Методическая статья

Электро-поле индуцированной нейронной дифференциации клеток-предшественников в микрофлюидных устройств

DOI:

10.3791/61917

⸱

14 апреля 2021 г.

 ,  , 
1Research Center for Applied Sciences, Academia Sinica, 2Institute of Biophotonics, National Yang Ming Chao Tung University, 3Department of Mechanical and Mechatronic Engineering, National Taiwan Ocean University, 4College of Engineering, Chang Gung University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании мы представляем протокол дифференциации нервных стволовых клеток и клеток-предшественников (NPC), индуцированных только стимуляцией импульса прямого тока (DC) в микрофлюидной системе.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Физиологические электрические поля (EF) играют жизненно важную роль в миграции клеток, дифференциации, деление и смерть. В этой статье описывается система микрофлюидной клеточной культуры, которая использовалась для долгосрочного исследования дифференциации клеток с использованием микроскопии. Микрофлюидная система состоит из следующих основных компонентов: оптически прозрачный электротактический чип, прозрачный иллюминатор олова (ITO), культурный медиа-заправочный насос, электроприбор, высокочастотный усилитель мощности, мультиплексер EF, программируемый моторизованный электроприбор X-Y-Я и перевернутый фазово-контрастный микроскоп, оснащенный цифровой камерой. Микрофлюидная система полезна для упрощения общей экспериментальной установки и, в свою очередь, реагента и потребления образцов. Эта работа включает в себя дифференциацию нервных стволовых клеток и клеток-предшественников (NPC), индуцированных стимуляцией импульса прямого тока (DC). В среде обслуживания стволовых клеток, мышь NPC (mNPCs) дифференцированы в нейроны, астроциты и олигодендроциты после стимуляции пульса DC. Результаты показывают, что простое лечение пульса DC может контролировать судьбу mNPCs и может быть использован для разработки терапевтических стратегий для расстройства нервной системы. Система может быть использована для клеточной культуры в нескольких каналах, для долгосрочной стимуляции EF, для клеточного морфологического наблюдения, и для автоматического приобретения изображений замедленного действия. Эта микрофлюидная система не только сокращает необходимое экспериментальное время, но и повышает точность управления микроокниронией.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нейронные клетки-предшественники (NPC, также известный как нервные стволовые клетки и клетки-предшественники) может быть в качестве перспективного кандидата для нейродегенеративной терапевтическойстратегии 1. Недифференцированные NPC имеют способность к самообна роуклюре, мульти-потенции и пролиферативнойспособности 2,3. Предыдущее исследование сообщило, что внеклеточная матрица и молекулярные посредники регулируют дифференциацию NPC. Эпидермальный фактор роста (EGF) и основной фактор роста фибробластов (bFGF) способствуют распространению NPC, тем самым сохраняя недифференцированноесостояние 4.

Предыдущие исследования сообщили, что электрическая стимуляция может регулировать клеточной физиологическойдеятельности, такие как разделение 5,миграция 6,7,8, дифференциация1,9,10, иклеточной смерти 11. Электрические поля (ЭФ) играют жизненно важную роль в развитии и регенерации развития центральнойнервной системы 12,13,14. С 2009 по 2019 год эта лаборатория исследовала клеточные реакции на применение ЭФ в микрофлюиднойсистеме 1,6,7,8,15,16,17. Многоканальный, оптически прозрачный, электротаксийный (MOE) чип был разработан, чтобы быть пригодным для иммунофлуоресценции окрашивания для конфокальной микроскопии. Чип имел высокую оптическую прозрачность и хорошую долговечность и позволил одновременно провести три независимых эксперимента стимуляции и несколько иммунолабилитных условий в одном исследовании. Микрофлюидная система полезна для упрощения общей экспериментальной установки и, в свою очередь, реагента и потребления образцов. В настоящем документе описывается развитие системы микрофлюидной клеточной культуры, которая использовалась для долгосрочного исследования дифференциации клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Проектирование и изготовление чипа МЧС

  1. Нарисуйте шаблоны для отдельных слоев полиметилметилата (PMMA) и двустороннюю ленту с использованиемсоответствующего программного обеспечения (рисунок 1A, Таблица материалов). Вырезать как PMMA листов и двусторонняя лента с CO2 лазерной машины писец (Рисунок 1B).
    1. Включите лазерныйписец CO 2 и подключите его к персониного компьютера. Откройте разработанный файл шаблона с помощью программного обеспечения.
    2. Поместите листы PMMA (275 мм х 400 мм) или двустороннюю ленту (210 мм х 297 мм) на платформу лазерного писца(рисунок 2A). Сосредоточьте лазер на поверхности листов PMMA или двустороннюю ленту с помощью инструмента автофокусировки.
    3. Выберите лазерный писец в качестве принтера, а затем "распечатайте" шаблон с помощью лазерного писца, чтобы начать прямую абляцию на листе PMMA или двустороннюю ленту и получить отдельные узоры на листе PMMA или ленте(рисунок 2B).
  2. Снимите защитную пленку с листов PMMA и очистите поверхность с помощью азотного газа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рисунок шаблона PMMA и прямая обработка листа PMMA были выполнены в соответствии с предыдущим докладом17.
  3. Для склеивания нескольких слоев листов PMMA сложите три куска 1 мм листов PMMA (Слои 1, 2 и 3) и свяжете их под давлением 5кг/см 2 в тепловом бондере в течение 30 минут при 110 градусах по Цельсию, чтобы сформировать сборку каналапотока/электрической стимуляции (рисунок 2C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Различные партии коммерчески полученного листа PMMA имеют несколько иную температуру перехода стекла (Tg). Оптимальная температура связи должна быть проверена на 5 градусов по Цельсию шагом близко к Tg.
  4. Придерживайтесь 12 частей адаптеров к отдельным отверстиям в слое 1 сборки чипов MOE с быстро действующим клеем цианоакрилата.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Адаптеры сделаны из PMMA путем инъекций литья. Плоские поверхности внизу для подключения к чипу МЧС. Адаптеры подшипника 1/4W-28 женский винт нить для подключения белых пальцев-жесткие пробки, плоские нижние разъемы, или адаптеры Luer. Будьте осторожны при использовании быстро действующего клея цианоакрилата. Избегайте брызг в глаза.
  5. Дезинфицировать 1 мм PMMA субстраты (слои 1-3), двусторонняя лента (слой 4), и 3 мм оптический класс PMMA (слой 5) с использованием ультрафиолетового (УФ) облучения в течение 30 минут перед сборкой чипа (Рисунок 1A).
  6. Придерживайтесь 1 мм субстратов PMMA (Layers 1-3) на 3 мм оптическом классе PMMA (слой 5) с двусторонним лентой (слой 4) для завершения сборки PMMA (Слои 1-5) (Рисунок 1A).
  7. Подготовь чистое стекло крышки для сборки на чипе.
    1. Заполните десятикратное разбавление моющего средства в окрашивание банку (см. таблицу материалов), и очистить крышку стекла в этом моющее средство с помощью ультразвукового очистителя в течение 15 минут.
    2. Тщательно промыть окрашивание банку под проточной водопроводной водой, чтобы удалить все следы моющего средства.
    3. Продолжить полоскания дистиллированной водой, чтобы удалить все следы водопроводной воды, и повторить шаг 1.7.2 два раза.
    4. Высушите очищенное стекло крышки, продув его азотным газом.
  8. Дезинфицировать сборку PMMA (Layers 1-5), двустороннюю ленту (слой 6) и стекло крышки (слой 7) с помощью УФ-облучения внутри шкафа биобезопасности в течение 30 минут перед сборкой чипа(рисунок 1A).
  9. Приклейте очищенное стекло крышки (слой 7) к сборке PMMA (Слои 1-5) с двусторонним лентой (слой 6) (Рисунок 1A).
  10. Инкубировать чип МЧС в вакуумной камере на ночь; использовать сборку чипов МЧС для последующих процедур(рисунок 3).

2. Покрытие поли-L-лизина (PLL) на субстрате в регионах клеточной культуры

  1. Подготовка политетрафторэтилен трубки, плоский нижний разъем, конус разъем, конус-Люер адаптер, белый палец-жесткий штепсельная вилка (также называемый пробкой), Luer адаптер, Luer замок шприц, и черный резиновый bung (Рисунок 4A, Таблица материалов). Стерилизовать все вышеперечисленные компоненты в автоклаве при 121 градусе по Цельсию в течение 30 минут.
  2. Печать отверстия агар моста адаптеры ( Рисунок1A) с белыми пальцами герметики пробки. Подключите разъем с плоским дном к сборке чипов MOE с помощью средних адаптеров входных и розетки(рисунок 4B). Подключите адаптер конуса-Люера к 3-путь стопкоукс.
  3. Добавьте 2 мл 0,01% PLL раствора с помощью 3 мл шприца, который подключается к 3-путь стопкок среднего входе(рисунок 4B- figure-protocol-1 ).
  4. Подключите пустой 3 мл шприца к 3-путь стопкок средней розетки(рисунок 4B- figure-protocol-2 ).
  5. Заполните регионы культуры клеток решением PLL. Вручную медленно перекачив раствор покрытия туда-сюда. Закройте два 3-путь stopcocks, чтобы запечатать решение внутри культуры регионов.
  6. Инкубировать чип МЧС при 37 градусов по Цельсию на ночь в инкубаторе заполнены 5% CO2 атмосферы.

3. Подготовка сети соляных мостов

  1. Следуя шагу 2.6, откройте два 3-путь stopcocks и смыть пузырьки в каналах вручную накачки покрытия раствор вперед и назад в канале с помощью двух шприцев.
  2. Нарисуйте 3 мл полной среды (среда обслуживания стволовых клеток, состоящая из модифицированной смеси Dulbecco's medium/Ham F-12 (DMEM/F12), 2% B-27 дополнения, 20 нг/мл EGF и 20 нг/мл bFGF) в шприц 3 мл, который соединяется с 3-путь стопкок среднего входе(рисунок 4B- figure-protocol-3 и рисунок 4B- figure-protocol-4 ).
  3. Добавьте 3 мл полной среды, чтобы заменить раствор покрытия в регионах клеточной культуры. Подключите пустой 5 мл шприц к 3-путь стопкок средней розетки(рисунок 4B- figure-protocol-5 ).
  4. Подготовка сети соляных мостов(рисунок 5).
    1. Вырезать черный каучук bung производить разрыв, и вставить серебро (Ag)/серебряный хлорид (AgCl) электроды через черный резиновый bung и в шприц блокировки Luer (Рисунок 4A).
    2. Замените белую палец на адаптер Luer и ввезу 3% горячей агарозы для заполнения адаптера Luer.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления горячей агарозы растворите 3 г порошка агарозы в 100 мл фосфатно-буферного солевого раствора (PBS) и стерилизовать в автоклаве при 121 градусе по Цельсию в течение 30 мин.
    3. Подключите шприц блокировки Luer к адаптеру Luer. Введать 3% горячей агарозы через черную резиновую bung для заполнения шприца luer блокировки с помощью шприца с иглой. Разрешить от 10 до 20 минут для агарозы, чтобы остыть и затвердеть.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы увеличить объемную емкость агарозы, шприц luer lock устанавливается на адаптер Luer(рисунок 4 и рисунок 5). Затем большие электроды вставляются в шприц блокировки Luer. Электрод способен обеспечить стабильную электрическую стимуляцию для долгосрочного эксперимента.

4. Подготовка мНПЦ

  1. Культура mNPCs1 в полной среде в колбе культуры клеток 25T при 37 градусов по Цельсию в инкубаторе, наполненном 5% CO2 атмосферы. Субкультура клеток каждые 3-4 дня, и выполнять все эксперименты с клетками, которые прошли 3-8 проходов из первоначального источника.
  2. Перенесите подвеску клетки в коническую трубку 15 мл и вращай нейросферы при 100 × в течение 5 минут. Аспирировать супернатант, и мыть нейросферы с 1x Dulbecco PBS (DPBS). Спин-вниз нейросферы на 100 × в течение 5 мин.
  3. Аспирировать 1x DPBS, а затем повторно нейросферы в полной среде. Тщательно и нежно перемешать.
  4. Добавьте 1 мл нейросферной подвески с помощью шприца 1 мл, который подключается к 3-й стопкок розетки(рисунок 4B- figure-protocol-6 ).

5. Настройка микрофлюидной системы для стимуляции пульса DC(рисунок 6)

  1. Установите чип MOE, посеянный на ячейке, на прозрачный обогреватель ITO, который крепится на программируемой моторизованной сцене X-Y-Я.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Температура поверхности ITO контролируется пропорционально-интегральным производным контроллером и поддерживается при температуре 37 градусов по Цельсию. Термокополь K-типа зажимается между чипом и нагревателем ITO для мониторинга температуры регионов клеточной культуры внутри чипа. Чип MOE установлен на программируемой моторизованной сцене X-Y-Я и подходит для автоматического получения изображений замедленного действия на отдельных участках канала. Изготовление обогревателя ITO и установка системы отопления культуры ячейки были описаны ранее18,19.
  2. Наполнить mNPCs ручной накачкой в чип МЧС через средний выход. Инкубировать сотовый чип МЧС на 37 C ITO нагреватель для 4 ч.
  3. После 4 ч, насос полной среды через чип МЧС через средний вход со скоростью потока 20 йл / ч с помощью шприца насоса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: MNPCs выращиваются и поддерживаются в чипе в течение дополнительных 24 ч до стимуляции EF, чтобы позволить вложение клеток и роста. Отходы жидкости собирается в пустой 5 мл шприц подключен к 3-путь стопкок розетки, показано, как "отходы" на рисунке 6A. Конфигурация микрофлюидной системы МЧС показана на рисунке 6. Эта микрофлюидная система обеспечивает непрерывную подачу питания в клетки. Полная свежая среда постоянно закачивается в чип MOE для поддержания постоянного значения рН. Таким образом, клетки могут быть откоуты вне инкубатора CO2.
  4. Используйте электрические провода для подключения мультиплексера EF к чипу MOE с помощью электродов Ag/AgCl на чипе. Подключите мультиплексер EF и генератор функций к усилителю для вывода импульсов квадратной волны DC с величиной 300 мВ/мм с частотой 100 Гц при 50% циклов службы (50% времени и 50% времени)(рисунок 6B).
    1. Подключите электрические провода к мультиплексеру EF. Подключите электрические провода к чипу МЧС с помощью электродов Ag/AgCl.
    2. Подключите мультиплексер EF к усилителю с помощью электрических проводов. Подключите генератор функций к усилителю и цифровому осциллоскопу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мультиплексер EF - это схема, которая включает в себя неуступность камеры культуры в цепи и соединяет все отдельные камеры в параллельной электронной сети. Каждая из трех культурных камер электрически соединена в последовательном с переменным резистором (Vr) и амметром (показан как ЗА на рисунке 6A)в мультиплексере. Электрический ток через каждую культурную камеру разливается, контролируя Vr, и ток отображается на соответствующем амметре. Сила электрического поля в каждом регионе клеточной культуры была рассчитана законом Ома, I qEA, где я электрический ток, σ (установлен как 1.38S'm -1 для DMEM/F1220) является электрической проводимостью среды культуры, E является электрическим полем, и A является поперечной областью электротаксической камеры. Для измерения региона клеточной культуры, показанного на рисунке 1,электрический ток составляет 87 мА и 44 мА для пульса постоянного тока и постоянного тока при 50% цикле службы, соответственно.
  5. Подай мНПЦ на квадратные импульсы постоянного тока с магнитудой 300 мВ/мм с частотой 100 Гц для 48ч. Непрерывно перекачивать полную среду со скоростью 10 йл/ч, чтобы обеспечить адекватное питание клеток и поддерживать постоянное значение рН в среде.

6. Иммунофлуоресценция анализы MNPCs после импульсной стимуляции DC

ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе, все реагенты перекачивается через средний вход с помощью шприца насоса.

  1. После 3, 7 или 14 дней в пробирке (DIV) культивированияпосле посева 1, мыть клетки с 1x PBS со скоростью потока 25 йл/мин в течение 20 мин.
  2. Исправить клетки с 4% параформальдегид (PFA). Насос 4% PFA в чип со скоростью потока 25 йл/мин в течение 20 минут, чтобы заменить 1x PBS. Чтобы заменить 4% PFA, мыть клетки с 1x PBS со скоростью потока 25 йл/мин в течение 20 мин.
  3. Насос 0,1% Triton X-100 в чип со скоростью потока 50 йл/мин в течение 6 минут, чтобы проницать клетки. Уменьшите скорость потока до 50 йл/ч еще на 30 минут, чтобы вступать в реакцию с клетками. Чтобы заменить 0,1% Triton X-100, мыть клетки с 1x PBS со скоростью потока 50 йл/мин в течение 6 мин.
  4. Блокируйте клетки с ПОМОЩЬю PBS, содержащего 1% бычьего альбумин сыворотки (BSA), чтобы уменьшить неспецифические связывания антител. Насос 1% BSA в чип со скоростью потока 50 йл/мин в течение 6 минут. Уменьшите скорость потока до 100 йл/ч и накачав на 1 ч.
  5. Накачать антитела для двойного иммуностея в чип со скоростью потока 50 йл/мин в течение 6 минут, и инкубировать чип для 18 ч при 4 градусов по Цельсию. Вымойте клетки с 1x PBS со скоростью потока 50 йл/мин в течение 15 мин.
  6. Насос Alexa Fluor-конъюгированных вторичных антител в чип со скоростью потока 50 йл/мин в течение 6 минут. Уменьшите скорость потока до 50 йл/ч и прокачавте антитела на 1 ч при комнатной температуре в темноте. Вымойте клетки с 1x PBS со скоростью потока 50 йл/мин в течение 15 мин.
  7. Для ядерного окрашивания, насос Hoechst 33342 в чип со скоростью потока 20 йл/мин в течение 10 минут при комнатной температуре в темноте. Вымойте клетки с 1x PBS со скоростью потока 50 йл/мин в течение 15 мин.
  8. После иммуностиммента наблюдайте за клетками с помощью конфокального флуоресцентных микроскопов.

7. Анализ изображений и обработка данных

  1. Анализ флуоресцентных изображений с помощью программного обеспечения со встроенными измерительными инструментами (см. таблицу материалов).
  2. Сравните ядра Hoechst-counterstained (общее количество клеток) в контрольных и лечебных группах и вычислите процент клеток, выражаюющих каждый фенотипический маркер.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Подробная конфигурация чипа МЧС показана на рисунке 1. Микрофлюидный чип обеспечивает полезный подход для уменьшения размера экспериментальной установки, объема выборки и объема реагентов. Чип MOE был разработан для проведения трех независимых экспериментов по стимуляции EF и нескольких иммуностетенгенных состояний одновременно в одном исследовании(рисунок 3). Кроме того, чип МЧС, который имеет высокую оптическую прозрачность, по...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Во время изготовления чипа МЧС адаптеры прикрепляются к слою 1 чипа МЧС с быстро действующим цианоакрилатом. Клей наносится на 4 угла адаптеров, а затем равномерно наносится на адаптеры. Избыточного количества клея следует избегать, чтобы обеспечить полную полимеризацию клея. Кроме того, завершенная сборка чипов МЧС инкубируется в вакуумной камере. Этот шаг помогает удалить пузырьки между слоем PMMA, двусторонняя лента, и крышка стекла.

Выбор электродного материала основан на том факте, что ио...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторов нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят профессора Тан К. Тан, Институт биомедицинских наук, Академия Sinica, за его помощь в обеспечении мыши нервных стволовых и прародителя клеток (mNPCs). Авторы также благодарят профессора Тан К. Тан и г-жу Ин-Шан Ли за их ценную дискуссию о дифференциации мНПЦ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Подложки из ПММА 1 мм (Слои 1-3)BHTK2R20Полиметилметакрилат (ПММА), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html
пластиковая трубка 15 млProtech Technology Enterprise Co., LtdCT-15-PL-TWТрубка с коническим дном и колпачком, собранная, предварительно стерилизованный
шприц 3 млTERUMODVR-3413Шприцы для полости рта 3 мл, без иглы
3 мм оптический класс ПММА (слой 5)CHI MEI CorporationACRYPOLY PMMA Листоптического класса ПММА
3-ходовой запорный кранNIPRONCN-3LСтерильный одноразовый 3-ходовой запорный кран
5 мл 5 мл шприцдляперорального применения, 5 мл пероральные шприцы, без иглы
АдаптерDong Zhong Co., Ltd.Индивидуальныйадаптер из ПММА
AgaroseSigma-AldrichA9414Agarose, низкая температура гелеобразования
УсилительA.A. Lab Systems LtdA-304Высоковольтный усилитель
AutoCAD программное обеспечениеAutodeskУчебная версияСоставление
B-27 добавкаGibco12587-010B-27 добавка (50x), минус витамин А
Основной фактор роста фибробластов (bFGF) PeprotechAF-100-18BТакже называется рекомбинантным человеческим FGF-basic
Black rubber bungTERUMODVR-3413Из 3 мл пероральных шприцев, без иглы
Бычий сывороточный альбумин (BSA)Sigma-AldrichB4287Блокирующий реагент 
ЦентрифугаHSIANGTAICV2060Центрифуга
CO2 лазерный регистраторLaser Tools and Technics Corp. ILS-IIПриобретен у http://www.lttcorp.com/index.htm
конусный разъемIDEX Health & ScienceF-120XЦельный плотный 10-32 конусный, для 1/16" OD
натуральный конус-адаптер ЛюэраIDEX Health & ScienceP-659Luer Adapter 10-32 Female to female Luer, PEEK
Конфокальный флуоресцентный микроскопLeicaMicrosystems TCS SP5Leica TCS SP5 руководство пользователя, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf
Цифровой фотоаппаратOLYMPUSE-330Автоматический цейтраферный сбор изображений
Цифровой осциллографTektronixTDS2024Измерение сигналов напряжения или тока с течением времени в электронной цепи или компоненте для отображения амплитуды и частоты.
Двухсторонний скотч3M ПЭТ 8018Куплен у http://en.thd.com.tw/
Dulbecco' s модифицированный Eagle' Питательная смесь F-12 (DMEM/F12)Gibco12400024DMEM/F-12, порошок, HEPES
Фосфатно-солевой буфер Dulbecco (DPBS)Gibco21600010DPBS, порошок, без кальция, без магния
EF мультиплексорAsiatic Sky Co., Ltd.НастраиваемыйМониторинг и управление электрическим током в отдельных каналах
Эпидермальный фактор роста (ЭФР)PeprotechAF-100-15Также называется рекомбинантным человеческим ЭГР
Быстродействующий цианоакрилатный клей3M 7004TПрочность мгновенный клей (жидкий)
Соединитель с плоским дномIDEX Health & ScienceP-206Бесфланцевая гайка с наружной резьбой Delrin, 1/4-28 плоскодонная, для 1/16" OD синего
Функциональный генераторAgilent Technologies33120AВысокопроизводительный 15 МГц синтезированный  Генератор функций  со встроенной функцией сигнала произвольной формы
Goat anti-mouse IgG H& L (Alexa Fluor 488)Abcamab150117Козий антимышиный IgG H& L (Alexa Fluor 488) предадсорбированный
козий антикролиацкий IgG H& L (Alexa Fluor 555)Abcamab150086Поликлональное вторичное антитело козы к кроличьему IgG - H& L (Alexa Fluor 555), предадсорбированный
Hoechst 33342InvitrogenH3570Ядерное окрашивание
Программное обеспечение ImageJ Национальныеинституты здравоохранения1.48vАнализируйте флуоресцентные изображения 
Индий– жесть– оксидное стекло (ITO) Merck300739Для нагревателя ITO
Инвертированный фазово-контрастный микроскопOLYMPUSCKX41Для наблюдения за морфологией клетки
Термопара K-типаTecpelTPK-02AТемпература  термопары
адаптер LuerIDEX Health & ScienceP618-01Адаптер Люэра женский на 1/4-28 мужской полипропиленовый
шприц замка ЛюэраTERUMODVR-3413Для агаровых соляных мостиков
мыши анти-GFAPeBioscience14-9892Маркер астроцитов
Олигодендроцит   Маркер  О4  антителаR& D SystemsMAB1326маркер олигодендроцитов
параформальдегид (PFA)Sigma-AldrichP6148Fixing 
Агент Фосфатно-солевой буфер (PBS)Basic LifeBL2651Моющий раствор
Поли-L-лизин (PLL)SIGMAP4707Раствор покрытия
Прецизионная толщина защитных стекол No 1,5HMARIENFELD107242https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html
Программируемая X-Y-Z моторизованная сценаTanlian IncИндивидуальныйПриобретен у http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm
Proportional– Интеграл&ндаш; производный (PID) контроллерToho ElectronicsTTM-J4-R-ABРегулятор температуры 
Трубка из ПТФЭProfessional Plastics Inc. Тайвань Наружныйдиаметр 1/16 дюймаБелая полупрозрачная трубка из ПТФЭ
Кролик анти-Tuj1Abcamab18207Нейронный маркер
Шприцевой насосNew Era Systems IncNE-1000NE-1000 программируемый насос для одного шприца
TFD4 моющее средствоFRANKLABTFD4Крышка для мытья стекол
Термический бондерКомпания Kuan-MIN Tech Co.ИндивидуальныйПриобретен у http://kmtco.com.tw/
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Проникающий раствор
Ультразвуковой очистительLEOLEO-300SУльтразвуковой стери-очиститель
Вакуумная камераDENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd.DOV-30Вакуумная сушильная печь
Белая пальчиковая пробкаIDEX Health & НаукаP-3161/4-28 Плоскодонный, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chang, H. F., Lee, Y. S., Tang, T. K., Cheng, J. Y. Pulsed DC electric field-induced differentiation of cortical neural precursor cells. PLoS One. 11 (6), e0158133(2016).
  2. Li, S., Li, H., Wang, Z. Orientation of spiral ganglion neurite extension in electrical fields of charge-balanced biphasic pulses and direct current in vitro. Hearing research. 267 (1-2), 111-118 (2010).
  3. Rajnicek, A. M., Robinson, K. R., McCaig, C. D. The direction of neurite growth in a weak DC electric field depends on the substratum: contributions of adhesivity and net surface charge. Developmental biology. 203 (2), 412-423 (1998).
  4. Kim, Y. H., et al. Differential regulation of proliferation and differentiation in neural precursor cells by the Jak pathway. Stem Cells. 28 (10), 1816-1828 (2010).
  5. Cunha, F., Rajnicek, A. M., McCaig, C. D. Electrical stimulation directs migration, enhances and orients cell division and upregulates the chemokine receptors CXCR4 and CXCR2 in endothelial cells. Journal of Vascular Research. 56 (1), 39-53 (2019).
  6. Chang, H. F., Cheng, H. T., Chen, H. Y., Yeung, W. K., Cheng, J. Y. Doxycycline inhibits electric field-induced migration of non-small cell lung cancer (NSCLC) cells. Scientific Reports. 9 (1), 8094(2019).
  7. Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6 (3), 34116(2012).
  8. Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosensors and Bioelectronics. 24 (12), 3510-3516 (2009).
  9. Jing, W., et al. Study of electrical stimulation with different electric-field intensities in the regulation of the differentiation of PC12 cells. American Chemical Society Chemical Neuroscience. 10 (1), 348-357 (2019).
  10. Guo, W., et al. Self-powered electrical stimulation for enhancing neural differentiation of mesenchymal stem cells on graphene-poly(3,4-ethylenedioxythiophene) hybrid microfibers. American Chemical Society Nano. 10 (5), 5086-5095 (2016).
  11. Manabe, M., Mie, M., Yanagida, Y., Aizawa, M., Kobatake, E. Combined effect of electrical stimulation and cisplatin in HeLa cell death. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 661-666 (2004).
  12. Liu, M., et al. Protective effect of moderate exogenous electric field stimulation on activating netrin-1/DCC expression against mechanical stretch-induced injury in spinal cord neurons. Neurotoxicity Research. 34 (2), 285-294 (2018).
  13. Haan, N., Song, B. Therapeutic application of electric fields in the injured nervous system. Advances in Wound Care. 3 (2), 156-165 (2014).
  14. Ariza, C. A., et al. The influence of electric fields on hippocampal neural progenitor cells. Stem Cell Reviews and Reports. 6 (4), 585-600 (2010).
  15. Huang, C. W., et al. Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field. PLoS One. 6 (10), e25928(2011).
  16. Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6 (1), 14102-14114 (2012).
  17. Hou, H. S., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis studies of lung cancer cells using a multichannel dual-electric-field microfluidic chip. Journal of Visualized Experiments. 106, e53340(2015).
  18. Cheng, J. Y., Yen, M. H., Hsu, W. C., Jhang, J. H., Young, T. H. ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter. Journal of Micromechanics and Microengineering. 17 (11), 2316-2323 (2007).
  19. Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2 (2), 24105(2008).
  20. Fuhr, G., Shirley, S. G. Cell handling and characterization using micron and submicron electrode arrays: state of the art and perspectives of semiconductor microtools. Journal of Micromechanics and Microengineering. 5 (2), 77-85 (1995).
  21. AChang, K. A., et al. Biphasic electrical currents stimulation promotes both proliferation and differentiation of fetal neural stem cells. PLoS One. 6 (4), e18738(2011).
  22. Lim, J. H., McCullen, S. D., Piedrahita, J. A., Loboa, E. G., Olby, N. J. Alternating current electric fields of varying frequencies: effects on proliferation and differentiation of porcine neural progenitor cells. Cell Reprogram. 15 (5), 405-412 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

XYZ

Похожие статьи