Method Article

Быстрая сборка многофункциональных конструкций с использованием модульного клонирования Золотых Ворот

DOI:

10.3791/61993

⸱

February 5th, 2021

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University at Buffalo, State University of New York

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Целью этого протокола является предоставление подробного, пошагового руководства по сборке много генных конструкций с использованием модульной системы клонирования на основе клонирования Золотых Ворот. Он также дает рекомендации по важнейшим шагам для обеспечения оптимальной сборки на основе нашего опыта.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метод клонирования Золотых Ворот обеспечивает быструю сборку нескольких генов в любом пользовательском механизме. Он использует ферменты ограничения IIS типа, которые вырезают за пределами их сайтов распознавания и создают короткий свес. Эта модульная система клонирования (MoClo) использует иерархический рабочий процесс, в котором различные части ДНК, такие как промоутеры, последовательности кодирования (CDS) и терминаторы, сначала клонируются в вектор входа. Затем несколько векторов входа собираются в единицы транскрипции. Затем несколько единиц транскрипции соединяются с много генной плазмидой. Стратегия клонирования Золотых Ворот имеет огромное преимущество, поскольку позволяет без шрамов, направленной и модульной сборке в одной реакции. Иерархический рабочий процесс обычно позволяет легко клонировать большое разнообразие много генных конструкций без необходимости секвенирования за пределами векторов входа. Использование флуоресцентных белковых отсева обеспечивает легкий визуальный скрининг. Эта работа обеспечивает подробный, шаг за шагом протокол для сборки много генных плазмидов с использованием дрожжевой модульного клонирования (MoClo) комплект. Мы показываем оптимальные и неоптимальные результаты много генной плазмидной сборки и предоставляем руководство по скринингу для колоний. Эта стратегия клонирования в значительной степени применима для инженерии метаболизма дрожжей и других ситуаций, в которых требуется много генная плазмидная клонирование.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Синтетическая биология направлена на создание биологических систем с новыми функциональными возможностями, полезными для фармацевтической, сельскохозяйственной и химической промышленности. Сборка большого количества фрагментов ДНК с высокой пропускной способностью является основополагающим методом в синтетической биологии. Такой сложный процесс может разбиться на несколько уровней с уменьшением сложности, концепция заимствована из фундаментальных инженерныхнаук 1,2. В синтетической биологии фрагменты ДНК обычно собираются иерархически на основе функциональности: i) уровень части: "части" относятся к фрагментам ДНК с определенной функцией, такой как промоутер, последовательность кодирования, терминатор, происхождение репликации; ii) уровень транскрипционных единиц (ТУ): ТУ состоит из промоутера, последовательности кодирования и терминатора, способного транскрибировать один ген; iii) Много генный уровень: много генная плазмида содержит несколько ТУ, часто состоящих из всего метаболического пути. Эта иерархическая сборка, впервые разработанная сообществом BioBrick, является основополагающим понятием для сборки больших наборов ДНК в синтетической биологии3.

В последнее десятилетие4,5,6,7, Золотые Ворота клонирования техника значительно облегчила иерархической сборкиДНК 2. Многие другие многочастные методы клонирования, такие как Гибсонклонирования 8, лигация независимогоклонирования(SLIC) 9 , uracil иссечение основе клонирования (USER)10, лигазы велосипедной реакции (LCR)11, и виво рекомбинации(ДНКсборщик) 12,13, также были разработаны до сих пор. Но клонирование Золотых Ворот является идеальным методом сборки ДНК, потому что он не зависит от генно-специфических последовательностей, что позволяет без шрамов, направленной и модульной сборки в реакции одного горшка. Клонирование Золотых Ворот использует ферменты ограничения типа IIS, которые распознают не палиндромную последовательность для создания ступенчатых свесов за пределами сайтараспознавания 2. Затем лигаза присоединяется к анналированным фрагментам ДНК, чтобы получить многочастивую сборку. Применение этой стратегии клонирования к модульной системе клонирования (MoClo) позволило собрать до 10 фрагментов ДНК с более чем 90% трансформантами, экранированными, содержащими правильно собраннуюконструкцию 4.

Система MoClo предлагает огромные преимущества, которые ускорили цикл проектирования-сборки-теста синтетической биологии. Во-первых, сменные части позволяют комбинатору быстро тестировать большое пространство параметров. Например, оптимизация метаболического пути обычно требует езды на велосипеде через множество промоутеров для каждого гена, чтобы сбалансировать поток пути. Система MoClo может легко справиться с такими сложными задачами клонирования. Во-вторых, нужно секвенировать часть плазмидной, но, как правило, не ТУ или много генных плазмидов. В большинстве случаев скрининг по колониям ПЦР или пищеварения ограничения достаточен для проверки на уровне ТУ и много генной плазмиды. Это потому, что клонирование плазмиды части является единственным шагом, требующим ПЦР, который часто вводит мутации. В-третьих, система MoClo идеально подходит для построения много генных сложных метаболических путей. Наконец, из-за универсальных свесов, часть плазмиды могут быть повторно использованы и совместно со всем сообществом биоинженерии. В настоящее время комплекты MoCloдоступны для растений 14,15,5,16,17,грибов6,18,19,20,21,22,бактерий 7,23,24,25,26,27,иживотных 28,29. Многосемейная платформа MoClo также была введена недавно30.

Для Saccharomyces cerevisiae, Ли и др.6 разработали универсальный инструментарий MoClo, отличный ресурс для дрожжей синтетической биологии сообщества. Этот комплект поставляется в удобном формате 96-колодец и определяет восемь типов сменных частей ДНК с разнообразной коллекцией хорошо охарактеризованных промоутеров, флуоресцентных белков, терминаторов, пептидных тегов, маркеров отбора, происхождения репликации и инструментов редактирования генома. Этот набор инструментов позволяет сборку до пяти единиц транскрипции в много генную плазмиду. Эти особенности являются ценными для дрожжей метаболической инженерии, в которой частичные или целые пути чрезмерно выражены для производства целевых химических веществ. Используя этот комплект, исследователи оптимизировали производство гераниола, линалула31,пенициллина32, слизистойкислоты 33, индиго34и беталена35 в дрожжах.

Здесь мы предоставляем подробный, шаг за шагом протокол для руководства использованием инструментария MoClo для создания многогенных путей для эписомальной или геномной экспрессии. Благодаря обширному использованию этого комплекта, мы обнаружили, что точное измерение концентраций ДНК является ключом к обеспечению равномерного распределения каждой части в реакции Золотых Ворот. Мы также рекомендуем T4 ДНК лигазы над T7 ДНК лигазы, потому что первый работает лучше с большим количеством свесов36. Наконец, любые сайты внутреннего распознавания BsmBI и BsaI должны быть удалены или одомашнены до сборки. Кроме того, можно рассмотреть вопрос об синтезе частей для удаления нескольких внутренних сайтов и для достижения одновременной оптимизации кодона. Мы демонстрируем, как использовать этот инструментарий, выражая пятигенный путь для производства β-каротина и ликопина в S. cerevisiae. Мы также показываем, как выбить локус ADE2 с помощью инструментов для редактирования генома из этого комплекта. Эти цветовые эксперименты были выбраны для легкой визуализации. Мы также демонстрируем, как генерировать синтез белков и создавать аминокислотные мутации с помощью клонирования Золотых Ворот.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол иерархического клонирования, предлагаемый в этом наборе инструментов, можно разделить на три основных этапа: 1. Плазмиды части клонирования; 2. единицы транскрипции клонирования (TUs); 3. Клонирование много генных плазмидов(рисунок 1). Этот протокол начинается с грунтовой конструкции и заканчивается применением клонированной много генной плазмиды.

1. Конструкция грунта для клонирования плазмиды части (pYTK001):

  1. Дизайн вперед и обратной грунтовки, содержащие фланговые нуклеотиды TTT на 5 ' конце, BsmBI сайт распознавания с дополнительным нуклеотидом (CGTCTCN), 4-нуклеотидов (nt) свес (TCGG) дополняет вектор входа, сайт распознавания BsaI с дополнительным нуклеотидом (GGTCTCN) и 4-нт частично специфическим навесом, в дополнение к последовательности шаблона(рисунок 2A). GoldenBraid 4.037 и GoldenMutagenesis38 являются одними из онлайн программного обеспечения, которое может быть использовано для Golden Gate конкретных грунтовки дизайн.
  2. Если сайты распознавания BsaI или BsmBI присутствуют в какой-либо части, используйте шаг одомашнивания, чтобы мутировать эти сайты до сборки Golden Gate39. Для интегративных плазмидов (см. шаг 4) одомашнить любой сайт распознавания NotI. Чтобы одомашнить часть с одним нежелательным сайтом распознавания, разделите часть на две части рядом с нежелательным сайтом(рисунок 2A):
    1. Дизайн вперед грунтовка первой подразчасти таким же образом, как в шаге 1.1. но дизайн обратного грунтовка с сайтом BsmBI и 4-nt ген-специфический свес только.
    2. Дизайн второй подчасти вперед грунтовки с BsmBI сайта и 4-nt ген-специфический свес только, что перекрывается с обратной грунтовки первой подкомпонии. Проектирование обратной грунтовой части второй подкомперии таким же образом, как и в шаге 1.1.
    3. Ввемите желаемую мутацию (ы) либо в обратном направлении (для шага 1.2.1), либо в форвардной грунтовки (шаг 1.2.2) в генно-специфической области грунтовки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, BsmBI- и BsaI-бесплатно и кодон-оптимизированы часть может быть синтезирована на коммерческой основе. Для последовательностей кодирования (CDS) синонимная мутация может быть легко включена в третий нуклеотид аминокислотного кодона. Для промоутеров и терминаторов, однако, проверка мутировавшего промоутера или терминатора деятельности с помощью анализа репортера рекомендуется39. Если есть нежелательный сайт ограничения к концу последовательности, он может мутировать с помощью более длинной обратной грунтовы. Если несколько нежелательных сайтов присутствуют, сайт-направленный мутагенез позволяет мутировать несколько сайтов могут бытьвыполнены 40.
  3. Иногда, слияние двух белков в одной части с связующим звеном между ними желательно(рисунок 2A). Связующим звеном помогает обеспечить структурную целостность двух отдельных белков41.
    1. Передовая грунтовка для первого гена такая же, как и в шаге 1.1. В обратном грунтовку, включают BsmBI сайт, 4-nt ген-специфический свес, и связующий последовательности. 4-nt свес может быть либо связующим звеном или первые несколько нуклеотидов второго гена.
    2. Для второго гена, дизайн вперед грунтовки таким образом, что он имеет сайт распознавания BsmBI и 4-nt свес дополняет обратный грунт первого гена. Дизайн обратного грунтовка второго гена, как в шаге 1.1.
  4. Для усиления частей полимеразной цепной реакцией(ПЦР) 42,используйте полимеразу ДНК высокой точности, чтобы усилить части либо из геномной ДНК, кДНК, либо из плазмиды. Проверьте продукт ПЦР на 1% агарозный гель с последующим гель-очистки. Использование очищенной ДНК настоятельно рекомендуется, если гель очистки является трудоемким, использовать по крайней мере спина колонки для очистки продукта ПЦР.

2. Клонирование частей в вектор входа (pYTK001) для создания плазмидов части(рисунок 2B)

  1. Чтобы настроить смесь реакции Золотые Ворота, добавьте 20 фмоль каждого продукта ПЦР и вектор входа (pYTK001), 1 л буфера 10X T4 лигазы, 0,5 л Esp3I (высокоэффективный изошизомер BsmBI) и 0,5 л T4 ligase. Добавьте ddH2O, чтобы довести общий объем до 10 мкл.
  2. Чтобы настроить реакцию клонирования, запустите следующую программу в термоциклере: 25-35 циклов по 37 градусов по Цельсию в течение 5 минут (переваривание) и 16 градусов по Цельсию в течение 5 минут (лигация), а затем окончательное пищеварение при 50 градусов по Цельсию в течение 10 минут и инактивация фермента при 80 градусов по Цельсию в течение 10 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 35 циклов пищеварения/ лигации рекомендуется при клонировании нескольких частей ДНК в вектор входа одновременно, например, во время клонирования генов синтеза или одомашнивания гена.
  3. Превратите всю смесь реакции в штамм DH5 или эквивалент Escherichia coli химически компетентных клеток теплового удара. Рекомендуется преобразовать весь 10 клонированных продуктов в 35 химически компетентных клеток кишечной палочки (2 X10 5 cfu/mL, cfu рассчитывается из преобразования 5 нг pYTK001 в 100 мл компетентных клеток). Спред на листогенный бульон (LB) пластины с 35 мкг / мл хлорамфеникол (Cm). Инкубировать при 37 градусов по Цельсию на ночь.
  4. После 16-18 ч, возьмите пластину из инкубатора и держать пластину на 4 градусов по Цельсию около 5 ч, чтобы супер папка зеленый флуоресцентный белок (sfGFP) развиваться для более интенсивного зеленого цвета.
  5. Для облегчения скрининга поместите пластину на ультрафиолетовый (УФ) или синий свет трансиллюминатор. SFGFP, содержащий колонии, будет флуоресцеть под ультрафиолетовым светом.
  6. Зеленые колонии являются отрицательными, поскольку они содержат необрезанный pYTK001. Белые колонии, вероятно, положительные. Клонирование обычно успешно, если есть 30-100% белых колоний. Выполнить дальнейший скрининг нескольких белых колоний либо колонии ПЦР или ограничения пищеварения (предлагаемый фермент: BsaI-HFv2).
  7. Очистить плазмиды от нескольких потенциально правильных колоний и подтвердить последовательности секвенированием Сэнгера.

3. Сборка плазмидов части в плазмиды «кассеты»

ПРИМЕЧАНИЕ: Плазмида кассеты содержит определяемый пользователем блок транскрипции (TU), состоящий из промоутера, CDS и терминатора. Плазмида кассеты позволяет экспрессию одного гена. Если плазмиды кассеты будут собраны в много генную плазмиду, то первым шагом будет определение количества и порядка TUs в много генной плазмиде. Они определят, какие разъемы использовать в плазмидах кассеты, так как разъемы связывают TUs в много генной плазмиде. Первый левый разъем TU должен быть ConLS, а правый разъем последнего TU должен быть ConRE. Они будут перекрываться с ConLS и ConRE' много генных плазмидов. Остальные разъемы должны быть в увеличиваемом численном порядке. Например, если много генная плазмида содержит четыре TUs, комбинации разъемов будут ConLS-TU1-ConR1, ConL1-TU2-ConR2, ConL2-TU3-ConR3 и ConL3-TU4-ConRE(рисунок 1).

  1. Перед сборкой транскрипционных блоков рекомендуется сборка промежуточного вектора со следующими шестью частями: левый разъем, отсева sfGFP (pYTK047), правый разъем, маркер отбора дрожжей, дрожжевое происхождение репликации и плазмидная часть с mRFP1, происхождением кишечной палочки и геном, устойчивым кампициллину(pYTK083) ( рисунок 3).
    1. Очистив выше шесть плазмидов. Завечт их концентрации с помощью спектрофотометра UV-Vis или анализа на основе флуоресценции и разбавите каждуюплазмиду ddH 2O так, чтобы 1 л имеет 20 фмоль ДНК. Рассчитайте концентрацию моляров ДНК с помощью онлайн-калькулятора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно точно измерить концентрацию ДНК и протыхать именно для того, чтобы сборка работала, особенно для сборок с плазмидами пяти-семи. Небольшие ошибки в концентрации ДНК каждой плазмиды могут привести к значительному снижению эффективности клонирования.
    2. Добавьте 1 мл каждой плазмиды, 1 МКЛ буфера 10X T4 лигазы, 0,5 МКЛ BsaI-HFv2 (высокоэффективная версия BsaI) и 0,5 МЛ лигозы T4. Составить объем до 10 МКЛ, добавив ddH2O.
    3. Чтобы настроить реакцию клонирования, запустите следующую программу в термоциклере: 25-35 циклов по 37 градусов по Цельсию в течение 5 минут (переваривание) и 16 градусов по Цельсию в течение 5 минут (лигация). Опустить окончательные шаги пищеварения и тепловой инактивации, поскольку сайты BsaI должны быть сохранены в промежуточном векторе(рисунок 3).
    4. Преобразуйте всю смесь реакции в штамм DH5 или другие компетентные клетки кишечной палочки. Распространение на пластине LB с 50 мкг/мл карбенициллин (Cb) или ампициллин. Инкубировать при 37 градусов по Цельсию на ночь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Карбенициллин является стабильным аналогом ампициллина.
    5. После 16-18 ч вывеми тарелку из инкубатора. Пластина будет содержать как бледно-красные, так и бледно-зеленые колонии(рисунки 6C и 6D). Держите пластину на уровне 4 градусов по Цельсию в течение примерно 5 ч, чтобы mRFP1 и sfGFP созрели. Используйте УФ или синий свет трансиллюминатор для определения зеленых колоний, которые содержат потенциально правильный промежуточный вектор.
    6. Streak из зеленых колоний на пластине LB и Cb и инкубировать при 37 градусов по Цельсию на ночь. На следующий день, полоса снова на пластине LB и Cm и инкубировать при 37 градусов по Цельсию на ночь. Колонии, растущие на пластинах LB и Cm, содержат неправильно собранную плазмиду, потому что векторы устойчивых к см части сохраняются.
    7. Выберите колонии, которые не растут на пластине LB и Cm и выполнять ограничения пищеварения (предлагаемые ферменты: BsaI-HFv2, Esp3I), чтобы подтвердить правильно собранную плазмиду. Кроме того, используйте колонию ПЦР для скрининга.
  2. После успешной сборки промежуточного вектора следующим шагом является сборка единиц транскрипции. Это сборка из 4 частей со следующими частями: промежуточный вектор, промоутер, CDS и терминатор.
    1. Очисти четыре части плазмиды. Завехать их концентрации и разбавить каждый из плазмиды так, что 1 йл имеет 20 ммоль ДНК.
    2. Чтобы настроить смесь реакции, следуйте шагу 3.1.2.
    3. Чтобы настроить реакцию клонирования, следуйте шагу 2.2.
    4. Преобразуйте всю смесь реакции клонирования в DH5 или эквивалентные компетентные клетки кишечной палочки и пластины на LB и Cb. Инкубировать при 37 градусов по Цельсию в одночасье.
    5. После 16-18 ч вывехив тарелку из инкубатора. Появятся белые и бледно-зеленые колонии(рисунки 6E и 6F). Держите пластину на 4 кк около 5 ч, чтобы SFGFP созреть. Используйте УФ или синий свет трансиллюминатор для выявления нефлуоресцентных белых колоний. Они содержат потенциально правильные единицы транскрипции.
    6. Вытяжка и расти 8-10 белых колоний и выполнять колонии ПЦР. Очищать плазмиды из колоний, которые тест положительный от колонии ПЦР. Выполнить ограничение пищеварения (предлагаемый фермент: Esp3I) для дальнейшего подтверждения сборки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Секвенирование единиц транскрипции, как правило, не является необходимым, потому что клонирование включает в себя только ограничение пищеварения и перевязки. Все последовательности интереса были подтверждены на уровне плазмиды части.

4. Сборка плазмидов кассеты в "много генные" плазмиды:

ПРИМЕЧАНИЕ: Много генные плазмиды позволяют экспрессию более чем одного гена. В зависимости от применения вниз по течению, много генные плазмиды могут быть репликационными или интегративными. Репликационные плазмиды имеют дрожжевое происхождение репликации; таким образом, он может быть стабилико поддерживается, когда дрожжевые клетки делится. Интегративные плазмиды не имеют дрожжевого происхождения репликации. Вместо этого, они имеют 5' и 3' гомологии оружия, позволяющие интеграции нескольких генов в конкретные локусы генома через гомологичные рекомбинации.

  1. Для много генных плазмидов сначала соберите промежуточный вектор.
    1. Для сборки реплицативных промежуточныхвекторов (рисунок 4A),собрать следующие шесть частей: левый разъем (ConLS'-pYTK008), sfGFP отсева (pYTK047), правый разъем (ConRE'-pYTK072), маркер выбора дрожжей, дрожжевой происхождения репликации, и часть плазмид с mRFP1, E. coli происхождения репликации, и канамицин-резистентный ген (pYTK084).
      1. Для сборки следуйте шагам от 3.1.1 до 3.1.3.
      2. Преобразуйте всю смесь реакции клонирования в DH5 или эквивалентные компетентные клетки кишечной палочки, и пластину на LB плюс 50 мкг/мл канамицин (Км). Инкубировать при 37 градусов по Цельсию на ночь.
      3. Для скрининга на основе красного/зеленого цвета следуйте шагу 3.1.5.
      4. Для скрининга мизаню, полоса и расти зеленые колонии на пластине LB и км. Затем следуйте шагу 3.1.6.
    2. Для интегративных многогенных векторов(рисунок 4B),определить геномный локус интереса во-первых, а затем дизайн около 500 базовых пар 5' и 3' гомологии оружия для интеграции в этот локус.
      1. Клонировать 5' и 3' гомологии оружия из дрожжевой геномной ДНК в вектор входа-pYTK001. Следуйте шагам 1 и 2.
      2. Соберите следующие семь плазмидов: левый разъем (ConLS'-pYTK008), отсева sfGFP (pYTK047), правый разъем (ConRE'-pYTK072), маркер выбора дрожжей, 3' гомологическая рука, часть плазмида с mRFP1, E. coli происхождения репликации, и канамицин-устойчивый ген (pYTK090), и 5' гомология руку.
      3. Для сборки и скрининга следуйте шагу 4.1.1.
  2. Сборка много генной плазмиды
    1. Очищать плазмиды промежуточного вектора, полученные в шаге 4.1, и плазмиды кассеты из шага 3. Завехайте их концентрации с помощью спектрофотометра UV-Vis или анализа на основе флуоресценции. Разбавить каждый вddH 2O так, что 1 йл имеет 20 фмол ДНК.
    2. Добавьте 1 МЛ промежуточного вектора, 1 йл каждой единицы транскрипции, 1 МКЛ 10x буфера лигазы T4, 0,5 МКЛ Esp3I и 0,5 МКЛ лигозы T4. Довнесите громкость до 10 МКЛ с помощью ddH2O.
    3. Чтобы настроить реакцию клонирования, следуйте шагу 2.2.
    4. Преобразуйте всю смесь реакции клонирования в DH5 или эквивалентные компетентные клетки кишечной палочки, и пластины на LB и km. Инкубировать при 37 градусов по Цельсию в одночасье.
    5. Выполните зелено-белый скрининг, как в шаге 3.2.5.
    6. Очищать плазмиды из нескольких белых колоний и выполнять ограничения пищеварения. Использование фермента NotI-HF рекомендуется, потому что есть два места NotI на E. coli происхождения и км маркера выбора части, соответственно (Рисунок 4B). Если собранная плазмида очень большая, то для дальнейшего подтверждения можно выбрать другой сайт ограничения. Кроме того, экран с колонией ПЦР, прежде чем приступить к ограничению пищеварения.

5. Применение много генных плазмидов для экспрессии генов на основе хромосомной или плазмидной

  1. Интеграция много генной плазмиды в геном дрожжей для экспрессии хромосомных генов(рисунок 5)
    1. Разработать руководство РНК (gRNA) для желаемого локуса. Для определения максимальной целевой специфичности рекомендуется использоватьнесколько онлайн-ресурсов, такихкак Benchling, CRISPRdirect 43 и CHOPCHOP44.
    2. Клонировать синтезированную 20-нт гРНК в плазмидуpCAS 45 путем клонирования Гибсона. Linearize pCAS плазмида ПЦР с помощью обратной грунтовки пары связывания с 3' из HDV рибозим и 5' из tracrRNA соответственно (Рисунок 5). Кроме того, клонировать гРНК в плазмиду отсева sgRNA (pYTK050) и собрать плазмид отсева в плазмиду кассеты с связующим звеном. Затем соберите Cas9 TU с плазмидной частью Cas9 (pYTK036). Наконец, собрать Cas9 TU и sgRNA TU в репликационные много генные плазмиды.
    3. Linearize 5-15 мкг интегративной много генной плазмиды с 1 МКЛ фермента NotI-HF в одночасье. Преобразование 1 мкг pCAS-gRNA и линейной интегративной много генной плазмиды в S. cerevisiae. Подготовка компетентных клеток с использованием либо коммерчески доступных дрожжей преобразования комплекта или после протокола Гейтц и Schiestl, 200746.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости очищать линейно много генную плазмиду после пищеварения NotI.
    4. Пеллет клетки после выздоровления, отбросить супернатант, промыть с равным объемом воды. Плита дрожжевых клеток на полной синтетической среде (CSM) отсева пластины или дрожжевой экстракт пептон декстрозы средней (YPD) пластины с антибиотиками, в зависимости от дрожжей селективного маркера. Инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение двух дней для колоний, чтобы сформировать. В случае, если колония не соблюдается, инкубировать в течение еще одного-двух дней при 30 градусов по Цельсию.
    5. Экран дрожжевых колоний для интеграции колонией PCR47.
    6. Чтобы вылечить pCAS, полоса из колонии с правильной интеграции на не избирательной пластины YPD. Расти при 30 градусов по Цельсию на ночь. Полоса одной колонии из пластины YPD на свежей пластине YPD. Опять же, расти при 30 градусов по Цельсию в одночасье. Полоса колонии от второй пластины YPD к YPD плюс 100 мкг / мл nourseothricin, выбор маркера pCAS. Успешное лечение происходит, когда дрожжевые клетки не растут на селективной пластине.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если плазмида pCAS не вылечана в двух раундах не селективного YPD, полоса снова на свежий YPD еще 1-2 раундов.
  2. Преобразование репликационные много генной плазмиды для экспрессии генов на основе плазмиды
    1. Превратите 100 нг-1 мкг чистой много генной плазмиды в компетентные клетки S. cerevisiae.
    2. Плита дрожжевых клеток сразу после преобразования на CSM отсева пластины или YPD плюс антибиотик пластины, в зависимости от маркера отбора дрожжей используется. Инкубировать при 30 градусов по Цельсию в течение 2-3 дней для колоний, чтобы сформировать.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь результаты четырех репликационные многогенные плазмиды для β (желтый) и ликопин (красный) производства. Была построена одна интегративная многогенерная плазмида для нарушения локуса ADE2, колонии которой красные.

Клонирование CDS в вектор входа (pYTK001)
ERG20 был усилен из генома дрожжей и три каротеноидных генов crtE, crtYB, crtI от плазмидной pLM494

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Комплект клонирования на основе MoClo, разработанный Lee et al., обеспечивает отличный ресурс для быстрой сборки от одного до пяти единиц транскрипции в много генную плазмиду либо для репликации, либо для интеграции в геном дрожжей. Использование этого комплекта устраняет трудоемкое узкое место клонирования, которое часто существует для выражения нескольких генов в дрожжах.

Мы протестировали пять различных условий для пищеварения / лигации циклов клонирования Золотые ворота с T4 ДНК лигазы. Мы...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторов нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа финансировалась Научно-исследовательским фондом Для Государственного университета Нью-йорка (Награда No: 71272) и IMPACT Премии Университета в Буффало (Награда No: 000077).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,5 мм Стеклянные бусиныRPI исследовательские продукты9831Для лизирования дрожжевых клеток
Bacto AgarBD & КР214010Компонент дрожжей полная синтетическая среда (CSM)
Bacto PeptoneBD& Компания211677Компонент дрожжевого экстракта пептона декстроза среда (YPD)
BsaI-HFv2New England BiolabsR3733Sвысокоэффективная версия фермента рестрикции BsaI
КарбенициллинБиореагенты Фишера4800-94-6Антибиотик для скрининга на уровне единицы транскрипции
ХлорамфениколБиореагенты Фишера56-75-7Антибиотик для скрининга на вектор начального уровня
CSM-HisSunrise Sciences1006-010Аминокислотная добавка полной синтетической среды дрожжей (CSM)
DextroseFisher ChemicalD16-500Углеродный источник дрожжей полная синтетическая среда (CSM)
Difco Дрожжевые дрожжи Азотная основа без аминокислотBD & Компания291940Источник азота дрожжей полная синтетическая среда (CSM)
dNTP mixPromegaU1515dNTPs для ПЦР
Esp3INew England BiolabsR0734Sвысокоэффективный изошизомер BsmBI
Frozen-EZ Дрожжевой траформирование II Kit ZymoResearchT2001Для трансформации дрожжей
HexanesFisher ChemicalH302-1Для выделения каротиноидов из дрожжевых клеток
КанамицинФишер Биореагенты25389-94-0Антибиотик для скрининга на мультигенном плазмидном уровне
LB Агар, МиллерФишер БиореагентыBP1425-2Лизогенный агар среда для E. coli культивирование
LB Broth, MillerFisher БиореагентыBP1426-2Лизогенная жидкая среда для E. coli
культивирование ликопинаКаймановы химикатыNC1142173Для количественного определения ликопина
MoClo YTKAddgene1000000061Лаборатория осаждения: John Deuber
Monarch Plasmid Miniprep KitNew England BiolabsT1010LДля очистки плазмид от E.coli
Nanodrop SpectrophotometerThermoScientific ND2000cДля точного измерения концентраций ДНК
NotI-HFNew England BiolabsR3189SФермент рестрикции для интегративной линеаризации мультигенной плазмиды
Nourseothricin SulphateGoldbioN-500-100Antibiotic Selection marker для плазмиды pCAS, использованной в данном исследовании
Phusion HF Reaction Buffer (5X)New England BiolabsB0518SBuffer for PCR с использованием полимеразы Phusion
Phusion Высокоточная ДНК-полимеразаNew England BiolabsM0530SВысокоточная полимераза для всех ПЦР-реакций
pLM494Addgene100539Плазмида используется для амплификации crtI, crtYB и crtE, используемых в этом исследовании
Quartz CuvetteThermo Electron10050801для количественного определения каротиноидов
T4 лигазаNew England BiolabsM0202SLigase for Golden Вентиляционный клонирование
ТермоциклерBIO-RAD1851148Для проведения всех реакций ПЦР и клонирования
Тканевый гомогенизаторBullet BlenderМодель: BBX24Для гомогенизации дрожжевых клеток
УФ-Вид спектрофотометрThermo ScientificGenesys 150Для количественного определения каротиноидов
Экстракт дрожжейFisher BioreagentsBP1422-500Компонент дрожжевого экстракта пептона декстрозы среды (YPD)
&бета;-каротинаAlfa AesarAAH6010603Для количественного определения β-каротина

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Endy, D. Foundations for engineering biology. Nature. 438 (7067), 449-453 (2005).
  2. Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS One. 4 (5), 5553(2009).
  3. Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. Journal of Biological Engineering. 2, 5(2008).
  4. Peccoud, J., et al. A Modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. PLoS ONE. 6 (2), (2011).
  5. Sarrion-Perdigones, A., et al. GoldenBraid: an iterative cloning system for standardized assembly of reusable genetic modules. PLoS One. 6 (7), 21622(2011).
  6. Lee, M. E., DeLoache, W. C., Cervantes, B., Dueber, J. E. A Highly characterized yeast toolkit for modular, multipart assembly. ACS Synthetic Biology. 4 (9), 975-986 (2015).
  7. Andreou, A. I., Nakayama, N. Mobius assembly: A versatile Golden-Gate framework towards universal DNA assembly. PLoS One. 13 (1), 0189892(2018).
  8. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  9. Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
  10. Geu-Flores, F., Nour-Eldin, H. H., Nielsen, M. T., Halkier, B. A. USER fusion: a rapid and efficient method for simultaneous fusion and cloning of multiple PCR products. Nucleic Acids Research. 35 (7), 55(2007).
  11. de Kok, S., et al. Rapid and reliable DNA assembly via ligase cycling reaction. ACS Synthetic Biology. 3 (2), 97-106 (2014).
  12. Shao, Z., Zhao, H., Zhao, H. DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways. Nucleic Acids Research. 37 (2), 16(2009).
  13. Gibson, D. G. Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 37 (20), 6984-6990 (2009).
  14. Engler, C., et al. A golden gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synthetic Biology. 3 (11), 839-843 (2014).
  15. Gantner, J., et al. Peripheral infrastructure vectors and an extended set of plant parts for the Modular Cloning system. PLoS One. 13 (5), 0197185(2018).
  16. Ordon, J., et al. Generation of chromosomal deletions in dicotyledonous plants employing a user-friendly genome editing toolkit. Plant Journal. 89 (1), 155-168 (2017).
  17. Sarrion-Perdigones, A., et al. GoldenBraid 2.0: a comprehensive DNA assembly framework for plant synthetic biology. Plant Physiology. 162 (3), 1618-1631 (2013).
  18. Agmon, N., et al. Yeast Golden Gate (yGG) for the efficient assembly of S. cerevisiae transcription units. ACS Synthetic Biology. 4 (7), 853-859 (2015).
  19. Hernanz-Koers, M., et al. FungalBraid: A GoldenBraid-based modular cloning platform for the assembly and exchange of DNA elements tailored to fungal synthetic biology. Fungal Genetics and Biology. 116, 51-61 (2018).
  20. Prielhofer, R., et al. GoldenPiCS: a Golden Gate-derived modular cloning system for applied synthetic biology in the yeast Pichia pastoris. BMC Systems Biology. 11 (1), 123(2017).
  21. Celinska, E., et al. Gate Assembly system dedicated to complex pathway manipulation in Yarrowia lipolytica. Microbial Biotechnology. 10 (2), 450-455 (2017).
  22. Pullmann, P. K., et al. A modular two yeast species secretion system for the production and preparative application of fungal peroxygenases. bioRxiv. , (2020).
  23. Wu, D., Schandry, N., Lahaye, T. A modular toolbox for Golden-Gate-based plasmid assembly streamlines the generation of Ralstonia solanacearum species complex knockout strains and multi-cassette complementation constructs. Molecular Plant Pathology. 19 (6), 1511-1522 (2018).
  24. Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
  25. Iverson, S. V., Haddock, T. L., Beal, J., Densmore, D. M. CIDAR MoClo: Improved MoClo assembly standard and new E. coli part library enable rapid combinatorial design for synthetic and traditional biology. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 99-103 (2016).
  26. Vasudevan, R., et al. CyanoGate: A modular cloning suite for engineering cyanobacteria based on the plant MoClo syntax. Plant Physiology. 180 (1), 39-55 (2019).
  27. Leonard, S. P., et al. Genetic Engineering of bee gut microbiome acteria with a Ttoolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).
  28. Schwartz, M. L., Jorgensen, E. M. SapTrap, a toolkit for high-throughput CRISPR/Cas9 gene modification in Caenorhabditis elegans. Genetics. 202 (4), 1277-1288 (2016).
  29. Martella, A., Matjusaitis, M., Auxillos, J., Pollard, S. M., Cai, Y. EMMA: An extensible mammalian modular assembly toolkit for the rapid design and production of diverse expression vectors. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1380-1392 (2017).
  30. Chiasson, D., et al. A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific Reports. 9 (1), 10131(2019).
  31. Denby, C. M., et al. Industrial brewing yeast engineered for the production of primary flavor determinants in hopped beer. Nature Communications. 9 (1), 965(2018).
  32. Awan, A. R., et al. Biosynthesis of the antibiotic nonribosomal peptide penicillin in baker's yeast. Nature Communications. 8, 15202(2017).
  33. Leavitt, J. M., et al. Biosensor-Enabled Directed evolution to improve muconic acid production in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology Journal. 12 (10), (2017).
  34. Hsu, T. M., et al. Employing a biochemical protecting group for a sustainable indigo dyeing strategy. Nature Chemical Biology. 14 (3), 256-261 (2018).
  35. Grewal, P. S., Modavi, C., Russ, Z. N., Harris, N. C., Dueber, J. E. Bioproduction of a betalain color palette in Saccharomyces cerevisiae. Metabolic Engineering. 45, 180-188 (2018).
  36. Potapov, V., et al. Comprehensive profiling of four base overhang ligation fidelity by T4 DNA ligase and application to DNA assembly. ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2665-2674 (2018).
  37. Vazquez-Vilar, M., et al. Software-assisted stacking of gene modules using GoldenBraid 2.0 DNA-assembly framework. Methods in Molecular Biology. 1284, 399-420 (2015).
  38. Pullmann, P., et al. Mutagenesis: An efficient multi-site-saturation mutagenesis approach by Golden Gate cloning with automated primer design. Scientific Reports. 9 (1), 10932(2019).
  39. Engler, C., Sylvestre, M. DNA Cloning and Assembly Methods. Valla, S., Lale, R. 1116, Humana Press. Ch. 9 119-131 (2014).
  40. Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8, 91(2008).
  41. Chen, X., Zaro, J. L., Shen, W. C. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (10), 1357-1369 (2013).
  42. Mullis, K., et al. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 51, Pt 1 263-273 (1986).
  43. Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).
  44. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47 (1), 171-174 (2019).
  45. Ryan, O. W., et al. Selection of chromosomal DNA libraries using a multiplex CRISPR system. Elife. 3, (2014).
  46. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
  47. Heintz, N., Gong, S. Small-scale preparations of yeast DNA. Cold Spring Harbor Protocols. 2020 (10), (2020).
  48. Hochrein, L., Mitchell, L. A., Schulz, K., Messerschmidt, K., Mueller-Roeber, B. L-SCRaMbLE as a tool for light-controlled Cre-mediated recombination in yeast. Nature Communications. 9 (1), 1931(2018).
  49. Verwaal, R., et al. High-level production of beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae by successive transformation with carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous. Applied and Environmental Microbiology. 73 (13), 4342-4350 (2007).
  50. Jones, E., et al. The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Metabolism and Gene Expression. Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. 11, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. Regulation of amino acid and nucleotide biosynthesis in yeast 181(1982).
  51. Sehgal, N., et al. CRISPR gene editing in yeast: an experimental protocol for an upper-division undergraduate laboratory course. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (6), 592-601 (2018).
  52. Stepanenko, O. V., Stepanenko, O. V., Kuznetsova, I. M., Verkhusha, V. V., Turoverov, K. K. Sensitivity of superfolder GFP to ionic agents. PLoS One. 9 (10), 110750(2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Golden Gate CloningModular CloningMulti Gene AssemblyYeast MoClo KitType IIS EnzymesEntry Vector CloningTranscription Unit AssemblyFluorescent Protein ScreeningDH5 Alpha TransformationUV Transilluminator Screening

Related Articles