Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Функционализированный спироциклический гетероциклический синтез и анализ цитотоксичности

1.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61950

⸱

9 февраля 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology and Chemistry, Azusa Pacific University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы описываем биоанализ с использованием 3-(4',5'-диметилтиазол-2'-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (MTT) для тестирования ранее синтезированных спироциклических оксимов.

Аннотация

Спироциклические гетероциклы недавно были зарегистрированы в литературе как потенциальные лекарства для терапии рака. Синтез этих новых ортогональных кольцевых систем является сложной задачей. Недавно была опубликована эффективная методология синтеза этих соединений, которая описывала синтез твердой фазы в четыре этапа, а не ранее сообщенные пять этапов. Преимуществом такого более короткого синтеза является исключение использования токсичных реагентов. Было обнаружено, что смола на основе линкера с низкой нагрузкой Regenerating Michael (REM) имеет решающее значение в синтезе, поскольку версии с высокой нагрузкой предотвращают добавление реагентов, содержащих громоздкие фениловые и ароматические боковые цепи. Колориметрический анализ 3-(4',5'-диметилтиазол-2'-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ) был использован для изучения цитотоксичности микромолярных концентраций этих новых спироциклических молекул in vitro. MTT легко доступен в продаже и дает относительно быстрые и надежные результаты, что делает этот анализ идеальным для этих спироциклических гетероциклов. Были протестированы ортогональные кольцевые структуры, а также фурфуриламин (предшественник в методе синтеза, содержащий аналогичный 5-членный кольцевой мотив).

Введение

Известно, что низкомолекулярное ингибирование взаимодействия Е3 убиквитин-лигазы мышиным двухминутным гомологом 2 (MDM2) с р53 восстанавливает р53-опосредованную индукцию апоптоза опухолевых клеток 1,2,3. MDM2 является отрицательным регулятором пути p53 и часто чрезмерно экспрессируется в раковых клетках 4,5,6,7,8,9. Недавние кристаллографические и биохимические исследования показали, что малые молекулы, содержащие спироциклическую структуру, могут эффективно ингибировать взаимодействия MDM2-p5310. Спироциклическая структура (рисунок 1, закрашенный синим цветом) считается привилегированным мотивом, поскольку дериватизация этой жесткой ортогональной кольцевой системы привела к открытию новых терапевтических препаратов. Доступ к этой интересной архитектуре представляет собой проблему при использовании традиционных методов органического синтеза. Хотя терапевтические эффекты спироциклических молекул в биологических системах были исследованы, синтез этих молекул все еще является громоздким процессом. Нежелательные побочные продукты, использующие суровые условия, и опасные переходные металлы часто являются проблематичными.

Потенциальное использование спироциклического мотива в разработке лекарств привело к разработке протокола, использующего твердофазный синтез для создания библиотеки молекул с мотивом в дополнение к другим взаимозаменяемым функциональным группам11,12. Разделение продуктов и реагентов между стадиями может быть достигнуто простым использованием линкера REM, прикрепленного к смоляному шарику, и твердофазного фильтрующего сосуда. Это сократило бы шаги и потенциально увеличило бы урожайность. Этот синтетический подход может привести к появлению большого количества потенциальных кандидатов на лекарства. Однако эффективность этих молекул в биологической системе потребует дальнейшего изучения.

Для определения цитотоксичности этих спироциклических соединений был использован анализ МТТ13,14. Этот метод измеряет жизнеспособность клеток и может быть использован для косвенного определения цитотоксичности клеток. Различные концентрации ингибиторов добавляли к культивируемым клеткам в 96-луночной пластине, а долю живых клеток измеряли колориметрическим анализом степени восстановления желтого МТТ митохондриальными дегидрогеназами до соединения фиолетового формазана (рисунок 2). Активность чаще всего сообщается как значение IC50 - концентрация, при которой рост клеток ингибируется на 50% по сравнению с необработанным контролем. В этой статье описывается протокол анализа MTT и предварительные результаты этих новых спироциклических молекул.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые химические вещества и биологические реагенты, используемые в этом протоколе, являются токсичными и канцерогенными. Перед использованием ознакомьтесь с соответствующими паспортами безопасности материалов (MSDS). Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты (одобренные Управлением по безопасности и гигиене труда защитные очки, соответствующие перчатки, лабораторные халаты, брюки в полный рост и обувь с закрытым носком) до начала эксперимента. Кроме того, примите соответствующие методы безопасности при выполнении синтеза и обращении с токсичными химическими веществами и реагентами (вытяжной капюшон).

1. Твердофазный синтез спироциклических гетероциклов 6 и 7

ПРИМЕЧАНИЕ: Обобщение было основано на ранее опубликованной работе11,12. Обновленный протокол показывает, что тетрабутиламмоний фторид-катализируемое кольцевое открытие трициклического гетероцикла не было необходимым, и, таким образом, его выведение сокращает синтетическую процедуру.

  1. Выполните майкловское добавление фурфуриламина в ЛИНКЕР REM (продолжительность: 25 мин установки + 24 ч времени реакции).
    1. Добавьте 1 г (1 эквивалент [экв.]) смолы REM, 20 мл (20 экв.) диметилформамида (DMF) и 2,4 мл фурфуриламина в твердофазный реакционный сосуд объемом 25 мл. Перемешивают реакционный сосуд при комнатной температуре в течение 24 ч после начала реакции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте тщательное перемешивание, чтобы смола не сидела на дне сосуда.
    2. Промыть смолу DMF 1x после завершения реакции. Затем промыть 4 раза, чередуя дихлорметан (DCM) и метанол. Тщательно высушите смолу в реакционном сосуде после промывки.
  2. Выполняют тандемную добавку Михаила/1,3-диполярное циклоприсоединение (продолжительность: 25 мин установки + время реакции 48 ч).
    1. К сухой смоле добавляют 1,48 мл (5 экв.) триэтиламина (TEA), 0,637 г (2 экв.) нитроолефина и 10 мл сухого толуола в реакционный сосуд.
    2. Затем добавляют 1,085 мл (4 экв.) триметилсилилхлорида (TMSCl) в реакционный сосуд в хорошо вентилируемом вытяжном шкафу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку эта реакция производит газ HCl, не закрывайте реакционный сосуд до тех пор, пока газ не будет выпущен под дымовым капотом.
    3. Надежно закройте реакционный сосуд и перемешайте при комнатной температуре в течение 48 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте тщательное смешивание смолы с реагентами.
    4. Используйте 5 мл метанола для гашения реакции.
    5. Слейте сосуд, чтобы удалить раствор, а затем промыть 4 раза, чередуя DCM и метанол. Тщательно высушите смолу в реакционном сосуде после промывки.
  3. Выполняют N-алкилирование связанного со смолой гетероцикла с образованием четвертичного амина (продолжительность: 10 мин установки + время реакции 24 ч).
    1. К сухой смоле в реакционном сосуде добавляют 5 мл ДМФ и 10 экв. алкилгалогенида и перемешивают при комнатной температуре в течение 24 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте тщательное смешивание реагентов со смолой.
    2. Промыть смолу DMF 1x после завершения реакции. Затем используйте DCM и метанол поочередно для промывки 4x. Высушите смолу в реакционном сосуде после промывки.
  4. Выполняют β-элиминацию четвертичного амина для расщепления от полимерной опоры (продолжительность: 15 мин установки + время реакции 24 ч).
    1. К сухой смоле в реакционном сосуде добавляют 3 мл DCM и 1,49 мл (5 экв.) TEA для расщепления гетероцикла от полимерной основы.
    2. Перемешивают реакционную смесь в течение 24 ч, чтобы обеспечить тщательное перемешивание смолы с раствором. Промыть 4x, чередуя DCM и метанол. Соберите элюирование из всех промывок и сконцентрируйте с помощью ротационного испарения.
    3. Тритурат с метанолом для очистки спироциклического оксима. Тщательно высушите смолу в реакционном сосуде после промывки для повторного использования в будущих экспериментах.

2. Анализ цитотоксичности с использованием MTT 14

  1. Приготовьте 20 мл раствора МТТ 5 мг/мл, используя в качестве разбавителя стерильный фосфат-буферный физиологический раствор (PBS, 0,9% NaCl в воде). Фильтровать и хранить при -20 °C. Затем приготовьте 1:1 разведение раствора МТТ из стадии 2.1 в безсыворочной среде для культивирования клеток (DMEM).
  2. Готовят по 1 мл исходного раствора в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл 100 мМ, 10 мМ, 1 мМ, 100 мкМ, 10 мкМ, 1 мкМ, 0,1 мкМ и 0,01 мкМ исследуемых соединений в диметилсульфоксиде (ДМСО). Хранить при -20 °C. Готовят 200 мкл на дозу рабочих растворов исследуемых соединений путем разбавления исходных концентраций 1:1000 в безсыворочной среде в пробирках по 1,5 мл.
  3. В тканевом культуральном капюшоне семена клеток COS-7 (клетки почек африканской зеленой обезьяны, cercopithecus aethiops kidney) в полной среде [DMEM с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS)] на плоскодонные, обработанные культурой ткани 96-луночными пластинами в концентрации 4 × 103 клеток / 200 мкл на скважину с использованием многоканального пипеттора. Клетки COS-7 были выбраны, потому что (1) это обычно используемые клетки для анализа цитотоксичности и (2) они уже были доступны в учреждении.
  4. Инкубировать клетки COS-7 в течение 24 ч при 37 °C в атмосфере, содержащей 5% CO2.
  5. Аспирируйте супернатант из скважин с помощью стеклянной пипетки Пастера, прикрепленной к вакуумному насосу. Дозируйте клетки в трех экземплярах с исследуемыми соединениями с помощью рабочих растворов, приготовленных на стадии 2.2 (см. таблицу 1). Инкубировать клетки, как описано на этапе 2.4.
  6. Аспирировать супернатант из скважин. Добавьте 200 мкл раствора МТТ в каждую лунку. Инкубировать при 37 °C в атмосфере, содержащей 5% CO2 в течение 4 ч.
  7. Осторожно аспирируйте супернатант из лунок, не нарушая фиолетовых кристаллов формазана. Добавьте 200 мкл ДМСО в каждую лунку, чтобы растворить фиолетовые кристаллы формазана. Инкубировать при комнатной температуре в течение 15 мин.
  8. Измерьте поглощение при 590 нм14 или 600 нм для каждой скважины с помощью 96-луночного пластинчатого считывателя. Используйте скважины без ячеек в качестве фона и усредняйте значение поглощения. Вычтите усредненное фоновое значение абсорбции из значения поглощения каждой обработанной скважины. Нормализуйте данные в процентах от среднего значения нулевой дозировки (усредняйте три значения нулевой дозы). График данных по оси Y: линейный (% относительной жизнеспособности ячейки); ось x: log (концентрация). Построение каждого ряда в виде отдельной кривой (например, тройные данные должны иметь 3 кривые)

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Спироциклические оксимы 6 и 7 синтезировали с использованием модифицированного протокола (рисунок 1). Добавление Майклом фурфуриламина к линкеру REM 1b обеспечило полимерно-связанную смолу 2. Ход реакции контролировали с помощью инфракрасной (ИК) спектроскопии путем обнаружения исчезновения α,β-ненасыщенного эфира при 1722 см-1 (рисунок 3). Спироциклически связанную смолу 4 образовывали из 2 через переходный промежуточный продукт 3. Метаноловый гидрол...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Синтез спироциклических соединений был основан на предыдущих исследованиях, проведенных этой лабораторией, но с некоторыми модификациями (Рисунок 1)11,12. Ход каждой стадии реакции контролировался с помощью ИК-спектроскопии. Михаил добавил линкер REM 1 с фурфуриламином, имеющим полимер-связанный 2 (IR 1722 см-1 → 1731 см-1). Из предыдущего отчета...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа финансировалась за счет гранта Исследовательского совета факультета K.S.H. (Управление исследований и грантов, Тихоокеанский университет Азуса-США). A.N.G. и J.F.M. являются получателями стипендии Scholarly Undergraduate Research Experience (SURE). S.K.M. и B.M.R. являются получателями грантов STEM Research Fellowship Grants (Центр исследований в области науки, Тихоокеанский университет Азуса-США). Мы благодарны доктору Мэтью Березуку и доктору Филипу Коксу за руководство по биоанализам.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
CELLS
COS-7 клетки (ATCC CRL-1651)ATCCCRL-1651Клетки почек африканской зеленой марты
CHEMICALS>
1-бромоктанSigma-Aldrich152951алкилгалогенид
АллилбромидSigma-Aldrich337528Алкилгалогенид
бензилбромидSigma-AldrichB17905Алкилгалогенид
цисплатинCayman Chemical13119Контроль цитотоксичности
Дихлорметан (DCM)Sigma-Aldrich270997Растворитель
Диметилформамид (DMF)Sigma-Aldrich227056
Растворитель Диметилсульфоксид (DMSO)Sigma-Aldrich276855Растворитель
DMEM, с высоким содержанием глюкозы, с L-глутаминомGenesee Scientific25-500Клеточные питательные среды
FBS (фетальная бычья сыворотка)Sigma-AldrichF4135Клеточные питательные среды
ФурфуриламинAcros Organics119800050реагентом 
ЙодометанСигма-Олдрич289566алкилгалогенид
МетанолСигма-Альдрич34860Растворитель
МТТ ((3-(4,5-Диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид)EMD MilliporeCalbiochem 475989-1GMРеагент
Фосфатно-солевой буфер (PBS)Genesee Scientific25-507Среда для клеточных культур
REM СмолаNova Biochem8551010005Полимерная поддержка; 0,500 ммоль/г загрузка
trans-β-nitrostyreneSigma-AldrichN26806Нитроолефиновый реагент
ТолуолSigma-Aldrich244511растворитель
Триэтиламин (TEA)Sigma-AldrichT0886Реагент для бета-элиминации
Триметилсилилхлорид (TMSCl)Реагент Sigma-Aldrich386529; ОСТОРОЖНО - высокая летучесть; создает
>СТЕКЛЯННАЯ ПОСУДА/ПРИБОРЫ
25 мл твердофазный реакционный сосудChemglassCG-1861-02Стеклянная посуда с фильтром
96 Луночный планшетный ридерPromega (Turner Biosystems)9310-011Прибор
AVANCE III ЯМР СпектрометрBrukerN/AInstrument; 300 МГц; Растворители: CDCl3 и CD3OH
Thermo Scientific Nicole iS5Thermo ScientificIQLAADGAAGFAHDMAZAИнструмент
Запястный шейкерBurrell Scientific757950819инструмент

Ссылки

  1. Shangary, S., Wang, S. Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction to reactivate p53 function: a novel approach for cancer therapy. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 49, 223-241 (2009).
  2. Zhao, Y., Aguilar, A., Bernard, D., Wang, S. Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction (MDM2 inhibitors) in clinical trials for cancer treatment. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (3), 1038-1052 (2015).
  3. Paolo, T., et al. An effective virtual screening protocol to identify promising p53-MDM2 inhibitors. Journal of Chemical Information and Modeling. 56 (6), 1216-1227 (2016).
  4. Shieh, S. Y., Ikeda, M., Taya, Y., Prives, C. DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2. Cell. 91 (3), 325-334 (1997).
  5. Hwang, B. J., Ford, J. M., Hanawalt, P. C., Chu, G. Expression of the p48 xeroderma pigmentosum gene is p53 dependent and is involved in global genomic repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 424-428 (1999).
  6. Oliner, J. D. Oncoprotein MDM2 conceals the activation domain of tumor suppressor p53. Nature. 362, 857-860 (1993).
  7. Nag, S., Qin, J., Srivenugopal, K. S., Wang, M., Zhang, R. The MDM2-p53 pathway revisited. Journal of Biomedical Research. 27 (4), 254-271 (2013).
  8. Bond, G. L. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans. Cell. 119 (5), 591-602 (2004).
  9. Isobe, M., Emanuel, B. S., Givol, D., Oren, M., Croce, C. M. Localization of gene for human p53 tumor antigen to band 17p13. Nature. 320 (6057), 84-85 (1986).
  10. Gupta, A. K., Bharadwaj, M., Kumar, A., Mehrotra, R. Spiro-oxindoles as a promising class of small molecules inhibitors of p53-MDM2 interaction useful in targeted cancer therapy. Topics in Current Chemistry. 375 (1), 1-25 (2017).
  11. Griffin, S. A., Drisko, C. R., Huang, K. S. Tricyclic heterocycles as precursors to functionalized spirocyclic oximes. Tetrahedron Letters. 58, 4551-4553 (2017).
  12. Drisko, C. R., Griffin, S. A., Huang, K. S. Solid-phase synthesis of [4.4]spirocyclic oximes. Journal of Visualized Experiments. (144), e58508(2019).
  13. Lawrence, N. J. Linked parallel synthesis and MTT bioassay screening of substituted chalcones. Journal of Combinatorial Chemistry. 3 (5), 421-426 (2001).
  14. MTT assay protocol. , Modified procedure from . (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Функционализированный спироциклический гетероциклический синтез и анализ цитотоксичности
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.