Методическая статья

Выделение фекальной (микро) РНК

5.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61908

⸱

28 октября 2020 г.

 ,  , 
1Ann Romney Center for Neurologic Diseases, Department of Neurology, Partners Multiple Sclerosis Center, Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School, 2Evergrande Center for Immunologic Diseases, Harvard Medical School and Brigham and Women's Hospital

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол изолирует высококачественную общую РНК из образцов фекалий животных и людей. Коммерческий набор для изоляции миРНК используется со значительной адаптацией для выделения чистой РНК с оптимизированным количеством и качеством. Изоляты РНК хороши для большинства последующих анализов РНК, таких как секвенирование, микромассив и ОТ-ПЦР.

Аннотация

Становится ясно, что РНК существует в просвете кишечника и фекалиях у животных и человека. Протокол, описанный ниже, изолирует общую РНК, включая микроРНК, из фекальных образцов животных и людей. Цель состоит в том, чтобы изолировать общую РНК с высокой чистотой и количеством для последующих анализов, таких как секвенирование РНК, ОТ-ПЦР и микромассив. Преимуществами этого оптимизированного протокола при выделении миРНК являются возможности выделения высокоочищенных РНК-продуктов с описанными дополнительными этапами промывки, увеличенное количество РНК, полученной улучшенным методом при повторном суспензии образца, и важные советы по обеззараживанию. Одним из ограничений является невозможность обработки и очистки более крупной выборки более 200 мг, поскольку эти размеры выборки вызовут трудности в четком формировании интерфазы. Следовательно, большой размер выборки может загрязнить водную фазу, подлежащую извлечению, как описано в протоколе, органическими веществами, которые влияют на качество РНК, выделенной в конце. Тем не менее, изоляты РНК из образца до 200 мг достаточны для большинства последующих анализов.

Введение

Внеклеточная РНК признается значимым фактором, опосредующим многие биологические процессы1. Внеклеточная РНК в кале была впервые зарегистрирована в 2008 году как маркер рака толстой кишки и активного язвенного колита2, и недавно она была выявлена как нормальный компонент просвета кишечника и кала и опосредует связь хозяина с микробом 3,4,5. Целью этого протокола выделения РНК является извлечение высококачественной внеклеточной РНК из образцов фекалий, собранных у животных и людей. Протокол был адаптирован из коммерческого комплекта для изоляции миРНК. Полученная РНК используется для последующего анализа, такого как секвенирование РНК, ОТ-ПЦР и микромассив. Протокол включает в себя несколько важных и полезных советов по максимизации количества и качества РНК, обнаруженных в фекалиях животных и людей. Причиной разработки и оптимизации этого метода выделения РНК (в том числе микроРНК) является снижение микробной РНК в кале, ограничение переменных в научных исследованиях и анализ состава РНК в кишечнике без учета различных смешанных факторов и источников загрязнения. Следует отметить, что эта изоляция РНК минимизирует высвобождение РНК из живых клеток и живых микробов (клеточная РНК). Он фокусируется на внеклеточных РНК, которые были высвобождены клетками кишечника или приобретены при приеме пищи. В принципе, этот метод не подходит для исследований, где исследуется микробный транскриптом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все методы с участием исследуемых животных, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Бригама и Женской больницы Гарвардской медицинской школы.

Все методы, связанные с человеческими исследованиями, описанные здесь, соответствуют руководящим принципам, установленным Комитетом по исследованиям человека Партнеров.

1. Сбор образцов фекалий

  1. Автоклав или подготовьте стерильную и не содержащую нуклеазы микроцентрифужную трубку объемом 2 мл с винтовой крышкой для каждого животного субъекта в эксперименте.
    1. Для людей предоставьте соответствующее, не содержащее нуклеаз и стерильное устройство для сбора образцов стула для каждого субъекта.
  2. Соберите 25-100 мг (примерно 1-4 фекальные гранулы для образцов фекалий мышей) образцов фекалий от каждого животного субъекта в стерильной среде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Две или более фекальные гранулы (~50 мг или тяжелее) являются предпочтительными для получения РНК высочайшей чистоты.
    1. Используйте все необходимые средства индивидуальной защиты (СИЗ) и материалы, например: пару лабораторных перчаток, дезинфицирующий спрей и стерильное бумажное полотенце, чтобы стерилизовать рабочую зону, где размещен предмет исследования животных, чтобы избежать загрязнения образцов фекалий.
      1. Для людей проинструктируйте каждого субъекта исследования / коллекционера собрать 100-200 мг образцов стула в максимально стерильной среде. Используйте стандартную стерильную операцию и избегайте загрязнения образца стула.
  3. Соберите образцы фекалий от каждого животного непосредственно в микроцентрифужную трубку объемом 2 мл с винтовой крышкой, не касаясь каких-либо других поверхностей, чтобы избежать загрязнения.
    1. Для людей проинструктируйте каждого субъекта испражняться непосредственно в соответствующее устройство для сбора (например, набор для сбора стерильных образцов стула), чтобы избежать загрязнения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проинструктируйте субъекта избегать загрязнения поверхностями туалета, водой, мочой или любыми другими нестерильными поверхностями / предметами.
  4. Заморозьте образцы фекалий, собранные в микроцентрифужных пробирках 2 мл, непосредственно при -80 °C или поместите в ведро сухого льда для лучшего количества и качества РНК перед повторной суспензией кала, как описано в шагах ниже.
    1. Для образцов стула человека аликвотируйте каждый свежий образец по 200 мг в микроцентрифужные трубки объемом 2 мл с винтовыми колпачками и замораживайте их при -80 °C перед повторной суспензией кала, как описано ниже.
      1. Для хранения образцов стула не в микроцентрифужных трубках по 2 мл с винтовыми колпачками взвешивают и переносят по 100-200 мг каждого из замороженных образцов в отдельные микроцентрифужные трубки по 2 мл с винтовыми колпачками перед повторной суспензией кала, как описано ниже.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для образцов стула человека избегайте приема более 200 мг образцов стула для выделения РНК, так как это может вызвать трудности на следующих этапах. При перегруженном образце в микроцентрифужной пробирке объемом 2 мл водная фаза, органическая фаза и интерфаза не могут быть четко сформированы и разделены. Здесь процедура может быть приостановлена.

2. Приготовления моющих растворов

  1. Добавьте 21 мл 100% этанола американского химического общества (ACS) в моющий раствор 1, поставляемый в комплекте для изоляции миРНК (см. Таблицу материалов), чтобы достичь окончательного объема 30 мл, как показано на флаконе. Вихрь до тех пор, пока все не растворится в бутылке.
  2. Добавьте 40 мл 100% этанола класса ACS в раствор для мытья 2/3, предоставленный для достижения конечного объема 50 мл, как показано на флаконе. Вихрь в течение 5 с или до тех пор, пока конечная смесь не будет хорошо перемешана.

3. Подготовка оборудования и материалов

  1. Распылите рабочую зону и оборудование, например: лабораторный стенд, рабочую зону в химическом вытяжном шкафу и стойки микроцентрифугных труб, раствором для обеззараживания рибонуклеазы (РНКазы) (например, коммерчески доступным раствором для обеззараживания РНКазы). Чтобы избежать загрязнения, наносите раствор для обеззараживания РНКазы на поверхности, где и когда это будет сочтено необходимым.
  2. Наденьте чистое лабораторное пальто, наденьте маску для лица и наденьте соответствующие лабораторные перчатки, чтобы защитить РНК в образцах фекалий от нуклеаз, присутствующих на коже человека. Распыляйте перчатки раствором для обеззараживания РНКазы и часто меняйте перчатки, чтобы избежать загрязнения.
  3. Подготовьте ведро сухого льда для образцов фекалий, хранящихся при -80 °C, чтобы предотвратить оттаивание перед повторной суспензией фекалий, и ведро льда для материалов, например: Кислота-Фенол: Хлороформ, для продления срока хранения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что материалы, включая среды, используемые в протоколе, являются стерильными без загрязнения нуклеазами.

4. Повторное суспендирование кала

  1. Повторное суспендирование 25-100 мг образцов фекалий в 600 мкл стерильного 1x фосфатно-буферного физиологического раствора Dulbecco (DPBS).
    ВНИМАНИЕ: Образцы фекалий должны быть обработаны немедленно при размораживании от -80 ° C даже без частичного оттаивания, чтобы свести к минимуму высвобождение РНК и клеточной РНК, поскольку кристаллы льда разрывают как внутренние, так и внешние клеточные компартменты, когда клетки в образце оттаивают.
    1. Добавьте 600 мкл 1x DPBS в микроцентрифужную трубку объемом 2 мл с винтовой крышкой, содержащей образцы фекалий при комнатной температуре (RT).
    2. Инкубируйте смесь образцов фекалий, погруженных в 600 мкл 1x DPBS в 2 мл микроцентрифужной трубки, закрытой в течение 30 мин при RT.
    3. Повторно суспендировать смесь путем затирания наконечником пипетки объемом 1 мл и вихревым колодцем с закрытой микроцентрифужной трубкой объемом 2 мл. Для оптимизации и увеличения количества и качества РНК повторно суспендируют смесь гомогенизатором с установкой на один цикл при S4000 (или 4000 об/мин) и 45 с.

5. Органическая экстракция

ВНИМАНИЕ: Используйте опасную химическую вытяжку для следующих этапов до Этапа 6 с использованием кислоты-фенола: хлороформ и 100% этанол класса ACS из-за их токсичности и воспламеняемости. Меняйте СИЗ по мере необходимости и соблюдайте надлежащие стандартные меры предосторожности при работе с опасными материалами.

  1. Экстракт РНК с 600 мкл кислоты-фенола: хлороформ (объем кислоты-фенола: требуемого хлороформа равен исходному объему добавленного 1x DPBS на стадии 4.1).
    1. Добавьте 600 мкл кислоты-фенола: хлороформа в суспензию из стадии 4.1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выводите кислоту-фенол: хлороформ из нижней фазы в бутылке, когда верхнюю фазу смешивают с водным буфером. Если интерфаза между этими двумя фазами нарушена, то подождите и выведите кислоту-фенол: хлороформ только тогда, когда интерфаза восстановится, чтобы избежать загрязнения.
  2. Вращайте смесь в течение 60 с, чтобы тщательно перемешать. Альтернативно, чтобы оптимизировать и увеличить количество РНК в выходе, смешивают с помощью гомогенизатора с установкой на один цикл при S4000 и 45 с.
  3. Центрифуга в течение 15 мин при 10 000 х г при РТ для разделения водной и органической фаз с помощью микроцентрифуги. После центрифугирования интерфаза должна быть компактной. Если нет, повторите центрифугирование.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если интерфаза не может быть такой компактной, как хотелось бы, возможно, из-за неравномерного отношения исходного объема к объему добавленного кислотно-фенольного: хлороформа после нескольких повторов центрифугирования, приступайте к восстановлению водной фазы с большей осторожностью, чтобы избежать загрязнения.
  4. Восстановить водную фазу и перенести ее в новую микроцентрифужную трубку объемом 2 мл с шарнирным колпачком (не предусмотрено комплектом изоляции миРНК).
    1. Аккуратно удалите водную (или верхнюю) фазу, не нарушая нижнюю фазу, и перенесите ее в новую микроцентрифужную трубку объемом 2 мл с шарнирным колпачком. Обратите внимание на передаваемый объем (например, ~500 мкл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Когда интерфаза компактна и верхняя фаза четко разделена, возможно, есть несколько крошечных остаточных частиц, плавающих в верхней части водной фазы. Пипетка осторожно избегает этих остатков и восстанавливает только видимо и четко отделенную водную фазу, чтобы обеспечить качественный выход РНК, даже если можно получить только небольшой объем водной фазы.

6. Окончательная изоляция РНК

  1. Добавьте 1,25 объема 100% этанола сорта RT ACS в водную фазу в микроцентрифужной трубке объемом 2 мл (например, добавьте 625 мкл 100% этанола, если 500 мкл водной фазы извлечено из стадии 5.4.). Вихрь 3 с.
  2. Загрузите смесь водной фазы и этанола через фильтрующий картридж, поставляемый в комплекте изоляции миРНК.
    1. Для каждого образца поместите картридж фильтра в одну из сборных пробирок, поставляемых в комплект.
      1. Пипетку и загрузите 600 мкл водно-фазно-этаноловой смеси в картридж фильтра.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Вихрь смеси ненадолго, чтобы тщательно перемешать этанол с водной фазой перед пипеткой. За один раз можно загрузить не более 700 мкл смеси водной фазы/этанола.
    2. Центрифуга при 10 000 х г в течение 90 с для фильтрации через смесь. Вращение с более высокой скоростью может повредить фильтр.
    3. Удалите фильтрат и повторяйте этапы 6.2.1-6.2.2 до тех пор, пока вся смесь не будет отфильтрована через одну и ту же фильтрующую мембрану при последовательных применениях. Сохраните и повторно используйте ту же коллекционную трубку для этапов стирки, приведенных ниже.
    4. Промыть фильтр 700 мкл раствора для промывки миРНК 1.
      ВНИМАНИЕ: Раствор для умывания миРНК 1 содержит гуанидин тиоцианат, который может вызвать раздражение кожи и серьезное повреждение глаз. Носите необходимые СИЗ, например: перчатки, лицевой щиток, защитное лабораторное пальто. Часто меняйте перчатки по мере необходимости.
      1. Нанесите 700 мкл промывочного раствора миРНК 1, рабочего раствора, приготовленного из 100% этанола класса ACS, в картридж фильтра.
      2. Центрифуга в течение 60 с для фильтрации раствора для промывки миРНК 1 через картридж фильтра.
      3. Выбросьте фильтрат из коллекторной трубки и поместите тот же фильтрующий картридж в ту же коллекторную трубку.
    5. Промывайте фильтр моющим раствором 2/3 один раз каждый с объемами 700 мкл, 500 мкл и 250 мкл последовательно.
      1. Нанесите 700 мкл промывочного раствора 2/3, рабочего раствора, приготовленного из 100% этанола класса ACS, в картридж фильтра.
        1. Центрифуга при 10 000 х г в течение 1 мин.
        2. Выбросьте фильтрат из коллекторной трубки и поместите тот же фильтрующий картридж в ту же коллекторную трубку.
      2. Нанесите 500 мкл моющего раствора 2/3 в картридж фильтра.
        1. Центрифуга при 10 000 х г в течение 1 мин.
        2. Выбросьте фильтрат из коллекторной трубки и поместите тот же фильтрующий картридж в ту же коллекторную трубку.
      3. Нанесите 250 мкл моющего раствора 2/3 в картридж фильтра.
        1. Центрифуга при 10 000 х г в течение 1 мин.
        2. Выбросьте фильтрат из коллекторной трубки.
      4. Переложите картридж фильтра в новую коллекторную трубку и вращайте узел в течение 5 минут, чтобы удалить остаточную жидкость из фильтра.

7. Элютная РНК с водой без нуклеазы 50 мкл

  1. Перенесите картридж фильтра в новую коллекторную трубку. Пипетка 50 мкл безнуклеазной воды к центру фильтра и крышке коллекторной трубки.
    1. Инкубировать в RT в течение 10 мин.
    2. Вращайтесь в течение 5 мин при 8000 х г , чтобы восстановить РНК в новой коллекционной трубке.
    3. Определить концентрацию и чистоту восстановленной фекальной РНК с помощью флуорометра. Восстановленная фекальная РНК может храниться при -80 °C.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Репрезентативные РНК были выделены из образцов фекалий мышей 50 мг (2 гранулы фекалий мыши) и 100 мг образцов стула человека соответственно и элюированы в воде без нуклеазы объемом 50 мкл. Спектрофотометрический анализ концентрации позволяет выделить общее количество 49 мкг и 16 мкг РНК соответственно (табл. 1). Чистота РНК была высокой, о чем свидетельствует соотношение A260/A280 ~2,0 и отношение A260/A230 ~1,8 (таблица 1). Как сообщается3, большинство РНК в фека...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Важно использовать технику без РНКазы для предотвращения загрязнения РНКазы во время изоляции7. После центрифугирования и образования компактной интерфазы важно избегать межфазной, нижней фазы и загрязняющего вещества частиц, плавающего на вершине водной фазы при восстановлении водной фазы. Кроме того, добавляются два этапа промывки с 500 мкл и 250 мкл моющего раствора 2/3 для устранения загрязнений в фильтрующей мембране для оптимизации качества. Кроме того, не рекомендуется использовать исходный...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии соответствующих или существенных финансовых интересов, связанных с методом исследования, описанным в настоящем протоколе.

Благодарности

Мы получили техническую помощь от Центра биополимеров в Гарвардской медицинской школе для биоанализатора. Эта работа была поддержана исследовательским грантом Национального общества рассеянного склероза RG-1707-28516 (H.L.W. и S.L.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Кислота-фенол: хлороформ, pH 4,5 (с IAA, 125:24:1)Thermo Fischer ScientificAM9720
DPBS, без кальция, без магнияThermo Fischer Scientific14190-144
Перчатки
Микроцентрифуга
mirVana miRNA Isolation KitThermo Fischer ScientificAM1561
Микроцентрифужные пробирки без нуклеазы (1,5 мл, 2 мл)
Вода без нуклеазы (не обработанная DEPC)Thermo Fischer ScientificAM9937
и наконечники для пипеток без нуклеазы (с фильтром)
Гомогенизатор PowerLyzer 24QIAGEN13155
РНКазаZap РНКаза Раствор для обеззараживанияThermo Fischer ScientificAM9780
Вихревой шейкер
Пипетка для пипеток

Ссылки

  1. Das, S., et al. The extracellular RNA communication consortium: Establishing foundational knowledge and technologies for extracellular RNA research. Cell. 177 (2), 231-242 (2019).
  2. Ahmed, F. E., et al. Diagnostic microRNA markers for screening sporadic human colon cancer and active ulcerative colitis in stool and tissue. Cancer Genomics & Proteomics. 6 (5), 281-295 (2009).
  3. Liu, S., et al. The host shapes the gut microbiota via fecal microRNA. Cell Host & Microbe. 19 (1), 32-43 (2016).
  4. Viennois, E., et al. Host-derived fecal microRNAs can indicate gut microbiota healthiness and ability to induce inflammation. Theranostics. 9 (15), 4542-4557 (2019).
  5. Liu, S., et al. Oral administration of miR-30d from feces of MS patients suppresses MS-like symptoms in mice by expanding Akkermansia muciniphila. Cell Host & Microbe. 26 (6), 779-794 (2019).
  6. Masotti, A., et al. Quantification of small non-coding RNAs allows an accurate comparison of miRNA expression profiles. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2009, 659028(2009).
  7. Green, M. R., Sambrook, J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (2), 101857(2019).
  8. Franzosa, E. A., et al. Relating the metatranscriptome and metagenome of the human gut. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (22), 2329-2338 (2014).
  9. Wohnhaas, C. T., et al. Fecal microRNAs show promise as noninvasive Crohn's disease biomarkers. Crohn's & Colitis. 2 (1), 003(2020).
  10. Tomkovich, S., et al. Human colon mucosal biofilms and murine host communicate via altered mRNA and microRNA expression during cancer. mSystems. 5 (1), (2020).
  11. Tarallo, S., et al. Altered fecal small RNA profiles in colorectal cancer reflect gut microbiome composition in stool samples. mSystems. 4 (5), 70(2019).
  12. Xing, S., et al. Breed differences in the expression levels of gga-miR-222a in laying hens influenced H2S production by regulating methionine synthase genes in gut bacteria. Research Square. , (2020).
  13. Teng, Y., et al. Plant-derived exosomal microRNAs shape the gut microbiota. Cell Host & Microbe. 24 (5), 637-652 (2018).
  14. Moloney, G. M., Viola, M. F., Hoban, A. E., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Faecal microRNAs: indicators of imbalance at the host-microbe interface. Beneficial Microbes. , 1-10 (2017).
  15. Giannoukos, G., et al. Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes. Genome Biology. 13 (3), 23(2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи