого компле....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все методы с участием исследуемых животных, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Бригама и Женской больницы Гарвардской медицинской школы.

Все методы, связанные с человеческими исследованиями, описанные здесь, соответствуют руководящим принципам, установленным Комитетом по исследованиям человека Партнеров.

1. Сбор образцов фекалий

  1. Автоклав или подготовьте стерильную и не содержащую нуклеазы микроцентрифужную трубку объемом 2 мл с винтовой крышкой для каждого животного субъекта в эксперименте.
    1. Для людей предоставьте соответству....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Репрезентативные РНК были выделены из образцов фекалий мышей 50 мг (2 гранулы фекалий мыши) и 100 мг образцов стула человека соответственно и элюированы в воде без нуклеазы объемом 50 мкл. Спектрофотометрический анализ концентрации позволяет выделить общее количество 49 мкг и 16 мкг РНК соответственно (табл. 1). Чистота РНК была высокой, о чем свидетельствует соотношение A260/A280 ~2,0 и отношение A260/A230 ~1,8 (таблица 1). Как сообщается3, большинство РНК в фека.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Важно использовать технику без РНКазы для предотвращения загрязнения РНКазы во время изоляции7. После центрифугирования и образования компактной интерфазы важно избегать межфазной, нижней фазы и загрязняющего вещества частиц, плавающего на вершине водной фазы при восстановлении водной фазы. Кроме того, добавляются два этапа промывки с 500 мкл и 250 мкл моющего раствора 2/3 для устранения загрязнений в фильтрующей мембране для оптимизации качества. Кроме того, не рекомендуется использовать исходный.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии соответствующих или существенных финансовых интересов, связанных с методом исследования, описанным в настоящем протоколе.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы получили техническую помощь от Центра биополимеров в Гарвардской медицинской школе для биоанализатора. Эта работа была поддержана исследовательским грантом Национального общества рассеянного склероза RG-1707-28516 (H.L.W. и S.L.).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Кислота-фенол: хлороформ, pH 4,5 (с IAA, 125:24:1)Thermo Fischer ScientificAM9720
DPBS, без кальция, без магнияThermo Fischer Scientific14190-144
Перчатки
Микроцентрифуга
mirVana miRNA Isolation KitThermo Fischer ScientificAM1561
Микроцентрифужные пробирки без нуклеазы (1,5 мл, 2 мл)
Вода без нуклеазы (не обработанная DEPC)Thermo Fischer ScientificAM9937
и наконечники для пипеток без нуклеазы (с фильтром)
Гомогенизатор PowerLyzer 24QIAGEN13155
РНКазаZap РНКаза Раствор для обеззараживанияThermo Fischer ScientificAM9780
Вихревой шейкер
Пипетка для пипеток

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Das, S., et al. The extracellular RNA communication consortium: Establishing foundational knowledge and technologies for extracellular RNA research. Cell. 177 (2), 231-242 (2019).
  2. Ahmed, F. E., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fecal RNA IsolationMicroRNA ExtractionAcid Phenol ChloroformRNA PurificationSample ResuspensionCentrifugation ProtocolFilter Cartridge WashNuclease Free WaterChip ElectrophoresisAbsorbance Ratio

Related Articles