Целью этого протокола является предоставление подробного, пошагового руководства по сборке много генных конструкций с использованием модульной системы клонирования на основе клонирования Золотых Ворот. Он также дает рекомендации по важнейшим шагам для обеспечения оптимальной сборки на основе нашего опыта.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Быстрая сборка многофункциональных конструкций с использованием модульного клонирования Золотых Ворот
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Метод клонирования Золотых Ворот обеспечивает быструю сборку нескольких генов в любом пользовательском механизме. Он использует ферменты ограничения IIS типа, которые вырезают за пределами их сайтов распознавания и создают короткий свес. Эта модульная система клонирования (MoClo) использует иерархический рабочий процесс, в котором различные части ДНК, такие как промоутеры, последовательности кодирования (CDS) и терминаторы, сначала клонируются в вектор входа. Затем несколько векторов входа собираются в единицы транскрипции. Затем несколько единиц транскрипции соединяются с много генной плазмидой. Стратегия клонирования Золотых Ворот имеет огромное преимущество, поскольку позволяет без шрамов, направленной и модульной сборке в одной реакции. Иерархический рабочий процесс обычно позволяет легко клонировать большое разнообразие много генных конструкций без необходимости секвенирования за пределами векторов входа. Использование флуоресцентных белковых отсева обеспечивает легкий визуальный скрининг. Эта работа обеспечивает подробный, шаг за шагом протокол для сборки много генных плазмидов с использованием дрожжевой модульного клонирования (MoClo) комплект. Мы показываем оптимальные и неоптимальные результаты много генной плазмидной сборки и предоставляем руководство по скринингу для колоний. Эта стратегия клонирования в значительной степени применима для инженерии метаболизма дрожжей и других ситуаций, в которых требуется много генная плазмидная клонирование.
Введение
Синтетическая биология направлена на создание биологических систем с новыми функциональными возможностями, полезными для фармацевтической, сельскохозяйственной и химической промышленности. Сборка большого количества фрагментов ДНК с высокой пропускной способностью является основополагающим методом в синтетической биологии. Такой сложный процесс может разбиться на несколько уровней с уменьшением сложности, концепция заимствована из фундаментальных инженерныхнаук 1,2. В синтетической биологии фрагменты ДНК обычно собираются иерархически на основе функциональности: i) уровень части: "части" относятся к фрагментам....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол иерархического клонирования, предлагаемый в этом наборе инструментов, можно разделить на три основных этапа: 1. Плазмиды части клонирования; 2. единицы транскрипции клонирования (TUs); 3. Клонирование много генных плазмидов(рисунок 1). Этот протокол начинается с грунтовой конструкции и заканчивается применением клонированной много генной плазмиды.
1. Конструкция грунта для клонирования плазмиды части (pYTK001):
- Дизайн вперед и обратной грунтовки, содержащие фланговые нуклеотиды TTT на 5 ' конце, BsmBI сайт распознавания с дополнительным нуклеотидом (CGTCTCN), 4-нуклеотидов (nt) св....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Здесь результаты четырех репликационные многогенные плазмиды для β (желтый) и ликопин (красный) производства. Была построена одна интегративная многогенерная плазмида для нарушения локуса ADE2, колонии которой красные.
Клонирование CDS в вектор входа (pYTK001)
ERG20 был усилен из генома дрожжей и три каротеноидных генов crtE, crtYB, crtI от плазмидной pLM494
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Комплект клонирования на основе MoClo, разработанный Lee et al., обеспечивает отличный ресурс для быстрой сборки от одного до пяти единиц транскрипции в много генную плазмиду либо для репликации, либо для интеграции в геном дрожжей. Использование этого комплекта устраняет трудоемкое узкое место клонирования, которое часто существует для выражения нескольких генов в дрожжах.
Мы протестировали пять различных условий для пищеварения / лигации циклов клонирования Золотые ворота с T4 ДНК лигазы. Мы.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторов нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа финансировалась Научно-исследовательским фондом Для Государственного университета Нью-йорка (Награда No: 71272) и IMPACT Премии Университета в Буффало (Награда No: 000077).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,5 мм Стеклянные бусины | RPI исследовательские продукты | 9831 | Для лизирования дрожжевых клеток |
| Bacto Agar | BD & КР | 214010 | Компонент дрожжей полная синтетическая среда (CSM) |
| Bacto Peptone | BD& Компания | 211677 | Компонент дрожжевого экстракта пептона декстроза среда (YPD) |
| BsaI-HFv2 | New England Biolabs | R3733S | высокоэффективная версия фермента рестрикции BsaI |
| Карбенициллин | Биореагенты Фишера | 4800-94-6 | Антибиотик для скрининга на уровне единицы транскрипции |
| Хлорамфеникол | Биореагенты Фишера | 56-75-7 | Антибиотик для скрининга на вектор начального уровня |
| CSM-His | Sunrise Sciences | 1006-010 | Аминокислотная добавка полной синтетической среды дрожжей (CSM) |
| Dextrose | Fisher Chemical | D16-500 | Углеродный источник дрожжей полная синтетическая среда (CSM) |
| Difco Дрожжевые дрожжи Азотная основа без аминокислот | BD & Компания | 291940 | Источник азота дрожжей полная синтетическая среда (CSM) |
| dNTP mix | Promega | U1515 | dNTPs для ПЦР |
| Esp3I | New England Biolabs | R0734S | высокоэффективный изошизомер BsmBI |
| Frozen-EZ Дрожжевой траформирование II Kit Zymo | Research | T2001 | Для трансформации дрожжей |
| Hexanes | Fisher Chemical | H302-1 | Для выделения каротиноидов из дрожжевых клеток |
| Канамицин | Фишер Биореагенты | 25389-94-0 | Антибиотик для скрининга на мультигенном плазмидном уровне |
| LB Агар, Миллер | Фишер Биореагенты | BP1425-2 | Лизогенный агар среда для E. coli культивирование |
| LB Broth, Miller | Fisher Биореагенты | BP1426-2 | Лизогенная жидкая среда для E. coli |
| культивирование ликопина | Каймановы химикаты | NC1142173 | Для количественного определения ликопина |
| MoClo YTK | Addgene | 1000000061 | Лаборатория осаждения: John Deuber |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | New England Biolabs | T1010L | Для очистки плазмид от E.coli |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo | Scientific ND2000c | Для точного измерения концентраций ДНК |
| NotI-HF | New England Biolabs | R3189S | Фермент рестрикции для интегративной линеаризации мультигенной плазмиды |
| Nourseothricin Sulphate | Goldbio | N-500-100 | Antibiotic Selection marker для плазмиды pCAS, использованной в данном исследовании |
| Phusion HF Reaction Buffer (5X) | New England Biolabs | B0518S | Buffer for PCR с использованием полимеразы Phusion |
| Phusion Высокоточная ДНК-полимераза | New England Biolabs | M0530S | Высокоточная полимераза для всех ПЦР-реакций |
| pLM494 | Addgene | 100539 | Плазмида используется для амплификации crtI, crtYB и crtE, используемых в этом исследовании |
| Quartz Cuvette | Thermo Electron | 10050801 | для количественного определения каротиноидов |
| T4 лигаза | New England Biolabs | M0202S | Ligase for Golden Вентиляционный клонирование |
| Термоциклер | BIO-RAD | 1851148 | Для проведения всех реакций ПЦР и клонирования |
| Тканевый гомогенизатор | Bullet Blender | Модель: BBX24 | Для гомогенизации дрожжевых клеток |
| УФ-Вид спектрофотометр | Thermo Scientific | Genesys 150 | Для количественного определения каротиноидов |
| Экстракт дрожжей | Fisher Bioreagents | BP1422-500 | Компонент дрожжевого экстракта пептона декстрозы среды (YPD) |
| &бета;-каротина | Alfa Aesar | AAH6010603 | Для количественного определения β-каротина |
Ссылки
- Endy, D. Foundations for engineering biology. Nature. 438 (7067), 449-453 (2005).
- Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS One. 4 (5), 5553(2009).
- ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
