Методическая статья

Генетическая модификация первичных пигментных эпителиальных клеток человека на основе электропорации с использованием транспозонной системы «Спящая красавица»

DOI:

10.3791/61987

⸱

4 февраля 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, University Hospital RWTH Aachen, 2Experimental Ophthalmology, University of Geneva, 3Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, 4Université de Paris, CNRS, INSERM, UTCBS, Unité des technologies Chimiques et Biologiques pour la Santé, 5Chimie ParisTech, PSL Research University, 6Max Delbrück Center for Molecular Medicine in the Helmholtz Association, 7Division of Medical Biotechnology, Paul-Ehrlich-Institute

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы разработали протокол для трансфекции первичных пигментных эпителиальных клеток человека путем электропорации с геном, кодирующим фактор, полученный из пигментного эпителия (PEDF), с использованием транспозонной системы Sleeping Beauty (SB). Успешная трансфекция была продемонстрирована количественной полимеразной цепной реакцией (qPCR), иммуноблоттингом и иммуноферментным анализом (ИФА).

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наше все более стареющее общество приводит к росту заболеваемости нейродегенеративными заболеваниями. До сих пор патологические механизмы недостаточно изучены, что препятствует установлению определенных методов лечения. Клеточная аддитивная генная терапия для повышения экспрессии защитного фактора рассматривается как перспективный вариант лечения нейродегенеративных заболеваний, таких как возрастная макулярная дегенерация (ВМД). Мы разработали метод стабильной экспрессии гена, кодирующего пигментный эпителий-производный фактор (PEDF), который характеризуется как нейропротекторный и антиангиогенный белок в нервной системе, в геном первичных пигментных эпителиальных (PE) клеток человека с использованием транспозонной системы Sleeping Beauty (SB). Первичные ПЭ-клетки были выделены из глаз донора человека и сохранены в культуре. После достижения слияния 1 х 104 клетки суспендировали в 11 мкл буфера ресуспензии и соединяли с 2 мкл очищенного раствора, содержащего 30 нг гиперактивной плазмиды транспозазы SB (SB100X) и 470 нг транспозонной плазмиды PEDF . Генетическую модификацию проводили с помощью капиллярной электропорационной системы с использованием следующих параметров: два импульса напряжением 1 100 В и шириной 20 мс. Трансфектированные клетки переносили в культуральные пластины, содержащие среду, дополненную фетальной бычьей сывороткой; антибиотики и антимикотики добавляли с первым средним обменом. Успешная трансфекция была продемонстрирована в самостоятельно проведенных экспериментах. Количественная полимеразная цепная реакция (qPCR) показала повышенную экспрессию трансгена PEDF . Секреция PEDF была значительно повышена и оставалась стабильной, что оценивалось иммуноблоттингом и количественно оценивалось с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). SB100X-опосредованный перенос позволил обеспечить стабильную интеграцию гена PEDF в геном клеток PE и обеспечил непрерывную секрецию PEDF, что имеет решающее значение для разработки клеточной генной аддитивной терапии для лечения ВМД или других дегенеративных заболеваний сетчатки. Более того, анализ профиля интеграции транспозона PEDF в клетки PE человека показал почти случайное геномное распределение.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пожилой возраст описывается как основной риск нейродегенеративных заболеваний. Возрастная макулярная дегенерация (ВМД), полигенное заболевание, приводящее к тяжелой потере зрения у пациентов старше 60 лет, относится к четырем наиболее распространенным причинам слепоты и нарушения зрения1 и, как ожидается, увеличится до 288 миллионов человек в 2040году 2. Дисфункции пигментного эпителия сетчатки (RPE), одного слоя плотно упакованных клеток, расположенных между хориокапиллярами и фоторецепторами сетчатки, способствуют патогенезу ВМД. RPE выполняет множество задач, которые необходимы для нормальной функции сетчатки3 , и выделяет различные факторы роста и факторы, необходимые для поддержания структурной целостности сетчатки и хориокапилляра, тем самым поддерживая выживание фоторецепторов и обеспечивая основу для циркуляции и снабжения питательными веществами.

В здоровых глазах фактор, полученный из пигментного эпителия (PEDF), отвечает за балансировку эффектов фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и защищает нейроны от апоптоза, предотвращает пролиферацию эндотелиальных клеток и стабилизирует капиллярный эндотелий. Смещенное отношение VEGF к PEDF связано с глазной неоваскуляризацией, которая наблюдалась на животных моделях 4,5, а также в образцах пациентов с хориоидальной неоваскуляризацией (CNV) из-за ВМД и пролиферативной диабетической ретинопатии 6,7,8,9,10 . Повышенная концентрация VEGF является мишенью для текущего стандартного лечения. Анти-VEGF фармацевтические препараты бевацизумаб, ранибизумаб, афлиберцепт и, совсем недавно, бролуцизумаб улучшают остроту зрения примерно у одной трети пациентов с ХНВ или, скорее, стабилизируют зрение в 90% случаев 11,12,13. Однако частые, часто ежемесячные, интравитреальные инъекции несут риск нежелательных явлений14, ухудшают соблюдение пациентами и представляют собой значительную экономическую нагрузку для систем здравоохранения15. Более того, определенный процент пациентов (2%-20%) не реагируют или только плохо реагируют на анти-VEGF терапию 16,17,18,19. Эти негативные сопутствующие факторы требуют разработки альтернативных методов лечения, например, внутриглазных имплантатов, клеточных и/или генных терапевтических подходов.

Генная терапия эволюционировала как перспективное лечение наследственных и ненаследственных заболеваний и направлена на восстановление нефункциональных последовательностей генов или подавление неисправных. Для полигенных заболеваний, где выявление и замена причинных факторов вряд ли возможны, стратегии направлены на непрерывную доставку защитного фактора. В случае ВМД были разработаны различные аддитивные методы лечения, такие как стабильная экспрессия эндостатина и ангиостатина20, антагонист VEGF растворимый fms-подобная тирозинкиназа-1 (sFLT-1)21,22, регуляторный белковый кластер комплемента дифференцировки 59 (CD59)23 или PEDF24,25 . Глаз, и особенно сетчатка, является отличной мишенью для генного лекарства из-за закрытой структуры, хорошей доступности, небольшого размера и иммунной привилегии, что позволяет локализовать доставку низких терапевтических доз и делает трансплантацию менее восприимчивой к отторжению. Кроме того, глаз обеспечивает неинвазивный мониторинг, а сетчатка может быть исследована различными методами визуализации.

Вирусные векторы, благодаря своей высокой эффективности трансдукции, являются основным средством доставки терапевтических генов в клетки-мишени. Однако, в зависимости от используемого вирусного вектора, были описаны различные побочные реакции, такие как иммунные и воспалительные реакции26, мутагенные и онкогенные эффекты 27,28 или распространение в других тканях29. Практические ограничения включают ограниченный размер упаковки30, а также трудности и затраты, связанные с производством партий клинического сорта31,32. Эти недостатки способствовали дальнейшему развитию невирусных, основанных на плазмидах векторов, которые передаются через липо-/полиплексы, ультразвук или электропорацию. Однако геномная интеграция трансгена в геном хозяина обычно не стимулируется плазмидными векторами, что приводит к переходной экспрессии.

Транспозоны — это естественные фрагменты ДНК, которые изменяют свое положение в геноме, характеристика, которая была принята для генной терапии. Благодаря активному механизму интеграции векторные системы на основе транспозонов позволяют непрерывно и постоянно выражать вставленный трансген. Транспозон Спящей красавицы (SB), восстановленный из древнего транспозона типа Tc1/mariner, обнаруженного у рыб33 и дополнительно улучшенного молекулярной эволюцией, что привело к гиперактивному варианту SB100X34, обеспечил эффективную транспозицию в различных первичных клетках и использовался для фенотипической коррекции в различных моделях заболеваний35. В настоящее время начато 13 клинических испытаний с использованием транспозонной системы SB . Транспозонная система SB100X состоит из двух компонентов: транспозона, который содержит интересующий ген, окруженный терминальными инвертированными повторами (TR), и транспозазы, которая мобилизует транспозон. После доставки плазмидной ДНК в клетки транспозаза связывает TIF и катализирует иссечение и интеграцию транспозона в геном клетки.

Мы разработали невирусную клеточную аддитивную терапию для лечения неоваскулярной ВМД. Подход включает в себя электропорационную вставку гена PEDF в первичные пигментные эпителиальные (PE) клетки с помощью транспозонной системы SB100X 36,37,38. Генетическая информация транспозазы и PEDF предоставляется на отдельных плазмидах, что позволяет регулировать идеальное соотношение транспозонов SB100X к PEDF. Электропорация выполняется с использованием капиллярной трансфекционной системы на основе пипетки, которая характеризуется максимальным размером зазора между электродами при минимизации площади их поверхности. Было показано, что устройство достигает превосходных скоростей трансфекции в широком диапазоне клеток млекопитающих 39,40,41. Малая площадь поверхности электрода обеспечивает равномерное электрическое поле и уменьшает различные побочные эффекты электролиза42.

Антиангиогенная функциональность PEDF, секретируемая трансфектированными пигментными эпителиальными клетками, была показана в различных экспериментах in vitro, анализирующих прорастание, миграцию и апоптоз эндотелиальных клеток пуповинной вены человека43. Кроме того, трансплантация PEDF-трансфектированных клеток в кроличью модель неоваскуляризации роговицы44, а также крысиная модель CNV 43,45,46 показали снижение неоваскуляризации.

Здесь мы описываем подробный протокол для стабильной вставки гена PEDF в первичные клетки RPE человека через систему транспозонов SB100X с использованием системы капиллярной трансфекции. Трансфектированные клетки держали в культуре в течение 21 дня и впоследствии анализировали с точки зрения экспрессии гена PEDF с помощью количественной полимеразной цепной реакции (qPCR) и с точки зрения секреции белка PEDF путем иммуноблоттинга и иммуноферментного анализа (ИФА, рисунок 1).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Человеческие донорские глаза были получены из банка ахенской роговицы отделения офтальмологии (Университетская клиника RWTH Aachen) после получения информированного согласия в соответствии с Хельсинкской декларацией протоколов. Процедуры сбора и использования образцов человека были одобрены институциональным комитетом по этике.

1. Выделение первичных клеток RPE человека

  1. Разложите стерильную защитную одежду и перчатки. Поместите стерильную драпировку под ламинарный поток.
  2. Поместите инструменты для стерильной подготовки и другое необходимое стерильное оборудование под ламинарный поток.
  3. Запишите поступление глазных глобусов, начало подготовки, а также возможные отклонения. Зарегистрируйте возраст донора, пол, причину смерти и период между моментом смерти и удалением глаз.
  4. Поместите глазной шар в стерильный марлевый компресс и держите его в одной руке.
  5. Отделите передний сегмент от заднего сегмента окружным разрезом примерно на 3,5 мм сзади от лимбуса с помощью скальпеля и дополнительных тонких заостренных глазных ножниц.
  6. После наклона заднего сегмента вниз аккуратно удалите стекловидное тело и сетчатку с помощью щипцов колибри.
  7. Незаметно перестраивайте разрушенный комплекс RPE/choroidea с помощью прямых щипцов радужной оболочки и впоследствии удерживайте его в положении с изогнутыми щипцами радужной оболочки.
  8. Наполните заднюю глазную чашку 1 мл питательной смеси F-12 Модифицированного Орла / Ветчины от Dulbecco, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), пенициллином 80 Ед / мл и 80 мкг / мл стрептомицина (Pen / Strep) и 2,5 мкг / мл амфотерицина B (AmphoB).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В отличие от выделения первичных клеток RPE из глаз свиней или крупного рогатогоскота 36,37, задняя глазная чашка не должна быть заполнена и инкубирована трипсином.
  9. Соберите клетки RPE, аккуратно расчесывая пигментный эпителий сетчатки от зрительного нерва к лимбусу с помощью огнеполированной изогнутой стеклянной пипетки Пастера, одновременно фиксируя комплекс RPE / choroidea в лимбусе с помощью щипцов колибри. Переложите клеточную суспензию в чашку Петри.
  10. Повторите шаги 1.8 и 1.9 и соберите все ячейки в чашке Петри. Осторожно повторно суспендируйте клеточную суспензию, пипетируя вверх и вниз с помощью одноканальной пипетки (100-1000 мкл).
  11. Засейте клеточную суспензию RPE каждого глазного шара в три лунки 24-луночной клеточной культуральной пластины и заполните их до 1 мл DMEM / F12 с добавлением FBS, Pen / Strep и AmphoB.
  12. Поддерживать клеточные культуры RPE при 37 °C в увлажненной атмосфере с 95% воздуха и 5% CO2 до достижения слияния. Меняйте культуральную среду два раза в неделю.

2. Электропорация первичных клеток RPE человека

  1. Получение транспозазной смеси плазмид SB100X/PEDF
    1. Очистите транспозазу SB100X и транспозонную плазмидную ДНК PEDF с помощью обычных наборов для очистки плазмид, которые определены как пригодные для использования в таких приложениях, как трансфекция, в соответствии с протоколом производителя.
    2. Количественно оцените содержание плазмидной ДНК с помощью микрообъемного спектрофотометра и отрегулируйте их до концентрации 250 нг/мкл с 10 мМ Tris-HCl (рН 8,5).
    3. Смешайте одну порцию 250 нг/мкл транспозазной плазмидной ДНК SB100X (например, 2,5 мкл) с 16 порциями транспозонной плазмидной ДНК PEDF 250 нг/мкл (например, 40 мкл). Остаточная плазмидная смесь может храниться при -20 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следует избегать многократных циклов замораживания и оттаивания плазмидной смеси.
    4. Поместите 2 мкл транспозазной смеси транспозазы SB100X /PEDF транспозонной плазмиды, содержащей 29,4 нг транспозазной плазмиды SB100X и 470,6 нг транспозонной плазмиды PEDF, в стерильную микроцентрифужную трубку с безопасным замком 1,5 мл. Хранить на льду до смешивания с клетками.
  2. Настройка системы капиллярной трансфекции
    ПРИМЕЧАНИЕ: Электропорация первичных клеток RPE человека была выполнена с помощью системы капиллярной трансфекции с использованием комплекта 10 мкл в соответствии с протоколом производителя. Система включает в себя устройство трансфекции, трансфекционную пипетку и станцию пипетки. Комплект содержит 10 мкл трансфекционных наконечников, буферные трубки, электролитический буфер E (буфер E) и буфер ресуспензии R (буфер R).
    1. Подключите станцию пипетки к трансфекционному устройству.
    2. Заполните буферную трубку 3 мл буфера E и вставьте ее в пипетку до тех пор, пока не раздастся звук щелчка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что боковой электрод буферной трубки подключен к боковому шаровому плунжеру пипетки.
    3. Для электропорации первичных человеческих RPE-клеток устанавливают на трансфекционном устройстве следующие импульсные условия: 1 100 В (импульсное напряжение), 20 мс (ширина импульса), два импульса (число импульсов).
  3. Подготовка культивируемых первичных клеток RPE человека
    1. Документирование формы и морфологии первичных клеточных культур RPE с помощью фазово-контрастной микроскопии. Возьмите микроснимки с низким увеличением, чтобы продемонстрировать рост ячеек RPE до сливающегося и интегрированного монослоя, а также микроснимки с более высоким увеличением, чтобы указать на типичную морфологию булыжника клеток RPE.
    2. Аспирируйте клеточную культуральную среду и дважды промывайте клетки 1 мл буферным фосфатным физиологическим раствором (PBS, pH 7,4).
    3. Трипсинизируют первичные клетки RPE человека с 0,5 мл 0,05% трипсина-ЭДТА при 37 °C в увлажненной атмосфере 95% воздуха и 5% CO2 в течение 7-15 мин (максимум). Проверьте отслоение клеток микроскопически.
    4. Прекратить трипсинизацию 1 мл DMEM/F12 с добавлением FBS. Возьмите аликвоту 20 мкл для подсчета клеток с помощью гемоцитометра. Центрифугировать клеточную суспензию RPE при 106 х г в течение 10 мин.
    5. Смешайте 20 мкл аликвоты с 20 мкл раствора трипан синего цвета. Пипетки по 10 мкл в каждой половине гемоцитометра и подсчитывают клетки под фазоконтрастным микроскопом.
    6. После центрифугирования повторно суспендируют гранулу ячейки RPE в 1 мл PBS.
    7. Возьмите 10 000-100 000 RPE-клеток за реакцию трансфекции и центрифугируйте их при 106 х г в течение 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Помимо трансфекционных реакций с применением электрического поля и добавлением плазмидной ДНК, каждый подход также включает в себя две различные управляющие культуры: (1) без применения электрического поля и без плазмидной ДНК; (2) с применением электрического поля, но без плазмидной ДНК.
    8. Повторно суспендируют клеточную гранулу в 11 мкл буфера R и соединяют ее с 2 мкл транспозазной SB100X /транспозонной плазмидной смеси PEDF (см. этап 2.1.4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: После повторного суспендирования в буфере R клетки должны быть обработаны в течение 15 мин, чтобы избежать снижения жизнеспособности клеток и эффективности трансфекции.
    9. Вставьте головку трансфекционной пипетки в наконечник для трансфекции объемом 10 мкл до тех пор, пока зажим полностью не поднимет крепежный шток поршня. Вытяните клеточный/плазмидный раствор в кончик трансфекции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте образования пузырьков воздуха и их аспирации в наконечник трансфекции.
    10. Обеспечить 1 мл DMEM/F12, дополненного FBS, но без Pen/Strep и без AmphoB, в необходимое количество лунок 24-луночной клеточной культуральной пластины.
  4. Процесс электропорации
    1. Вставьте трансфекционную пипетку в буферную трубку, установленную в пипетке (см. шаг 2.2.2), пока не раздастся звук щелчка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что металлическая головка трансфекционной пипетки соединена с шариковым плунжером внутри пипеточной станции и с буферной трубкой.
    2. Нажмите кнопку Пуск на сенсорном экране устройства трансфекции. Перед применением электрического импульса устройство автоматически проверяет, правильно ли вставлены буферная трубка и трансфекционная пипетка. После подачи электрических импульсов Complete отображается на сенсорном экране.
    3. Осторожно извлеките трансфекционную пипетку из пипеточной станции и немедленно освободите электропорированные ячейки из трансфекционного наконечника объемом 10 мкл путем пипетки раствора ячейки/плазмиды в подготовленные колодцы пластины клеточной культуры (см. этап 2.3.10).
    4. Поддерживать трансфектированные клеточные культуры RPE при 37 °C в увлажненной атмосфере с 95% воздуха и 5% CO2. Добавьте Pen/Strep и AmphoB с первым средним обменом через 3 дня после электропорации.

3. Анализ трансфектированных первичных клеток RPE человека

  1. Пробоподготовка
    1. После времени культивирования в 3 недели, в конечном счете, инкубируют клеточные культуры RPE в определенном объеме 1,0 мл DMEM / F12 с добавлением FBS, Pen / Strep и AmphoB в течение определенного времени 24 ч.
    2. Возьмите супернатанты клеточной культуры и храните их при -20 °C до дальнейшей обработки в ближайшее время или при -80 °C для термически нестабильных образцов и длительного хранения.
    3. Трипсинизировать трансфектированные клеточные культуры RPE с 0,5 мл 0,05% трипсина-ЭДТА при 37 °C в увлажненной атмосфере 95% воздуха и 5% CO2 в течение 10 мин.
    4. Прекратить трипсинизацию 1 мл DMEM/F12 с добавлением FBS. Возьмите небольшие аликвоты для подсчета клеток с помощью гемоцитометра (см. шаг 2.3.5). Центрифугирование клеточных суспензий RPE по 106 х г в течение 10 мин.
    5. Храните гранулы ячейки RPE при -80 °C до дальнейшей обработки.
  2. Оценка секреции PEDF методом вестерн-блоттинга
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для качественной оценки супернатанты клеточных культур (см. этап 3.1.2) анализируют с помощью электрофореза додецилсульфата натрия полиакриламидного геля (SDS-PAGE) и последующего западного блоттинга. В зависимости от PEDF Транспозонная плазмидная ДНК используется, супернатанты должны быть обработаны по-другому.
    1. Очистка помеченных His белков слияния PEDF из супернатантов клеточной культуры
      1. Возьмите 30 мкл суспензии никель-нитрилотриаценовой кислоты (Ni-NTA) на образец с использованием конического наконечника и гранулируйте смолу Ni-NTA центрифугированием (2 660 х г в течение 30 с).
      2. Осторожно повторно суспендируют смолу Ni-NTA с 200 мкл 1x инкубационного буфера (50 мМ2PO4, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазола, рН 8,0) и гранулируют ее центрифугированием (2,660 х г в течение 30 с).
      3. Повторите предыдущий шаг.
      4. Тщательно повторно суспендируйте смолу Ni-NTA с 40 мкл 4x инкубационным буфером (200 мМ2PO4, 1,2 М NaCl, 40 мМ имидазола, рН 8,0) на образец.
      5. Смешайте 900 мкл супернатанта клеточной культуры с 260 мкл 4-кратного инкубационного буфера и 55 мкл предварительно обработанной ni-NTA-суспензии (см. этап 3.2.1.4).
      6. Инкубировать смесь на качающемся шейкере при комнатной температуре в течение 60 мин.
      7. Гранулирование Никель-NTA смолы центрифугированием (2660 х г в течение 60 с).
      8. Тщательно повторно суспендировать Смолу Ni-NTA с 175 мкл 1x инкубационного буфера и пеллетной смолой центрифугированием (2,660 x g в течение 60 с).
      9. Повторите предыдущий шаг.
      10. Осторожно повторно суспендируют смолу Ni-NTA с 30 мкл элюирующего буфера (50 мМ2PO4, 300 мМ NaCl, 250 мМ имидазола, рН 8,0) и инкубируют смесь на качающем шейкере при комнатной температуре в течение 20 мин.
      11. Гранулирование Никель-NTA смолы центрифугированием (2,660 х г в течение 30 с).
      12. Осторожно возьмите супернатант и смешайте его с 2-кратным буфером образцов SDS47.
      13. Нагрейте смесь при 95 °C в течение 5 мин и отделите очищенные Ni-NTA белки на 10% SDS-полиакриламидном геле.
      14. Выполняйте вестерн-блоттинг с использованием анти-Пента-Гис антител (мышиный моноклональный, 1:500) и пероксидазы хрена (HRP)-конъюгированных антимышьих антител (кроличий поликлональный, 1:1000), как описано ранее36,37.
    2. Прямой анализ немегированных белков PEDF
      1. Возьмите 15 мкл супернатанта клеточной культуры и смешайте его с 2-кратным буфером образца SDS47.
      2. Нагревайте смесь при 95 °C в течение 5 мин и отделяйте белки на 10% SDS-полиакриламидном геле.
      3. Выполняйте вестерн-блоттинг с использованием античеловеческих антител PEDF (кроличий поликлональный, 1:4000) и HRP-конъюгированных анти-кроликовых антител (козий поликлональный, 1:2000), как описано ранее38.
    3. Количественная оценка секреции PEDF с помощью ИФА
      1. Анализ супернатантов клеточных культур (см. шаг 3.1.2) с использованием человеческого набора PEDF ELISA в соответствии с протоколом производителя.
      2. Соотнесите количество секретируемого PEDF со временем и номером клеток, определенным для каждой реакции трансфекции (см. шаг 3.1.4).
    4. Анализ экспрессии гена PEDF в трансфектированных RPE-клетках
      1. Изолируйте общую РНК из гранул клеток RPE (см. этап 3.1.5) с помощью коммерчески доступного комплекта в соответствии с протоколом производителя.
      2. Количественная оценка содержания РНК с помощью микрообъемного спектрофотометра.
      3. Осуществляют обратную транскрипцию на РНК 0,1 мкг с помощью системы обратной транскрипции по протоколу производителя.
      4. Выполняйте qPCR в режиме реального времени, как описаноранее 38.
    5. Анализ сайтов трансгенной вставки в трансфектированных RPE-клетках
      1. Изолируйте геномную ДНК из гранул клеток RPE (см. этап 3.1.5) с помощью коммерчески доступного комплекта в соответствии с протоколом производителя.
      2. Количественное определение содержания ДНК с помощью микрообъемного спектрофотометра.
      3. Генерация библиотек сайта вставки с использованием схемы ПЦР с помощью вычислений, специфичной для геми, как описано ранее38.
      4. Выполните вычислительный анализ, как описано ранее38.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Культивирование и электропорация первичных клеток RPE человека
Показано, что посев достаточного количества первичных РПЭ клеток животного происхождения позволяет культивировать и выращивать до интегрированного монослоя пигментированных, шестиугольных клеток 36,37,48. Их способность образовывать плотные соединения, проявлять фагоцитарную активность и экспрессировать специфическ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В нашем проекте мы стремимся к невирусному производству генетически модифицированных первичных клеток RPE человека, которые постоянно сверхэкспрессируют и секретируют эффективный фактор, чтобы использовать трансфектированные клетки в качестве долгосрочного терапевтического средства для создания и поддержания защитной среды. Мы установили введение гена, кодирующего PEDF, вездесущий экспрессируемый многофункциональный белок с антиангиогенной и нейропротекторной функциями. Протокол, описанный здесь, может быть использован д...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Золтан Ивиц и Жужанна Изшвак являются изобретателями нескольких патентов на технологию транспозонов SB

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Седьмой рамочной программой Европейского союза по исследованиям, технологическим разработкам и демонстрации, грантовым соглашением No 305134. Zsuzsanna Izsvák финансировалась Европейским исследовательским советом ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742). Авторы хотели бы поблагодарить Анну Добиас и Антье Шифер (отделение офтальмологии, университетская клиника RWTH Aachen) за отличную техническую поддержку, а также Aachen Cornea Bank (отделение офтальмологии, университетская клиника RWTH Aachen) за предоставление человеческим донорским глазам.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Isolation of primary human RPE cells
24-Well Cell Culture Plate, Eppendorf, Hamburg, Germany0030722019
Amphotericin B [250 µ g/mL] (AmphoB)Merck, Дармштадт, ГерманияA2942
Colibri ЩипцыGeuder, Гейдельберг, ГерманияG-18950
Изогнутый щипцы из радужной оболочки Geuder, Гейдельберг, ГерманияG-18856
Одноразовый скальпель (No 11)Перо, Осака, Япония
Dulbecco' s Модифицированный Eagle' s Средний/Ветчина' s F-12 Смесь питательных веществ (DMEM/F12)PAN-Biotech, Айденбах, ГерманияP04-41150
Сверхтонкие ножницы с заостренным глазом Geuder, Heidelberg, GermanyG-19405
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота [0.2 &; m Стерильная фильтрация] (FBS)PAN-Biotech, Айденбах, ГерманияP40-37500
Стеклянные пастеровские пипеткимарки, Вертхайм, Германия747715
пенициллин [10,000 ед./мл] и стрептомицин [10 мг/мл] (Pen/Strep)Merck, Дармштадт, ГерманияP0781
Наконечники для пипеток (1000 &m; L)Starlab, Гамбург, Германия
Одноканальный пипетка (100-1000 &; L)Eppendorf, Гамбург, Германия
Стерильные простыниLohmann & Rauscher, Ренгсдорф, Германия
Стерильный марлевый компресс Fink-Walter, Merchweiler, Германия321063
Стерильные перчаткиSempermed, Вена, Австрия
Стерильная чашка Петри (Falcon 60 мм x 15 мм)Corning, Corning, Нью-Йорк351007
Стерильный хирургический халатHalyard Health, Альфаретта, Джорджия
Прямой щипцы радужной оболочки Geuder, Heidelberg, ГерманияG-18855
Электропорация первичных клеток RPE человека
10 мМ Tris-HCl (pH 8,5)
12-луночный планшет для культивирования клетокThermo Fisher Scientific, Waltham, MA150628
24-луночный планшет для культивирования клетокEppendorf, Гамбург, Германия
Амфотерицин B [250 &; г/мл] (AmphoB)Merck, Дармштадт, ГерманияA2942
Dulbecco' s Модифицированный Eagle' s Средний/Ветчина' s F-12 Питательная смесь (DMEM/F12)PAN-Biotech, Айденбах, ГерманияP04-41150
Микроцентрифужные пробирки с безопасным замком (1,5 мл)Eppendorf, Гамбург, Германия
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота [0,2 &; m Стерильная фильтрация] (FBS)PAN-Biotech, Айденбах, ГерманияP40-37500
Инвертированный микроскопLeica Mikrosysteme, Вецлар, ГерманияLeica DMi8
(спектрофотометр NanoDrop)Thermo Fisher Scientific, Waltham,
Система капиллярной трансфекции (Neon Transfection System)Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс
Неоновая трансфекционная система 10 & микро; L KitThermo Fisher Scientific, Waltham, MAMPK1096
гемоцитометр (камера Нойбауэра)Paul Marienfeld, Lauda-Kö нигсхофен, Германия0640110
PBS Dulbecco без Ca2+ без Mg2+Biochrom, Берлин, ГерманияL182-50
Пенициллин [10,000 единиц/мл] и стрептомицин [10 мг/мл] (Pen/Strep)Merck, Дармштадт, ГерманияP0781
Наконечники для пипеток (10 &m; L)Starlab, Гамбург, Германия
Наконечники для пипеток (1000 & микро; L)Starlab, Гамбург, Германия
Наконечники для пипеток (200 &; L)Starlab, Гамбург, Германия
Набор для плазмидного максиQiagen, Хильден, Германия12163
Одноканальный пипетка (0,1-10 &; L)Eppendorf, Гамбург, Германия
Одноканальный дозатор (100-1000 &; L)Eppendorf, Гамбург, Германия
Одноканальный дозатор (10-200 &; микро; L)Eppendorf, Гамбург, Германия
Trypan Blue SolutionMerck, Дармштадт, ГерманияT8154
Trypsin-EDTA (0,05 %)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA25300054
Анализы трансфицированных первичных клеток RPE человека
10% SDS-полиакриламидный гель
1x Инкубационный буфер (50 мМ2PO4, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазол, pH 8,0)
2x SDS буфер
4x инкубационный буфер (200 мМ2PO4, 1,2 M NaCl, 40 мМ имидазола, pH 8,0)
Amersham Protran Supported 0,2 &; М  Нитроцеллюлозная блоттинговая мембранаCytiva, Marlborough, MA10600015
амфотерицин B [250 &; g/mL] (AmphoB)Merck, Дармштадт, ГерманияA2942
Антитела против PEDF (поликлональные кролики)BioProducts, Middletown, MDAB-PEDF1
Антитела против пента-ГИС (моноклональные мыши)Qiagen, Hilden, Германия34660
Dulbecco' s Модифицированный Eagle' s Средний/Ветчина' s F-12 Смесь питательных веществ (DMEM/F12)PAN-Biotech, Aidenbach, ГерманияP04-41150
Элюирующий буфер (50 мМ2PO4, 300 mM NaCl, 250 мМ имидазол, pH 8,0) 
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота [0.2 &; m Стерильная фильтрация] (FBS)PAN-Biotech, Айденбах, ГерманияP40-37500
Гемоцитометр (камера Нойбауэра)Пауль Мариенфельд, Lauda-Kö Нигсхофен, Германия0640110
Пероксидаза-конъюгированные антитела к мышам (поликлональныеAgilent Dako, Санта-Клара, CAP0260
Пероксидаза-конъюгированные антитела к кроликам хрена (поликлональные козьи)Abcam, Кембридж, Великобританияab6721
Набор для ИФА ИФА для человека BioProducts, Middletown, MDPED613
LAS-3000 Imaging SystemFujifilm, Минато, Япония
LightCycler 1.2 InstrumentRoche Life Science, Пенцберг, Германия
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green IRoche Life Science, Пенцберг, Германия12239264001
LightCycler  Капилляры (20 и мкм; l)Roche Life Science, Пенцберг, Германия4929292001
Микрообъемный спектрофотометр (спектрофотометр NanoDrop)Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс
Mini-PROTEAN  Модуль литья Tetra CellBio-Rad Laboratories, Фельдкирхен, Германия1658015
Mini-PROTEAN  Вертикальная электрофорезная ячейка Tetra для мини-сборных гелей, 4-gelBio-Rad Laboratories, Фельдкирхен, Германия1658004
Ni-NTA SuperflowQiagen, Hilden, Германия30410
PageRuler Prestained Protein LadderThermo Fisher Scientific, Waltham, MA26616
Пенициллин [10 000 единиц/мл] и стрептомицин [10 мг/мл] (Pen/Strep)Merck, Дармштадт, ГерманияP0781
Наконечники для пипеток (10 & микро; L)Starlab, Гамбург, Германия
Наконечники для пипеток (1000 & микро; L)Starlab, Гамбург, Германия
Наконечники для пипеток (200 &; L)Starlab, Гамбург, Германия
PowerPac BasicSupply Bio-Rad Laboratories, Фельдкирхен, Германия1645050
QIAamp DNA Mini KitQiagen, Hilden, Германия51304
Система обратной транскрипции Promega, Madison, WIA3500
RNase-Free DNase SetQiagen, Hilden, Германия79254
RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden, Германия74104
КачалкаCole-Parmer, Стаффордшир, ВеликобританияSSM3
Safe-Lock Микроцентрифужные пробирки (1,5 мл)Eppendorf, Гамбург, Германия
Safe-Lock Микроцентрифужные пробирки (2,0 мл)Eppendorf, Гамбург, Германия
Одноканальный пипетка (0,1-10 &; L)Eppendorf, Гамбург, Германия
Одноканальный дозатор (100-1000 &; L)Eppendorf, Гамбург, Германия
Одноканальный дозатор (10-200 &; микро; L)Eppendorf, Гамбург, Германия
Trans-Blot Turbo Transfer SystemBio-Rad Laboratories, Фельдкирхен, Германия1704150
Trypan Blue SolutionMerck, Дармштадт, ГерманияT8154
Trypsin-EDTA (0,05 %)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA25300054
0030722019 Микрообъемный спектрофотометр MAMPK5000для проб, кролики) Power

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. James, S. L., et al. national incidence, prevalence, and years lived with disability for 354 diseases and injuries for 195 countries and territories, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet. 392 (10159), 1789-1858 (2018).
  2. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
  3. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  4. Chan, C. K., et al. Differential expression of pro- and antiangiogenic factors in mouse strain-dependent hypoxia-induced retinal neovascularization. Laboratory Investigation. 85 (6), 721-733 (2005).
  5. Gao, G., et al. Unbalanced expression of VEGF and PEDF in ischemia-induced retinal neovascularization. FEBS Letters. 489 (2-3), 270-276 (2001).
  6. Bhutto, I. A., et al. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in aged human choroid and eyes with age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 82 (1), 99-110 (2006).
  7. Holekamp, N. M., Bouck, N., Volpert, O. Pigment epithelium-derived factor is deficient in the vitreous of patients with choroidal neovascularization due to age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 134 (2), 220-227 (2002).
  8. Kolomeyer, A. M., Sugino, I. K., Zarbin, M. A. Characterization of conditioned media collected from aged versus young human eye cups. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (8), 5963-5972 (2011).
  9. Li, X., et al. The significance of the increased expression of phosphorylated MeCP2 in the membranes from patients with proliferative diabetic retinopathy. Scientific Reports. 6, 32850(2016).
  10. Mohan, N., Monickaraj, F., Balasubramanyam, M., Rema, M., Mohan, V. Imbalanced levels of angiogenic and angiostatic factors in vitreous, plasma and postmortem retinal tissue of patients with proliferative diabetic retinopathy. Journal of Diabetes and its Complications. 26 (5), 435-441 (2012).
  11. Empeslidis, T., et al. How successful is switching from Bevacizumab or Ranibizumab to Aflibercept in Age-Related Macular Degeneration? A systematic overview. Advances in Therapy. 36 (7), 1532-1548 (2019).
  12. Solomon, S. D., Lindsley, K., Vedula, S. S., Krzystolik, M. G., Hawkins, B. S. Anti-vascular endothelial growth factor for neovascular age-related macular degeneration. Cochrane Database of Systematic Reviews. 3, (2019).
  13. Dugel, P. U., et al. phase 3, multicenter, randomized, double-masked trials of brolucizumab for neovascular age-related macular degeneration. Ophthalmology. 127 (1), 72-84 (2020).
  14. Falavarjani, K. G., Nguyen, Q. D. Adverse events and complications associated with intravitreal injection of anti-VEGF agents: a review of literature. Eye. 27 (7), 787-794 (2013).
  15. Jaffe, D. H., Chan, W., Bezlyak, V., Skelly, A. The economic and humanistic burden of patients in receipt of current available therapies for nAMD. Journal of Comparative Effectiveness Research. 7 (11), 1125-1132 (2018).
  16. Eghoj, M. S., Sorensen, T. L. Tachyphylaxis during treatment of exudative age-related macular degeneration with ranibizumab. British Journal of Ophthalmology. 96 (1), 21-23 (2012).
  17. Forooghian, F., Cukras, C., Meyerle, C. B., Chew, E. Y., Wong, W. T. Tachyphylaxis after intravitreal bevacizumab for exudative age-related macular degeneration. Retina - The Journal of Retinal and Vitreous Diseases. 29 (6), 723-731 (2009).
  18. Otsuji, T., et al. Initial non-responders to ranibizumab in the treatment of age-related macular degeneration (AMD). Clinical Ophthalmology. 7, 1487-1490 (2013).
  19. Zuber-Laskawiec, K., Kubicka-Trzaska, A., Karska-Basta, I., Pociej-Marciak, W., Romanowska-Dixon, B. Non-responsiveness and tachyphylaxis to anti-vascular endothelial growth factor treatment in naive patients with exudative age-related macular degeneration. Journal of Physiology and Pharmacology. 70 (5), (2019).
  20. Campochiaro, P. A., et al. Lentiviral vector gene transfer of endostatin/angiostatin for macular degeneration (GEM) study. Human Gene Therapy. 28 (1), 99-111 (2017).
  21. Constable, I. J., et al. Phase 2a randomized clinical trial: safety and post hoc analysis of subretinal rAAV.sFLT-1 for wet age-related macular degeneration. EBioMedicine. 14, 168-175 (2016).
  22. Rakoczy, E. P., et al. Three-year follow-up of phase 1 and 2a rAAV.sFLT-1 subretinal gene therapy trials for exudative age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 204, 113-123 (2019).
  23. Kumar-Singh, R. The role of complement membrane attack complex in dry and wet AMD - from hypothesis to clinical trials. Experimental Eye Research. 184, 266-277 (2019).
  24. Campochiaro, P. A., et al. Adenoviral vector-delivered pigment epithelium-derived factor for neovascular age-related macular degeneration: results of a phase I clinical trial. Human Gene Therapy. 17 (2), 167-176 (2006).
  25. Campochiaro, P. A. Gene transfer for neovascular age-related macular degeneration. Human Gene Therapy. 22 (5), 523-529 (2011).
  26. Ahi, Y. S., Bangari, D. S., Mittal, S. K. Adenoviral vector immunity: its implications and circumvention strategies. Current Gene Therapy. 11 (4), 307-320 (2011).
  27. Hacein-Bey-Abina, S., et al. Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. New England Journal of Medicine. 363 (4), 355-364 (2010).
  28. Howe, S. J., et al. Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients. Journal of Clinical Investigation. 118 (9), 3143-3150 (2008).
  29. Stieger, K., et al. Subretinal delivery of recombinant AAV serotype 8 vector in dogs results in gene transfer to neurons in the brain. Molecular Therapy. 16 (5), 916-923 (2008).
  30. Tornabene, P., Trapani, I. Can adeno-associated viral vectors deliver effectively large genes. Human Gene Therapy. 31 (1-2), 47-56 (2020).
  31. Ayuso, E. Manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors: new technologies are welcome. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 3, 15049(2016).
  32. van der Loo, J. C., Wright, J. F. Progress and challenges in viral vector manufacturing. Human Molecular Genetics. 25, 42-52 (2016).
  33. Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell. 91 (4), 501-510 (1997).
  34. Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nature Genetics. 41 (6), 753-761 (2009).
  35. Izsvak, Z., Hackett, P. B., Cooper, L. J., Ivics, Z. Translating Sleeping Beauty transposition into cellular therapies: victories and challenges. Bioessays. 32 (9), 756-767 (2010).
  36. Thumann, G., et al. High efficiency non-viral transfection of retinal and iris pigment epithelial cells with pigment epithelium-derived factor. Gene Therapy. 17 (2), 181-189 (2010).
  37. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
  38. Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the SB transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
  39. Abdul Halim, N. S., Fakiruddin, K. S., Ali, S. A., Yahaya, B. H. A comparative study of non-viral gene delivery techniques to human adipose-derived mesenchymal stem cell. International Journal of Molecular Sciences. 15 (9), 15044-15060 (2014).
  40. Ahlemeyer, B., Vogt, J. F., Michel, V., Hahn-Kohlberger, P., Baumgart-Vogt, E. Microporation is an efficient method for siRNA-induced knockdown of PEX5 in HepG2 cells: evaluation of the transfection efficiency, the PEX5 mRNA and protein levels and induction of peroxisomal deficiency. Histochemistry and Cell Biology. 142 (5), 577-591 (2014).
  41. May, R. D., et al. Efficient nonviral transfection of primary intervertebral disc cells by electroporation for tissue engineering application. Tissue Engineering Part C - Methods. 23 (1), 30-37 (2017).
  42. Kim, J. A., et al. A novel electroporation method using a capillary and wire-type electrode. Biosensors & Bioelectronics. 23 (9), 1353-1360 (2008).
  43. Johnen, S., et al. Antiangiogenic and neurogenic activities of Sleeping Beauty-mediated PEDF-transfected RPE cells in vitro and in vivo. Biomed Research International. 2015, 863845(2015).
  44. Kuerten, D., et al. Transplantation of PEDF-transfected pigment epithelial cells inhibits corneal neovascularization in a rabbit model. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (7), 1061-1069 (2015).
  45. Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after Sleeping Beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
  46. Hernandez, M., et al. Preclinical evaluation of a cell-based gene therapy using the Sleeping Beauty transposon system in choroidal neovascularization. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 15, 403-417 (2019).
  47. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  48. Johnen, S., et al. Presence of xenogenic mouse RNA in RPE and IPE cells cultured on mitotically inhibited 3T3 fibroblasts. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2817-2824 (2011).
  49. Gogol-Doring, A., et al. Genome-wide profiling reveals remarkable parallels between insertion site selection properties of the MLV retrovirus and the piggyBac transposon in primary human CD4(+) T cells. Molecular Therapy. 24 (3), 592-606 (2016).
  50. Holstein, M., et al. Efficient non-viral gene delivery into human hematopoietic stem cells by minicircle Sleeping Beauty transposon vectors. Molecular Therapy. 26 (4), 1137-1153 (2018).
  51. Moldt, B., et al. Comparative genomic integration profiling of Sleeping Beauty transposons mobilized with high efficacy from integrase-defective lentiviral vectors in primary human cells. Molecular Therapy. 19 (8), 1499-1510 (2011).
  52. Yant, S. R., et al. High-resolution genome-wide mapping of transposon integration in mammals. Molecular and Cellular Biology. 25 (6), 2085-2094 (2005).
  53. Grabundzija, I., et al. Comparative analysis of transposable element vector systems in human cells. Molecular Therapy. 18 (6), 1200-1209 (2010).
  54. Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
  55. Chang, L., et al. Micro-/nanoscale electroporation. Lab on a Chip. 16 (21), 4047-4062 (2016).
  56. Shi, J., et al. A review on electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 23 (11), (2018).
  57. Johnen, S., et al. Endogenic regulation of proliferation and zinc transporters by pigment epithelial cells nonvirally transfected with PEDF. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (8), 5400-5407 (2011).
  58. Pastor, M., et al. The antibiotic-free pFAR4 vector paired with the Sleeping Beauty transposon system mediates efficient transgene delivery in human cells. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 11, 57-67 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

PEDFNTA

Похожие статьи