В этом исследовании мы представляем протокол дифференциации нервных стволовых клеток и клеток-предшественников (NPC), индуцированных только стимуляцией импульса прямого тока (DC) в микрофлюидной системе.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Электро-поле индуцированной нейронной дифференциации клеток-предшественников в микрофлюидных устройств
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Физиологические электрические поля (EF) играют жизненно важную роль в миграции клеток, дифференциации, деление и смерть. В этой статье описывается система микрофлюидной клеточной культуры, которая использовалась для долгосрочного исследования дифференциации клеток с использованием микроскопии. Микрофлюидная система состоит из следующих основных компонентов: оптически прозрачный электротактический чип, прозрачный иллюминатор олова (ITO), культурный медиа-заправочный насос, электроприбор, высокочастотный усилитель мощности, мультиплексер EF, программируемый моторизованный электроприбор X-Y-Я и перевернутый фазово-контрастный микроскоп, оснащенный цифровой камерой. Микрофлюидная система полезна для упрощения общей экспериментальной установки и, в свою очередь, реагента и потребления образцов. Эта работа включает в себя дифференциацию нервных стволовых клеток и клеток-предшественников (NPC), индуцированных стимуляцией импульса прямого тока (DC). В среде обслуживания стволовых клеток, мышь NPC (mNPCs) дифференцированы в нейроны, астроциты и олигодендроциты после стимуляции пульса DC. Результаты показывают, что простое лечение пульса DC может контролировать судьбу mNPCs и может быть использован для разработки терапевтических стратегий для расстройства нервной системы. Система может быть использована для клеточной культуры в нескольких каналах, для долгосрочной стимуляции EF, для клеточного морфологического наблюдения, и для автоматического приобретения изображений замедленного действия. Эта микрофлюидная система не только сокращает необходимое экспериментальное время, но и повышает точность управления микроокниронией.
Введение
Нейронные клетки-предшественники (NPC, также известный как нервные стволовые клетки и клетки-предшественники) может быть в качестве перспективного кандидата для нейродегенеративной терапевтическойстратегии 1. Недифференцированные NPC имеют способность к самообна роуклюре, мульти-потенции и пролиферативнойспособности 2,3. Предыдущее исследование сообщило, что внеклеточная матрица и молекулярные посредники регулируют дифференциацию NPC. Эпидермальный фактор роста (EGF) и основной фактор роста фибробластов (bFGF) способствуют распространению NPC, тем самым сохраняя недифференцированное
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Проектирование и изготовление чипа МЧС
- Нарисуйте шаблоны для отдельных слоев полиметилметилата (PMMA) и двустороннюю ленту с использованиемсоответствующего программного обеспечения (рисунок 1A, Таблица материалов). Вырезать как PMMA листов и двусторонняя лента с CO2 лазерной машины писец (Рисунок 1B).
- Включите лазерныйписец CO 2 и подключите его к персониного компьютера. Откройте разработанный файл шаблона с помощью программного обеспечения.
- Поместите листы PMMA (275 мм х 400 мм) или двустороннюю ленту (210 мм х 297 мм) на платформу лазерн....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Подробная конфигурация чипа МЧС показана на рисунке 1. Микрофлюидный чип обеспечивает полезный подход для уменьшения размера экспериментальной установки, объема выборки и объема реагентов. Чип MOE был разработан для проведения трех независимых экспериментов по стимуляции EF и нескольких иммуностетенгенных состояний одновременно в одном исследовании(рисунок 3). Кроме того, чип МЧС, который имеет высокую оптическую прозрачность, по.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Во время изготовления чипа МЧС адаптеры прикрепляются к слою 1 чипа МЧС с быстро действующим цианоакрилатом. Клей наносится на 4 угла адаптеров, а затем равномерно наносится на адаптеры. Избыточного количества клея следует избегать, чтобы обеспечить полную полимеризацию клея. Кроме того, завершенная сборка чипов МЧС инкубируется в вакуумной камере. Этот шаг помогает удалить пузырьки между слоем PMMA, двусторонняя лента, и крышка стекла.
Выбор электродного материала основан на том факте, что ио.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторов нечего раскрывать.
Благодарности
Авторы благодарят профессора Тан К. Тан, Институт биомедицинских наук, Академия Sinica, за его помощь в обеспечении мыши нервных стволовых и прародителя клеток (mNPCs). Авторы также благодарят профессора Тан К. Тан и г-жу Ин-Шан Ли за их ценную дискуссию о дифференциации мНПЦ.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Подложки из ПММА 1 мм (Слои 1-3) | BHT | K2R20 | Полиметилметакрилат (ПММА), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html |
| пластиковая трубка 15 мл | Protech Technology Enterprise Co., Ltd | CT-15-PL-TW | Трубка с коническим дном и колпачком, собранная, предварительно стерилизованный |
| шприц 3 мл | TERUMO | DVR-3413 | Шприцы для полости рта 3 мл, без иглы |
| 3 мм оптический класс ПММА (слой 5) | CHI MEI Corporation | ACRYPOLY PMMA Лист | оптического класса ПММА |
| 3-ходовой запорный кран | NIPRO | NCN-3L | Стерильный одноразовый 3-ходовой запорный кран |
| 5 мл 5 мл шприц | для | перорального применения, 5 мл пероральные шприцы, без иглы | |
| Адаптер | Dong Zhong Co., Ltd. | Индивидуальный | адаптер из ПММА |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | Agarose, низкая температура гелеобразования |
| Усилитель | A.A. Lab Systems Ltd | A-304 | Высоковольтный усилитель |
| AutoCAD программное обеспечение | Autodesk | Учебная версия | Составление |
| B-27 добавка | Gibco | 12587-010 | B-27 добавка (50x), минус витамин А |
| Основной фактор роста фибробластов (bFGF) | Peprotech | AF-100-18B | Также называется рекомбинантным человеческим FGF-basic |
| Black rubber bung | TERUMO | DVR-3413 | Из 3 мл пероральных шприцев, без иглы |
| Бычий сывороточный альбумин (BSA) | Sigma-Aldrich | B4287 | Блокирующий реагент |
| Центрифуга | HSIANGTAI | CV2060 | Центрифуга |
| CO2 лазерный регистратор | Laser Tools and Technics Corp. | ILS-II | Приобретен у http://www.lttcorp.com/index.htm |
| конусный разъем | IDEX Health & Science | F-120X | Цельный плотный 10-32 конусный, для 1/16" OD |
| натуральный конус-адаптер Люэра | IDEX Health & Science | P-659 | Luer Adapter 10-32 Female to female Luer, PEEK |
| Конфокальный флуоресцентный микроскоп | Leica | Microsystems TCS SP5 | Leica TCS SP5 руководство пользователя, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf |
| Цифровой фотоаппарат | OLYMPUS | E-330 | Автоматический цейтраферный сбор изображений |
| Цифровой осциллограф | Tektronix | TDS2024 | Измерение сигналов напряжения или тока с течением времени в электронной цепи или компоненте для отображения амплитуды и частоты. |
| Двухсторонний скотч | 3M | ПЭТ 8018 | Куплен у http://en.thd.com.tw/ |
| Dulbecco' s модифицированный Eagle' Питательная смесь F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 12400024 | DMEM/F-12, порошок, HEPES |
| Фосфатно-солевой буфер Dulbecco (DPBS) | Gibco | 21600010 | DPBS, порошок, без кальция, без магния |
| EF мультиплексор | Asiatic Sky Co., Ltd. | Настраиваемый | Мониторинг и управление электрическим током в отдельных каналах |
| Эпидермальный фактор роста (ЭФР) | Peprotech | AF-100-15 | Также называется рекомбинантным человеческим ЭГР |
| Быстродействующий цианоакрилатный клей | 3M | 7004T | Прочность мгновенный клей (жидкий) |
| Соединитель с плоским дном | IDEX Health & Science | P-206 | Бесфланцевая гайка с наружной резьбой Delrin, 1/4-28 плоскодонная, для 1/16" OD синего |
| Функциональный генератор | Agilent Technologies | 33120A | Высокопроизводительный 15 МГц синтезированный Генератор функций со встроенной функцией сигнала произвольной формы |
| Goat anti-mouse IgG H& L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150117 | Козий антимышиный IgG H& L (Alexa Fluor 488) предадсорбированный |
| козий антикролиацкий IgG H& L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150086 | Поликлональное вторичное антитело козы к кроличьему IgG - H& L (Alexa Fluor 555), предадсорбированный |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Ядерное окрашивание |
| Программное обеспечение ImageJ Национальные | институты здравоохранения | 1.48v | Анализируйте флуоресцентные изображения |
| Индий– жесть– оксидное стекло (ITO) Merck | 300739 | Для нагревателя ITO | |
| Инвертированный фазово-контрастный микроскоп | OLYMPUS | CKX41 | Для наблюдения за морфологией клетки |
| Термопара K-типа | Tecpel | TPK-02A | Температура термопары |
| адаптер Luer | IDEX Health & Science | P618-01 | Адаптер Люэра женский на 1/4-28 мужской полипропиленовый |
| шприц замка Люэра | TERUMO | DVR-3413 | Для агаровых соляных мостиков |
| мыши анти-GFAP | eBioscience | 14-9892 | Маркер астроцитов |
| Олигодендроцит Маркер О4 антитела | R& D Systems | MAB1326 | маркер олигодендроцитов |
| параформальдегид (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixing |
| Агент Фосфатно-солевой буфер (PBS) | Basic Life | BL2651 | Моющий раствор |
| Поли-L-лизин (PLL) | SIGMA | P4707 | Раствор покрытия |
| Прецизионная толщина защитных стекол No 1,5H | MARIENFELD | 107242 | https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html |
| Программируемая X-Y-Z моторизованная сцена | Tanlian Inc | Индивидуальный | Приобретен у http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm |
| Proportional– Интеграл&ндаш; производный (PID) контроллер | Toho Electronics | TTM-J4-R-AB | Регулятор температуры |
| Трубка из ПТФЭ | Professional Plastics Inc. Тайвань Наружный | диаметр 1/16 дюйма | Белая полупрозрачная трубка из ПТФЭ |
| Кролик анти-Tuj1 | Abcam | ab18207 | Нейронный маркер |
| Шприцевой насос | New Era Systems Inc | NE-1000 | NE-1000 программируемый насос для одного шприца |
| TFD4 моющее средство | FRANKLAB | TFD4 | Крышка для мытья стекол |
| Термический бондер | Компания Kuan-MIN Tech Co. | Индивидуальный | Приобретен у http://kmtco.com.tw/ |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Проникающий раствор |
| Ультразвуковой очиститель | LEO | LEO-300S | Ультразвуковой стери-очиститель |
| Вакуумная камера | DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd. | DOV-30 | Вакуумная сушильная печь |
| Белая пальчиковая пробка | IDEX Health & Наука | P-316 | 1/4-28 Плоскодонный, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html |
Ссылки
- Chang, H. F., Lee, Y. S., Tang, T. K., Cheng, J. Y. Pulsed DC electric field-induced differentiation of cortical neural precursor cells. PLoS One. 11 (6), e0158133(2016).
- Li, S., Li, H., Wang, Z. Orient....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Больше статей
Стимуляция импульсным постоянным токоммикрофлюидная система культивирования клетоксборка электротактического чипанаблюдение с помощью конфокальной микроскопиинейральные клетки-предшественники мышисреда для поддержания стволовых клетокмультиплексор электрического поляпрограммируемый моторизованный столик XYZнагреватель из оксида индия-олова
