Методическая статья

Пошаговый посев клеток на тесселлированных каркасах для изучения прорастающего кровеносного сосуда

DOI:

10.3791/61995

⸱

14 января 2021 г.

 ,  ,  , 
1Faculty of Biomedical Engineering, Technion, 2Department of Chemical Engineering and Biointerfaces Institute, University of Michigan, Ann Arbor

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Инженерные ткани в значительной степени полагаются на правильные сосудистые сети для обеспечения жизненно важных питательных веществ и газов и удаления метаболических отходов. В этой работе протокол поэтапного посева эндотелиальных клеток и поддерживающих клеток создает высокоорганизованные сосудистые сети на высокопроизводительной платформе для изучения развития поведения сосудов в контролируемой 3D-среде.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сердечно-сосудистая система является ключевым игроком в физиологии человека, обеспечивая питание большинства тканей в организме; сосуды присутствуют в разных размерах, структурах, фенотипах и производительности в зависимости от каждой конкретной перфузированной ткани. Область тканевой инженерии, которая направлена на восстановление или замену поврежденных или отсутствующих тканей организма, опирается на контролируемый ангиогенез для создания правильной васкуляризации в инженерных тканях. Без сосудистой системы толстые инженерные конструкции не могут быть достаточно питательными, что может привести к гибели клеток, плохому приживлению и, в конечном счете, к отказу. Таким образом, понимание и контроль поведения инженерных кровеносных сосудов является выдающейся проблемой в этой области. В данной работе представлена высокопроизводительная система, позволяющая создавать организованные и воспроизводимые сети судов для изучения поведения судна в среде 3D-лесов. Этот двухэтапный протокол посева показывает, что сосуды в системе реагируют на топографию каркаса, представляя отличительные поведения прорастающего в зависимости от геометрии отсека, в котором находятся сосуды. Полученные результаты и понимание этой высокопроизводительной системы могут быть применены для того, чтобы информировать о лучших конструкциях 3D-биопечатных каркасов, в которых изготовление различных 3D-геометрий не может быть быстро оценено при использовании 3D-печати в качестве основы для клеточных биологических сред. Кроме того, понимание этой высокопроизводительной системы может быть использовано для улучшения быстрого скрининга лекарств, быстрого развития моделей кокультур и исследования механических стимулов на образование кровеносных сосудов для углубления знаний о сосудистой системе.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Область тканевой инженерии быстро прогрессирует в направлении изготовления инженерных конструкций для замены отсутствующих или поврежденных органов и тканей1. Тем не менее, полностью функциональные конструкции еще не достигнуты, отчасти потому, что создание операционных сосудистых сетей для питания тканей остается нерешенной проблемой. Без надлежащей васкуляризации инженерные ткани ограничиваются пассивным диффузионным транспортом кислорода и питательных веществ, ограничивая максимальную жизнеспособную толщину ткани до предела диффузии, примерно 200мкм2. Такие толщины не подходят для восстановления крупных дефектов тканей или для полного изготовления органов, что делает наличие функциональной сосудистой сети обязательным свойством для функциональных и имплантируемых тканей3.

Сосудистая система состоит из широкого спектра кровеносных сосудов с различными размерами, фенотипами и организацией, тесно связанными с тканью хозяина. Понимание поведения, реакции и миграционных решений, принимаемых развивающимися и прорастающими сосудами, может инструктировать их интеграцию в инженерныеткани 4. В настоящее время наиболее распространенным подходом к созданию сосудистых сетей in vitro является объединение эндотелиальных клеток (ЭК) с поддерживаючими клетками (СК, с возможностью дифференцировки в настенные клетки), посеянными в трехмерной микросреде. Эта среда обеспечивает химические и физические сигналы, позволяющие клеткам присоединяться, размножаться и самособираться в сосудистые сети2,5,6,7,8. При совместной культивации СК секретируют белки внеклеточного матрикса (ECM), обеспечивая механическую поддержку ЭК, которые образуют трубчатые структуры. Кроме того, перекрестное взаимодействие между обоими типами клеток способствует тубулогенезу, прорасти сосудов и миграции, в дополнение к созреванию и дифференцировке SCs в α гладкомышечные актин-экспрессирующие (αSMA) настенные клетки4. Развитие сети сосудов чаще всего изучается в 3D-средах, созданных с использованием гидрогелей, пористых полимерных каркасов или их комбинации. Последний вариант в равной степени обеспечивает дружественную к ячейкам среду и необходимую механическую поддержку как для ячеек, так и для ECM9.

Проведен большой объем работ по изучению сосудистого развития, включая совместное культивирование клеток на гидрогелях10,гидрогелях-каркасных комбинациях11,12, 2Dплатформах и микрофлюидных устройствах13. Однако гидрогели могут быть легко деформированы клеточнымисилами 14,в то время как 2D и микрофлюидные системы не могут воссоздать более близкую к природе среду для получения более экстраполяционируемого ответа15,16. Понимание того, как формирующиеся суда реагируют на окружающую их среду, может обеспечить критическое понимание, которое может позволить создать инженерные среды с возможностью предсказуемого руководства развитием судна. Понимание явлений сосудистого образования особенно важно, чтобы идти в ногу с быстрым появлением методов изготовления в масштабе субмикрона, таких как стереолитография, цифровая проекционная литография, непрерывное производство жидкого интерфейса, 3D-электроструйная запись, 3D-электроструйная запись на основе растворов и новые методы биопечати17,18,19,20,21. Согласование контроля этих методов микропроизводства с более глубокое понимание сосудистой биологии является ключом к созданию соответствующей инженерной сосудистой системы для ткани-мишени.

Здесь мы представляем 3D-систему для изучения реакции новых формирующихся и прорастающих сосудов на окружающую геометрию лесов, наблюдая за их происхождением ростков и последующей миграцией22. Используя 3D-каркасы с тесселяцией геометрии отсека и двухэтапную технику посева, нам удалось создать высокоорганизованные сосудистые сети четким и простым для анализа способом. Тесселяционная геометрия обеспечивает высокую пропускную способность системы с отдельными блоками, содержащими сосуды, которые реагируют на их локальную среду. Используя разноцветные ЭК, мы отслеживали происхождение образования ростков и последующие модели миграции, коррелировали с геометрией компартмента и расположением СК22.

Хотя предлагаемый протокол был подготовлен для анализа влияния геометрических сигналов на поведение васкуляризации, этот подход может быть расширен и применен к различным новым приложениям. Тесселлированный каркас и легко обизуемые сети позволяют проводить прямой анализ различных взаимодействий ЭК и СК, добавления специфических клеток органов и их взаимодействия с сосудистыми сетями, лекарственного воздействия на сосудистые сети и многого другого. Предлагаемая нам система имеет очень универсальные и простые результаты изготовления и обработки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Изготовление тесселированных лесов

ПРИМЕЧАНИЕ: Фотолитография является широко распространенным методом, который требует специализированного оборудования, обычно размещаемого в нанопроизводстве / лаборатории. Метод, изложенный в этом протоколе, был максимально обобщен для аудитории; однако могут потребоваться незначительные изменения в процедурах в зависимости от оборудования, доступного читателю. Мы рекомендуем выполнять эти процедуры в чистом помещении на объекте нанопроизводствия, чтобы обеспечить высочайшее качество процесса. Перед началом работы получите доступ к маске-элайнеру (или некоторой настройке УФ-экспозиции), спин-коатеру, конфоркам, станции промывки растворителем, фотомаске и плазменщику. Растворители и химические вещества, используемые в процедуре, опасны, поэтому, пожалуйста, примите все ост же, чтобы избежать какого-либо химического воздействия. При проектировании фотомаски определите, какого размера кремниевые пластины и фотомаски совместимы со спин-коатером и маской-элайнером. Кроме того, фоторезист, расположенный по краям кремниевой пластины, обычно деформируется при обработке; следовательно, сделайте конструкции в направлении центральной области пластины.

  1. Подготовьте строительные леса с помощью техники фотолитографии с выбранной геометрией, которая представляет интерес.
    1. Перед отжимным покрытием очистите кремниевую пластину. Это может быть сделано с помощью плазменной очистки или метода на основе растворителя. При плазменной очистке следуйте стандартной процедуре работы прибора для получения эксплуатационных деталей. Распылите сжатым газообразным азотом и осмотрите пластину, чтобы убедиться, что она свободна от мусора перед спиннинговым покрытием. Эта пластина будет служить подложкой, на которой создаются каркасы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов начните со свежей пластины. Пластины могут быть использованы повторно, но должны быть свободны от старого фоторезиста, дефектов поверхности и мусора. Полезно использовать вафельные пинцеты для обработки.
    2. Центруйте кремниевую пластину на отжимном патроне с помощью направляющей. Кратковременно вращайте пластину, чтобы убедиться, что она правильно центрирована на патроне, отрегулируйте по мере необходимости до правильного центрирования. Это необходимо делать каждый раз, когда пластина помещается на спин-коатер. Нанесите на пластину 1-4 мл подъемного реагента (это будет зависеть от размера пластины). Приблизительно 2 мл подъемного реагента хорошо работают для 4-дюймовой пластины.
      1. Установите скорость распространения спин-коатера на уровне 500 об/мин в течение 5 секунд, а скорость отжима до 1000 об/мин в течение 30 секунд, затем раскрутите взлетный реагент. Осмотрите пластину, чтобы убедиться, что она имеет равномерное покрытие по всей пластине. Любой мусор, оставшийся на пластине, будет очень очевиден в этот момент. Любые строительные леса в районе с мусором, скорее всего, будут непригодны для использования. После отжима покрытия переложить на конфорку и выпекать 1 минуту при 200 °C.
    3. Повторите предыдущий шаг еще два раза, чтобы покрыть в общей сложности три покрытия.
    4. Раскрутите кремниевую пластину с покрытием с подъемным реагентом фоторезистом SU-8 2050 до получения толщины около 100 мкм.
      1. Дозировать 1 мл резистика на каждые 25 мм диаметра подложки.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы избежать пузырьков при заливке резист. Для СУ-8 2050 хорошо работает заливка примерно круга диаметром 2 дюйма, при использовании 4-дюймовой кремниевой пластины.
      2. Спин-шуб СУ-8 2050. Разброс со скоростью 500 об/мин в течение 5 секунд, затем скорость отжима от 1700 до 1800 об/мин для достижения толщины примерно 100 мкм.
      3. Дополнительно:После прядения оставьте пластины с отжимным покрытием для дегаза на ночь на ровной поверхности, защищенной от света, перед предварительной выпечкой. Это может помочь избавить сопротивление от любых пузырьков и позволить дефектам выровнеться.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Фактическая толщина резистиса и результирующие каркасы могут варьироваться в зависимости от ошибки пользователя и параметров оборудования. Поэтому толщина строительных лесов должна быть проверена позже, на этапе 1.6. Соответствующим образом измените процедуры спинового покрытия для достижения желаемой толщины.
    5. Перед экспозицией предварительно выпекайте при 65 °C в течение 10 мин, а затем 95 °C в течение 40-50 мин. Перед воздействием протестируйте поверхность резистика, надавливая на край парой пинцетов, чтобы убедиться, что он больше не липкий / вязкий. Полезно вытащить пластину из конфорки и дать ей остыть в течение 0,5-1 мин, прежде чем оценивать липкость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Медленное время температурного наката (нагрев и охлаждение) может помочь предотвратить деформацию лесов.
  2. Подвергайте фоторезист воздействию ультрафиолетового света (350-400 нм) через фотомаску с энергией экспозиции 215-240мДж/см2 при толщине сопротивления 85 - 110 мкм. Обратитесь к рекомендациям производителя фоторезиста для рекомендуемых корреляций энергии и толщины экспозиции.
    1. Убедитесь, что экспозиция правильно откалибрована таким образом, чтобы энергия была проверена. Отрегулируйте время экспозиции по мере необходимости для достижения желаемой энергии воздействия. Кроме того, элайнеры масок могут допускать различные режимы воздействия: вакуумный контакт, жесткий контакт, мягкий контакт и бесконтактный контакт (конкретные условия могут варьироваться). Как правило, это влияет на разрешение и выравнивание функций. Авторы обычно использовали режим «жесткого контакта».
    2. Для небольших объектов или нескольких слоев, где выравнивание будет иметь значение, более тщательно рассмотрите режимы экспозиции и процедуры выравнивания маски. Обязательно учитывайте высоту резиста при регулировке значения толщины. Обратитесь к стандартным процедурам работы вашего маски-выравнивателя для получения подробной информации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конструкция фотомаски определяет размер строительных лесов, геометрию отсека и количество лесов, полученных на партию. Использование твердой стеклянной или кварцевой фотомаски даст самое высокое разрешение; однако для этих больших размеров (>10 мкм) обычно может использоваться мягкая полимерная прозрачная пленочные фотомаска. Использование пленок-фотомаски может привести к топографическим особенностям вдоль оси Z пор каркаса в результате более низкого разрешения признаков. Это потенциально может повлиять на поведение клеток. Проверьте требуемое разрешение, проконсультируйтесь с тем, кто создает фотомаску, чтобы убедиться, что желаемое разрешение достигнуто.
  3. Выпекайте сразу после воздействия ультрафиолета при 65 °C в течение 2-5 минут, а затем при 95 °C в течение 8-10 минут.
  4. Разработайте каркасы для удаления неразвитого сопротивления.
    1. Погружайте строительные леса с помощью небольшого объема раствора разработчика СУ-8 на 7-10 минут, чтобы растворить любое неразвитое сопротивление.
    2. Промыть изопропиловым спиртом (IPA).
    3. Сухая пластина со сжатым азотом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны во время шага 1.4, чтобы не вызвать преждевременного высвобождения каркасов. Для этого необходимы низкие объемы разработчика и бережное обращение.
  5. После разработки твердо выпекайте при 150 °C в течение 15 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После жесткой выпечки выключение конфорки, чтобы пластины остывали очень медленно, может быть выгодным для предотвращения деформации / скручивания окончательных лесов.
  6. Необязательно:После твердой выпечки и перед подъемом оцените толщину каркаса, так как каркасы все равно должны быть аккуратно приклеены к поверхности пластины. Для этой процедуры хорошо работает контактная профилометрия; однако можно использовать любой соответствующий метод.
  7. Снимите строительные леса с пластины.
    1. Погрузьте строительные леса в СУ-8 разработчика, чтобы заставить их немедленно снять пластину. Если строительные леса не поднимаются, осторожно отодвинуть леса парой вафель-пинцетов.
    2. Удалите лишний разработчик.
    3. Переложите строительные леса в новую емкость и погрузяйте в изопропиловый спирт. Смойте в IPA минимум 6 раз, чтобы убедиться, что все разработчики были удалены.
  8. Высушите каркасы на воздухе в течение как минимум недели перед использованием.

2. Фибронектиновое покрытие каркаса

  1. Для дезинфекции погрузочно погрузитесь в каркасы в 70% этанол (v/v) в течение как минимум 15 минут и промыть 2 раза в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) перед использованием.
    ВНИМАНИЕ: Леса Су-8 слабы и могут легко сломаться. Обработка рекомендуется с использованием тупых и изогнутых щипцов, и с ними следует обращаться с строжайшей осторожностью. Более легкое обращение может быть достигнуто путем погружения каркасов в жидкость, чтобы избежать электростатических взаимодействий между каркасами и поверхностью.
  2. Приготовьте разведение 50 мкг/мл фибронектина человека в PBS и покройте каркасы адсорбцией белка.
    1. Смешайте 1,5 мкл раствора фибронектина (1 мг/мл) с 28,5 мкл PBS на каждый посеянный каркас. Предпочтительно, готовить только одно разведение фибронектина, которое будет использоваться для всех каркасов, чтобы избежать ошибок пипетирования.
      1. Для 10 каркасов смешайте 15 мкл запасного раствора фибронектина в 285 мкл PBS, что составляет в общей сложности 300 мкл разведения фибронектина 50 мкг/мл.
    2. Поместите каркасы редко поверх гидрофобной поверхности (т.е. нетканевой культуры (nonTC) 10 см чашки) и покройте каждый каркас 30 мкл разведения фибронектина, приготовленного на этапе 2.2.1.
      ВНИМАНИЕ: Убедитесь, что в отсеках строительных лесов нет пузырьков. Если пузырьки присутствуют, их можно удалить, осторожно встряхнув каркас внутри капли или легким пипетированием.
    3. Замените крышку пластины и поместите покрытые фибронектином каркасы в инкубатор с температурой 37 °C и влажностью 100% в течение часа.
    4. После инкубации слегка промойте каркасы в PBS, чтобы удалить остатки фибронектина. Каркасы можно хранить в PBS при 4 °C в течение недели перед использованием.

3. Посев эндотелиальных клеток

  1. Готовят среду EC путем смешивания базальной среды с соответствующими ей компонентами набора среды, включая раствор антибиотика (Pen/Strep), фетальную бычий сыворотку (FBS) и добавки для роста эндотелиальных клеток, как указано производителем.
  2. Производят суспензию жировых микрососудистых эндотелиальных клеток человека (HAMEC) в среде ЕС с концентрацией 4 х10 6 клеток/мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация в реальном времени может быть выполнена, если используемые эндотелиальные клетки предварительно трансфектированы для экспрессии флуоресцентного белка или предварительно окрашены с использованием нетоксичного красителя цитоплазматической мембраны (далее называемого меченым ЭК).
  3. Используя щипцы, поместите один каркас с фибронектиновым покрытием на скважину на 24-скважинную плиту без TC.
  4. Покройте каждый каркас каплями 25 мкл суспензии HAMEC. Остерегайтесь не позволять суспензии стекать со каркаса, так как это может препятствовать адгезии клеток.
  5. Положите крышку на тарелку и поместите ее в инкубатор при 37 °C, 5% CO2 и 100% влажности. Дайте насиживать минимум 60 минут и максимум 90 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время инкубации размещение пластины на орбитальном шейкере внутри инкубатора улучшает прикрепление клеток к стенкам каркаса. Орбитальный шейкер должен быть установлен на частоту не более 5 об/мин.
  6. После инкубации заполните каждую скважину 700 мкл среды ЕС с помощью пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидайте увидеть ЭК на дне колодца, так как некоторые из ячеек не прикрепляются к каркасу и падают через пустоты каркаса.
  7. Инкубируют эндотелиализованные каркасы до тех пор, пока слияние ЭК не будет наблюдаться с помощью флуоресцентной микроскопии на стенках каркаса (при использовании меченых ЭК) или в течение 3 дней (при использовании немаркированных ЭК), что обеспечивает достаточно времени для достижения стечения ЭК. Меняйте среду через день.

4. Поддержка посева клеток и совместной культивирования

  1. Приготовьте среду стволовых клеток пульпы зубов (DPSC) (DPSCm), смешивая 500 мл модифицированной среды Eagle от Dulbecco с низким содержанием глюкозы (низкоглюковый DMEM), 57,5 мл FBS, 5,75 мл незаменимых аминокислот (NEAA), 5,75 мл GlutaMAX и 5,75 мл раствора пенициллина-стрептомицин-нистатина.
  2. Перенесите эндотелиализованные леса в новую 24-скважинную пластину, не связанную с TC, чтобы выбросить ЭК, прикрепленные к дну скважины, с помощью щипцов.
    1. Удалите все среды с текущей пластины с помощью пипетки 1 мл или вакуумного всасывания. Будьте осторожны, чтобы не наносить вакуум прямо на строительные леса.
    2. Поместите один каркас на скважину, предпочтительно в центре скважины, чтобы избежать попадания жидкости к стенам из-за воздействия поверхностного натяжения. Высушите область, окружающую строительные леса, легким вакуумом, но избегайте полного высыхания леса.
  3. Приготовьте суспензию DPSC в предварительном гелевом растворе фибрина.
    1. Разбавляют растворы тромбина и фибриногена ПБС до получения конечной концентрации 5 Ед/мл и 15 мг/мл соответственно.
    2. Приготовьте 8 x10 6 DPSC/mL суспензии в разбавлении тромбина 5 Ед/мл и распределите по отдельным эппендорфам 12,5 мкл указанной суспензии на каркас для посева.
    3. Установите пипетку 5-50 мкл (или аналогичную) на 12,5 мкл и заполните ее раствором фибриногена 15 мг/мл.
    4. Не снимая наконечника, установите пипетку на 25 мкл. Материал в наконечнике должен подняться и оставить пустой объем к отверстию наконечника.
    5. Медленно нажимайте кнопку плунжера, пока жидкость не достигнет отверстия наконечника, но не вытечет наружу. Удерживайте плунжер в этом положении и поместите наконечник в одну из микроцентрифужных трубок, содержащих клетки в тромбиновой суспензии, убедившись, что наконечник находится в контакте с жидкостью.
      ВНИМАНИЕ: Сшивание фибрина начнется сразу после контакта тромбина и фибриногена. Следующий шаг должен быть выполнен быстро.
    6. Осторожно отпустите кнопку плунжера и втяните суспензию ячейки в наконечник. Тщательно перемешайте оба материала, избегая образования пузырьков.
  4. Быстро распределяйте смешанные материалы поверх эндотелиализованного каркаса. Повторите предыдущие шаги для каждого каркаса, всегда меняя наконечники между применениями, чтобы избежать неожиданного образования фибринового геля внутри наконечника.
  5. Замените крышку пластины и высиживайте каркасы при 37 °C, 5% CO2 и 100% влажности в течение 30 минут.
  6. После инкубации заполните каждую скважину 1 мл 1:1 DPSC и эк-средой.
    1. Культуру на 1 неделю, меняя среду через день.
    2. Во время культивирования извлекают среду из колодца и изобравляют конструкции с помощью конфокального микроскопа в разные моменты времени для изучения развития сосудов или любого другого интересующих параметра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть выполнен только в том случае, если эксперимент выполняется с использованием помеченных ЭК. Для получения дополнительных разъяснений см. Шаг 6 - ПРИМЕЧАНИЕ.

5. Иммунофлуоресцентное окрашивание для характерных сосудистых маркеров

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги могут быть выполнены в тех же скважинах, где были культивированы конструкции. Очень важно всегда следить за тем, чтобы решения полностью покрывали строительные леса. Более того, по возможности, выполнение шагов на орбитальном шейкере рекомендуется, хотя и не обязательно.

  1. На 7-й день выбросьте муляж из скважин и промойте строительные леса, добавив PBS в скважины и удалив его с помощью вакуума.
  2. Зафиксируйте каркасы, добавив 4% параформальдегида в течение 20 минут. Стирайте в PBS 3 раза, по 5 минут на стирку.
  3. Пермеабилизируйте фиксированные ячейки, используя 0,3% Triton-X в PBS (v/v) в течение 15 минут. Стирайте в PBS 3 раза, по 5 минут на стирку.
  4. Приготовьте 5% бычоковый сывороточный альбумин (BSA) в блокирующем растворе PBS (с /в) и накройте каркасы. Оставить при комнатной температуре на 1 час.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все необходимые количества раствора будут зависеть от количества каркасов, которые будут окрашены. Подготовьте растворы по мере необходимости, сохраняя заявленные концентрации.
  5. Подготовьте и нанесите раствор для окрашивания первичных антител.
    1. Разбавляйте антитело против фактора Виллебранда против кролика (vWF) 1:150 и антитело против СМА мыши 1:50 в свежем блокирующем растворе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Могут использоваться другие маркеры эндотелиальных клеток, такие как CD31 или VE-Cadherin.
    2. Накройте каркасы раствором первичных антител и держите при 4 °C в течение ночи. Стирайте в PBS три раза, по 5 минут на стирку.
  6. Подготовьте и нанесите раствор для окрашивания вторичных антител.
    1. Разбавьте козье антимышье антитело Cy3 1:150 и козье анти-кролика Alexa-Fluor 488 1:400 в PBS.
    2. Накройте каркасы раствором вторичных антител и инкубировать в течение минимум 3 часов при комнатной температуре или при 4 °C в течение ночи. Мойте 3 раза в PBS, по 5 минут на стирку. Храните окрашенные каркасы в 0,3% PFA в PBS (v/v) в течение месяца.

6. Конфокальная визуализация каркасов и анализ развития сосудов

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги могут быть выполнены на фиксированных и окрашенных каркасах в выбранной конечной точке времени или, если использовались флуоресцентные клетки, в течение периода культивации клеток без необходимости прекращения эксперимента. Для последних рекомендуется устанавливать конкретные временные точки; в этой работе показан день 0 (до посева СК) и дни 1, 3, 5 и 7 после посева СК(рисунок 3А).

  1. Визуализируйте каркасы с помощью конфокального микроскопа с объективом 5X и зумом 0,5 и полным z-диапазоном каркаса. Это позволит захватить 9 отдельных отсеков для квадратной и круглой геометрии или 8 полных отсеков для шестиугольной геометрии. Изобразите флуоресцентный сигнал и проходящий свет, чтобы получить как структуру сети сосуда, так и геометриюотсека (рисунок 3A).
  2. Используя ImageJ (или любое другое программное обеспечение для обработки изображений), обрезать каждый отдельный отсек; для этого процесса актуальны только маркеры сосудистых сетей. Снимите все сосуды, не расположенные в зоне отсека. Создайте проекцию максимальной интенсивности и сохраните каждый отдельный обрезанный отсек в виде изображения TIFF.
    1. В ImageJ нажмите Файл > Открыть и выберите нужное изображение TIFF, содержащее несколько разделов. Изображение должно иметь, по крайней мере, два канала: флуоресцентную сеть сосудов и изображение пропускаемого света.
    2. На панели инструментов выберите инструмент выделения «Полигон». Выберите канал пропускаемого света. Нажмите на один из углов шестиугольного отсека, на границе раздела между областью отсека и стенкой каркаса, это запустит определение маски. Продолжайте нажимать на следующие углы в последовательном порядке, пока не будет выбран начальный угол, закрыв маску.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это объяснение относится к шестиугольнику. Если отсек квадратный или круглый, используйте инструменты «Прямоугольник» или «Овал» соответственно, чтобы создать соответствующую маску. Независимо от формы, всегда подгоняйте маску, чтобы следовать за внутренней стенкой каркаса.
    3. Нажмите «Анализ инструментов > > менеджера ROI». В менеджере ROI (ROI, область интереса) нажмите кнопку Добавить, чтобы сохранить созданную маску. Новая маска появится в левом боковом списке. Этот шаг позволяет анализу быть согласованным между различными изображениями.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В менеджере ROI можно сохранить файл со всеми созданными масками, нажав на Кнопку «Еще > Сохранить». В окне Сохранить выделенную область выберите имя и расположение, а затем сохраните ROI-файл. Чтобы получить маску, в менеджере ROI нажмите «Еще > Открыть» и выберите нужный файл .roi.
    4. Выберите изображение флуоресцентной сети сосуда и нажмите «Редактировать > «Очистить снаружи». Останется только изображение, содержащееся в маске, а остальное будет устранено.
    5. Открыв очищенное сетевое изображение, нажмите на Изображение > Дубликат. Во всплывающем окне Дубликат напишите имя изображения. Если выбран параметр Дублировать гиперстек, снимите его и нажмите кнопку ОК. Будет создано новое изображение, содержащее только обрезанные флуоресцентные сети сосудов.
    6. Сохраните обрезанное изображение, нажав на Файл > Сохранить как > Tiff. Выберите имя и каталог и нажмите кнопку ОК.
  3. Проанализируйте развитие сосудов на обрезанных изображениях.
    1. Загрузите и установите бесплатное аналитическое программное обеспечение AngioTool, которое предоставляет количественные инструменты для количественной оценки различных сосудистых параметров. Программное обеспечение можно получить по следующему адресу https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home.
    2. Установите значение масштаба изображений для получения результатов в миллиметровых единицах и загрузите изображение.
      1. Нажмите на вкладку Настройка и заполните Расстояние в пикселях и Расстояние в мм репрезентативными значениями из сделанных изображений. При использовании параметров изображения, упомянутых выше, значения для заполнения составляют 400 пикселей на 1 мм.
      2. Нажмите кнопку Открыть изображение и найдите интересуящем его изображение.
    3. Выберите параметры анализа для количественной оценки развития судна на вкладке Анализ.
      1. В поле Диаметр и интенсивность сосуда снимите флажок с любого присутствующего маркера из верхнего селектора диапазона и активируйте маркер, представляющий число 3.
      2. Под полем Диаметр и интенсивность сосуда на селекторе нижнего диапазона переместите маркер нижнего диапазона на 60 и оставьте высококлассного производителя на 255.
      3. Активируйте поле Удалить мелкие частицы и установите маркер на 100.
      4. В поле Сохранение настроеквыберите имя и расположение файла таблицы, в котором будут сохранены результаты, и нажмите кнопку Выполнить анализ. Если выбрано поле Сохранить результивное изображение, Angiotool сгенерирует и сохранит новое изображение jpeg, показывающее количественные параметры сети сосуда.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого выполненного анализа без изменения имени файла таблицы в нижней части файла будет добавлена новая строка с вновь полученными результатами.
  4. Организуйте данные и выполните статистический анализ.
    1. Для всех обработанных изображений выберите интересующих параметр из электронной таблицы (например, Общая длина сосуда и площадь сосуда)и введите их в программное обеспечение для статистического анализа для правильного изучения полученных результатов(рисунок 3C).

7. Покадровая визуализация для обнаружения происхождения прорастая и отслеживания миграции

  1. Альтернативно, культивируя каркасы в инкубаторе, как описано на этапе 4.6, установите культуральную камеру конфокального микроскопа на 37 °C, 5% CO2 и 100% влажность.
    1. Поместите пластину, содержащую полностью засеянные каркасы, в камеру конфокального микроскопа и установите параметры визуализации на желаемые значения.
    2. Установите интервал съемки изображения на 30 минут, а общее время съемки 72 часа. Это позволит запустить таймлапс полностью без необходимости среднего изменения.
      ВНИМАНИЕ: В случае, если требуется более длительная временная съемка, следует выполнить тщательную калибровку положения, чтобы иметь возможность получить исходное местоположение изображения, поскольку изменения среды требуют удаления пластины из конфокального инкубатора в стерильный биологический капюшон.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отделение ЭК от стенок каркаса и формирования трубчатых конструкций начнется в течение первого часа после посева СК (этап 4) и может занять до 50 часов. После первоначального образования труб новые ростки начнут мигрировать в отсек из окружающих сосудов. Проращивание и последующее ремоделирование сети будет продолжаться на протяжении всего эксперимента примерно до 10-го дня, когда сети сосудов станут стабильными22. Используйте эту информацию, чтобы выбрать начальную точку таймлапса и шаг времени соответственно.
  2. Сохраните файл фильма полного замедленного действия в виде последовательности TIFF.
  3. Откройте ImageJ и щелкните Файл > Импорт > последовательности изображений и выберите файлы. Это откроет вашу последовательность TIFF как фильм.
  4. Откройте плагин ручного отслеживания, нажав на Плагины > Ручное отслеживание. Откроется окно Отслеживание.
  5. Посмотрите фильм и выберите судно для отслеживания. Обратите внимание на его происхождение и миграцию.
  6. Активируйте поле Показать параметры и введите 30 минут для временного интервала. Калибровка x/y будет зависеть от количества пикселей, выбранного во время съемки.
  7. Приступайте к ручному отслеживанию прорастания сосудов от контура каркаса.
    1. Нажмите кнопку Добавить трек. На первом кадре фильма нажмите на местоположение судна, которое нужно отслеживать. После этого фильм автоматически сменится на следующий кадр.
    2. Нажмите на изображение второго кадра, где находится судно. Опять же, фильм автоматически изменится на следующий кадр.
    3. Продолжайте с тем же судном до тех пор, пока не будет завершено полное отслеживание миграции.
    4. В окне Отслеживание нажмите на Наложение точек и линий, чтобы отпечатать визуальный путь миграции судна на фильме. Откроется копия фильма с точкой, представляющей текущее положение трекера, и строкой, показывающей предыдущий путь.
    5. Нажмите кнопку End Track, чтобы завершить запись текущего движения судна.
    6. Нажмите кнопку «Добавить трек» еще раз, чтобы начать с нового судна. При этом линейные и точечные маркеры автоматически изменят свой цвет для нового судна. Повторяйте до тех пор, пока не будут отслежены все желаемые суда.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Местоположение x/y, скорость судна и расстояние перемещения можно получить из всплывающего окна Результаты. Каждое судно будет обозначено по номеру трека в самой левой колонке. Эти данные могут быть скопированы и вставлены в электронную таблицу для выполнения дальнейшего анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представленный протокол с использованием методов стереолитографии позволяет изготавливать тесселированные каркасы из фоторезиста СУ-8. Получены каркасы с отчетливой геометрией отсека (квадраты, шестиугольники и круги), а также высокоточные и воспроизводимые признаки(рисунок 1).

figure-results-1
Рисунок 1:

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Потребность в богатой сосудистой клетке внутри встроенных в инженерные ткани имеет решающее значение для выживания конструкции и правильной функции1. Хотя инженерия сосудистой системы была в центре внимания огромного количества исследований, многое осталось исследовать и понять24. В частности, при воссоздании конкретной ткани микроциркуляторное русло должно вести себя и организовывать соответственно12. Наиболее распространенным подходом к генерации м...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано финансированием Мичиганского университета - Израильского партнерства по исследованиям. Авторы хотели бы поблагодарить Ури Мердлера, Лиора Дебби и Галию Бен Дэвид за их большую помощь и поддержку, Надин Ванг, доктора философии, и Пилар Эррера-Фиерро, доктора философии Из Центра нанопроизводства Лурье в Мичиганском университете, а также Луиса Солорио, доктора философии, за просветительские дискуссии о методах фотолитографии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Angiotool freewareNIH-CCRСкачать бесплатно в https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home
Сыворотка бычьего альбумина ProbuminMillipore82-045-1
Стволовые клетки пульпы зубаLonzaPT-5025
ECM media + набор пульSciencell#1001
Этанол 96%Gadot-Group64-17-5
Фибриновый герметик EvicelJohnson& JohnsonEVB05ILПредоставляет растворы тромбина и фибриногена (BAC2)
GlutaMAXGibco35050061
Антитело к мышиному Cy3 у козыJackson115-166-072
Козье анти-кролик Alexa-Fluor 488Thermo- Fisher ScientificA11034
Жировые микрососудистые клетки человекаSciencell#7200
Человек фибронектинSigmaF0895-5MGСтоковая концентрация: 1 мг/мл
ImageJNIHСкачать бесплатно в https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Изопропиловый спиртGadot-Group67-63-0
Реагент для отрываKayaku Advanced Materials, IncG112850Коммерческое название Omnicoat
Low-glucose DMEMBiological Industries01-050-1A
Мышиное антитело к СМАDakoM0851
NEAAGibco11140068
Раствор параформальдегида 4% в PBSChemCruzSC-281692
Раствор пенициллин-стрептомицина-нистатинаBiological Industries03-032-1B
Фоспатный буферный физиологический раствор (PBS)SigmaP5368-10PAK
Антитело кролика против vWFAbcamab9378
Кремниевая пластинаSilicon Valley Microelectronics (SVM)Пластины 4", тип N-1-10, толщина 500-550 мкм
SU-8 2050 фоторезистKayaku Advanced Materials, IncY11058
SU-8 разработчикKayaku Advanced Materials, IncY020100
Tryton-X 100BioLab LTDNo 57836

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4), 300-311 (2011).
  2. Landau, S., Guo, S., Levenberg, S. Localization of Engineered Vasculature within 3D Tissue Constructs. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 2(2018).
  3. Griffith, C. K., et al. Diffusion Limits of an in Vitro Thick Prevascularized Tissue. Tissue Engineering. 11 (12), (2005).
  4. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
  5. Landau, S., et al. Tropoelastin coated PLLA-PLGA scaffolds promote vascular network formation. Biomaterials. 122, 72-82 (2017).
  6. Lesman, A., et al. Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs. Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).
  7. Richards, D., Jia, J., Yost, M., Markwald, R., Mei, Y. 3D Bioprinting for Vascularized Tissue Fabrication. Annals of Biomedical Engineering. 45 (1), 132-147 (2017).
  8. Levenberg, S., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nature Biotechnology. 23 (7), 879-884 (2005).
  9. Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks. Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).
  10. Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11, (2012).
  11. Gariboldi, M. I., Butler, R., Best, S. M., Cameron, R. E. Engineering vasculature Architectural effects on microcapillary-like structure self-assembly. PLOS ONE. 14 (1), 1-13 (2019).
  12. Blache, U., Guerrero, J., Güven, S., Klar, A. S., Scherberich, A. Microvascular Networks and Models, In vitro Formation. Vascularization for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. , 1-40 (2018).
  13. Wong, K. H. K., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. Microfluidic Models of Vascular Functions. Annual Review of Biomedical Engineering. 14 (1), 205-230 (2012).
  14. Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress. Biophysical Journal. 105 (10), 2240-2251 (2013).
  15. Pollet, A. M. A. O., den Toonder, J. M. J. Recapitulating the vasculature using Organ-on-Chip technology. Bioengineering. 7 (1), (2020).
  16. Hasan, A., et al. Microfluidic techniques for development of 3D vascularized tissue. Biomaterials. 35 (26), 7308-7325 (2014).
  17. Jordahl, J. H., et al. 3D Jet Writing: Functional Microtissues Based on Tessellated Scaffold Architectures. Advanced Materials. 30 (14), 1707196(2018).
  18. Gauvin, R., et al. Microfabrication of complex porous tissue engineering scaffolds using 3D projection stereolithography. Biomaterials. 33 (15), 3824-3834 (2012).
  19. Coscoy, S., et al. Microtopographies control the development of basal protrusions in epithelial sheets. Biointerphases. 13 (4), 041003(2018).
  20. Kaplan, B., et al. Rapid prototyping fabrication of soft and oriented polyester scaffolds for axonal guidance. Biomaterials. , (2020).
  21. Steier, A., Muñiz, A., Neale, D., Lahann, J. Emerging Trends in Information-Driven Engineering of Complex Biological Systems. Advanced Materials. 31 (26), 11806898(2019).
  22. Szklanny, A. A., et al. High-Throughput Scaffold System for Studying the Effect of Local Geometry and Topology on the Development and Orientation of Sprouting Blood Vessels. Advanced Functional Materials. , 1901335(2019).
  23. Welti, J., Loges, S., Dimmeler, S., Carmeliet, P. Recent molecular discoveries in angiogenesis and antiangiogenic therapies in cancer. Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3190-3200 (2013).
  24. Gui, L., Niklason, L. E. Vascular Tissue Engineering: Building Perfusable Vasculature for Implantation. Current Opinion in Chemical Engineering. 3, 68-74 (2014).
  25. Blache, U., Ehrbar, M. Inspired by nature: Hydrogels as versatile tools for vascular engineering. Advances in Wound Care. 7 (7), 232-246 (2018).
  26. Cochrane, A., et al. Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).
  27. Nemani, K. V., Moodie, K. L., Brennick, J. B., Su, A., Gimi, B. In vitro and in vivo evaluation of SU-8 biocompatibility. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 33 (7), 4453-4459 (2013).
  28. Mathew, R., Ravi Sankar, A. A Review on Surface Stress-Based Miniaturized Piezoresistive SU-8 Polymeric Cantilever Sensors. Nano-Micro Letters. 10 (2), 1-41 (2018).
  29. Knowlton, S., Yenilmez, B., Anand, S., Tasoglu, S. Photocrosslinking-based bioprinting: Examining crosslinking schemes. Bioprinting. 5, 10-18 (2017).
  30. Redd, M. A., et al. Patterned human microvascular grafts enable rapid vascularization and increase perfusion in infarcted rat hearts. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
  31. Zhu, Y., et al. SU-8 Photoresist. Encyclopedia of Nanotechnology. , 2530-2543 (2012).
  32. Zheng, F., et al. Organ-on-a-Chip Systems: Microengineering to Biomimic Living Systems. Small. 12 (17), 2253-2282 (2016).
  33. Freiman, A., et al. Adipose-derived endothelial and mesenchymal stem cells enhance vascular network formation on three-dimensional constructs in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 5(2016).
  34. van Duinen, V., et al. Perfused 3D angiogenic sprouting in a high-throughput in vitro platform. Angiogenesis. 22 (1), 157-165 (2019).
  35. Nguyen, D. -H. T., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (17), 6712-6717 (2013).
  36. Nashimoto, Y., et al. Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device. Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).
  37. Rosenfeld, D., et al. Morphogenesis of 3D vascular networks is regulated by tensile forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3215-3220 (2016).
  38. Neto, F., et al. and TAZ regulate adherens junction dynamics and endothelial cell distribution during vascular development. bioRxiv. , 174185(2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SU 8

Похожие статьи