Методическая статья

Изготовление магнитных платформ для микрон-масштабной организации взаимосвязанных нейронов

4.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62013

⸱

14 июля 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics, Bar-Ilan University, 2Faculty of Engineering, Bar-Ilan University, 3Department of chemistry, Bar-Ilan University, 4The Institutes of Nanotechnology & Advanced Materials, Bar-Ilan University

В этой статье

Краткое содержание

В данной работе представлен восходящий подход к проектированию локальных магнитных сил для управления организацией нейронов. Нейроноподобные клетки, загруженные магнитными наночастицами (MNPs), покрыты сверху и контролируются микроструктурированной платформой с перпендикулярной намагниченностью. Также описаны магнитные характеристики, поглощение клеток MNP, жизнеспособность клеток и статистический анализ.

Аннотация

Способность направлять нейроны в организованные нейронные сети имеет большое значение для регенеративной медицины, тканевой инженерии и био-сопряжения. Многие исследования были направлены на направление нейронов с использованием химических и топографических сигналов. Однако отчеты об организационном контроле в микроном масштабе над большими площадями скудны. Здесь был описан эффективный метод размещения нейронов в заданных местах и управления нейронным выростом с разрешением в микроновом масштабе с использованием магнитных платформ, встроенных в микроструктурированные магнитные элементы. Было продемонстрировано, что загрузка нейронов магнитными наночастицами (MNPs) превращает их в чувствительные магнитные единицы, на которые могут влиять магнитные градиенты. Следуя этому подходу, была изготовлена уникальная магнитная платформа, на которой клетки PC12, общая нейроноподобная модель, были покрыты и загружены суперпарамагнитными наночастицами. Тонкие пленки ферромагнитных (FM) многослойных (FM) со стабильной перпендикулярной намагниченностью были нанесены для обеспечения эффективных сил притяжения к магнитным паттернам. Эти ячейки PC12, нагруженные MNP, покрытые и дифференцированные на магнитных платформах, были предпочтительно прикреплены к магнитным паттернам, а рост нейритов был хорошо выровнен с формой шаблона, образуя ориентированные сети. Представлены методы количественной характеристики магнитных свойств, поглощения клеточного MNP, жизнеспособности клеток и статистического анализа результатов. Этот подход позволяет контролировать формирование нейронных сетей и улучшает интерфейс нейрон-электрод посредством манипулирования магнитными силами, что может быть эффективным инструментом для исследований сетей in vitro и может предложить новые терапевтические направления биосовмещивания.

Введение

Микроструктурирование нейронов обладает большим потенциалом для регенерации тканей1,2,3,4,5 и развития нейроэлектронных устройств6,7,8. Однако микрон-масштабное позиционирование нейронов при высоком пространственном разрешении, как в биологических тканях, представляет собой значительную проблему. Формирование заранее спроектированных структур в этом масштабе требует руководства процессами нервных клеток путем локального контроля подвижности сомы и роста аксональных образований. Предыдущие исследования предполагали использование химических и физических сигналов9,10,11,12 для управления ростом нейронов. Здесь новый подход фокусируется на управлении позиционированием ячеек с помощью градиентов магнитного поля13,14,15,16,17,превращая ячейки, загруженные MNPs, в магнитно-чувствительные блоки, которыми можно дистанционно манипулировать.

Kunze et al., которые охарактеризовали силу, необходимую для индуцирования клеточных реакций с использованием магнитных чип- и MNP-нагруженных ячеек, доказали, что раннее аксональное удлинение может быть вызвано механическим напряжением внутри ячеек18. Tay et al. подтвердили, что микрофабрикованные подложки с усиленными градиентами магнитного поля позволяют проводить беспроводную стимуляцию нейронных цепей, дозированных МНП с использованием кальциевых индикаторных красителей19. Более того, Tseng et al. объединили наночастицы внутри клеток, что привело к локализованным наночастицам-опосредованным силам, которые приблизились к клеточному напряжению20. Это привело к изготовлению определенных паттернов микромагнитных подложек, которые помогли изучить клеточный ответ на механические силы. Клеточное напряжение, возникающее при приложении локализованных сил, опосредованных наночастицами, достигалось путем объединения наночастиц внутри клеток20. Комплементарная металлооксидная полупроводниковая (КМОП)-микрофлюидная гибридная система была разработана Ли и др., которые внедрили массив микроэлектромагнитов в КМОП-чип для управления движением отдельных ячеек, помеченных магнитными шариками21.

Alon et al. использовали микромасштабные, предварительно запрограммированные, магнитные площадки в качестве магнитных «горячих точек» для определения местоположения клеток22. Специфическая активность также может быть стимулирована внутри клеток с использованием микроструктурированных магнитных массивов для локализации наночастиц в определенных субклеточных местах23. Клеточное поглощение MNP было успешно продемонстрировано в первичных нейронах пиявок, крыс и мышей24,25,26. Здесь это было продемонстрировано на клеточной линии феохромоцитомы крыс PC12, которая, как сообщалось ранее, показывает высокое поглощение MNPs27. В последние годы существуют различные медицинские применения МП, включая доставку лекарств и термотерапию в лечении рака28,29,30,31. В частности, исследования касаются применения МНП и нейронных сетей32,33,34,35. Однако магнитная организация нейронов с использованием МНФ на одноклеточном уровне заслуживает дальнейшего изучения.

В этой работе был описан подход «снизу вверх» для создания локальных магнитных сил через заранее спроектированные платформы для управления расположением нейронов. Представлено изготовление микроновых узоров FM-многослойных. Эта уникальная многослойная структура FM создает стабильную перпендикулярную намагниченность, которая приводит к эффективным силам притяжения ко всем магнитным паттернам. Посредством инкубации МНП загружались в ячейки PC12, превращая их в магниточувствительные единицы. MNP-нагруженные ячейки, покрытые и дифференцированные на магнитных платформах, были предпочтительно прикреплены к магнитным паттернам, а нейритовый рост был хорошо выровнен с формой шаблона, образуя ориентированные сети. Было описано несколько методов для характеристики магнитных свойств МНОГОСЛОЙНЫХ FM-матриц и МНП, а также были представлены методы анализа клеточного поглощения MNP и жизнеспособности клеток. Дополнительно детализированы морфометрические параметры роста нейронов и статистический анализ результатов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все биологические реакции в шкафу биобезопасности.

1. Изготовление магнитной платформы

  1. литография
    1. Разрежьте стеклянные слайды на 2 х2 см2 с помощью ручки писца. Очистите стекло ацетоном, а затем изопропанолом в течение 5 минут каждый в ультразвуковой ванне. Сушка со сверхвысокой чистотой (UHP) азота.
    2. Покрывать стекло фоторезистом с помощью спин-покрытия при 6000 об/мин в течение 60 с, чтобы достичь толщины 1,5 мкм, и выпекать при 100 °C в течение 60 с. Подвергайте образец воздействию источника света, используя подходящую длину волны для фоторезиста, с желаемым рисунком, используя фотомаску или литографию без маски.
    3. Разработать в течение 40 с в разработчике, разбавленный в дистиллированной воде (DW) согласно инструкции производителя; промыть в DW в течение 45 с, и высушить газообразным азотом UHP. Осмотрите рисунок под оптическим микроскопом.
  2. Напыляемое осаждение
    1. Вставьте образец в основную камеру системы осаждения и дождитесь базового давления (~5 × 10-8 Torr). Открыть поток газа; в настоящем описании задан поток аргона для стандартного распыления (28 sccm [стандартный кубический см в минуту). Воспламените мишени для напыления, затем установите давление напыления на 3 мТорр.
    2. Увеличивайте мощность на каждой цели до тех пор, пока не будет достигнута желаемая скорость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Pd Скорость: 0,62 А/с = 1,0 нм за 16 с; Co80Fe20 Скорость: 0,32 А/с, 0,2 нм за 6,25 с.
    3. Включите вращение. Нанесите многослойный FM-генератор, чередующийся между целями Co80Fe20 и Pd, открывая и закрывая целевые затворы соответственно. Нанесите 14 бислоев Co80Fe20 (0,2 нм)/Pd (1,0 нм) и завершите дополнительным слоем укупорки 2 нм Pd.
    4. Взлет: Замочите образец в ацетоне на 30 минут и промойте изопропанолом. Затем высушите азотом UHP и храните образец в чистой и сухой среде до использования.

2. Характеристика магнитного устройства с помощью транспортных измерений

  1. Используйте Si-подложку или стеклянную засыподвижную стеклянную направляющим с крестообразным магнитным стержнем шириной 100 мкм, нанесенную многослойными FM-вставками (см. рисунок 1C). Прикрепите образец к держателю с помощью двусторонней ленты.
  2. Используя проволочный склеиватель, прикрепить 4 провода к образцу, по одному на каждой ножке поперечного электрода. Установите держатель образца и образец внутри транспортной измерительной системы с магнитным полем таким образом, чтобы магнитное поле было перпендикулярно образцу. Выполняйте измерения при комнатной температуре.
  3. Выполняют измерение поперечного напряжения (ВТл)прибора; следовать маркировке на фиг.1С (вставка): подать ток 1 мА между контактами 1 и 3; измерить VT между контактами 2 и 4; затем подайте ток от 2 до 4 и измерьте напряжение между 1 и 3. Наконец, рассчитайте разницу между напряжениями обоих измерений и разделите на 2, чтобы получить VT. Используйте систему переключения для автоматического переключения между двумя конфигурациями измерений.
  4. Размахайте магнитное поле от 0,4 Тл до -0,4 Тл с шагом 5 мТл и измеряйте VТ как функцию поля. Постройте поперечное сопротивление (VT/I) против магнитного поля для определения аномального сигнала Холла, который пропорционален перпендикулярной намагниченности в пленке.

3. Характеристика МНП и магнитных многослойных магнитометрических измерений

  1. Магнитометрические измерения для FM-многослойных
    1. Нанесите FM-многослойный на si-подложку (см. раздел 1.2). Разрежьте образец на 6 квадратов размером 4 х 4 мм2. Укладывайте образцы один на другой и расположите их в капсуле перпендикулярно направлению магнитного поля (см. вставку на рисунке 1D).
    2. Вставьте капсулу в магнитометр и измерьте намагниченность при комнатной температуре. Развертка магнитного поля между -0,4 Тл и 0,4 Тл.
    3. Рассчитайте общий объем магнитного материала, учитывая толщину магнитного слоя, размер образцов и количество подложек. Разделите намагниченность на общий объем магнитного материала.
    4. График намагниченности (на единицу объема) против магнитного поля. Вычтите диамагнитный фон подложки из высокой реакции магнитного поля и экстраполируют насыщенную намагниченность FM из графика.
  2. Магнитометрические измерения для МНП
    1. Вставьте обозначенную массу МНП в капсулу из синтетического полимера. Учитывайте больший объем при измерении небольших значений насыщения намагниченности.
    2. Если MNPs суспензированы в растворителе, высушите MNPs, оставив капсулу открытой на ночь. Вставьте капсулу в магнитометр и измерьте намагниченность при комнатной температуре. Развертка магнитного поля между -0,2 Тл и 0,2 Тл.
    3. Рассчитайте общую массу МНП путем умножения указанного объема на концентрацию частиц. Нормализуют результаты до 1 г.
    4. График нормализованной намагниченности (на грамм) по сравнению с магнитным полем. Экстраполировать насыщенность намагниченности МП из графика.

4. Протокол коллагенового покрытия

  1. Покрытие пластиковой посуды
    1. Готовят 0,01 М HCl, добавляя 490 мкл HCl к 500 мл автоклавной двойной дистиллированной воды (DDW).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте этот шаг только в химической вытяжке.
    2. Разбавляют коллаген типа 1 (раствор из крысиного хвоста) 1:60-1:80 в 0,01 М HCl для получения конечной рабочей концентрации 50 мкг/мл. Поместите 1,5 мл разбавленного раствора в 35 мм культурную посуду. Оставьте блюдо в вытяжке на 1 ч, накрыв.
    3. Удалите раствор и промыть 3x в стерильном 1x фосфат-буферном физиологическом растворе (PBS). Блюдо готово к посеву клеток.
  2. Покрытие стеклянных слайдов
    1. Разбавляют коллаген типа 1 (раствор из крысиного хвоста) 1:50 в 30% v/v этанола. Для покрытия тарелки толщиной 35 мм добавьте 20 мкл коллагена в 1 мл 30% этанола.
    2. Накройте блюдо раствором и подождите, пока весь раствор испарится, оставив посуду непокрытой на несколько часов. Промыть 3x в стерильном 1x PBS; стеклянная горка готова к посеву клеток.

5. Поглощение и жизнеспособность сотового MNP

  1. Поглощение MNP сотовой связью
    1. Подготовьте основную питательную среду для клеточной культуры PC12, добавив 10% конской сыворотки (HS), 5% фетальной бычий сыворотки (FBS), 1% L-глутамина, 1% пенициллина / стрептомицина и 0,2% амфотерицина в среду Медицинского института Розуэлл Парк (RPMI) и фильтруйте с использованием нейлонового фильтра 0,22 мкм.
    2. Добавьте 1% конской сыворотки (HS), 1% L-глутамина, 1% пенициллина / стрептомицина и 0,2% амфотерицина в среду RPMI для приготовления дифференцировочной среды PC12 и фильтруйте с помощью нейлонового фильтра 0,22 мкм.
    3. Выращивать клетки в необработанной культуральная колба с 10 мл основной питательной среды; добавляйте в колбу 10 мл основной питательной среды каждые 2-3 дня, а через 8 дней подкультурайте клетки.
    4. Для клеточного поглощения центрифугируют клеточную суспензию в центрифужной трубке в течение 8 мин при 200 × г и комнатной температуре и выбрасывают супернатант.
    5. Повторно суспендирует клетки в 3 мл свежей основной питательной среды. Опять же, центрифугируют клеточную суспензию в течение 5 мин при 200 × г и комнатной температуре и выбрасывают супернатант. Повторно суспендируют клетки в 3 мл свежей дифференцированной среды.
    6. Аспирировать клетки 10 раз, используя шприц и иглу, чтобы разбить кластеры клеток. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и посейте 106 клеток в обычную тарелку без плаще 35 мм.
    7. Добавьте в блюдо расчетный объем суспензии MNP и объем дифференцировальной среды для достижения желаемой концентрации MNP и общего объема. Смешайте клетки, МНП и дифференцировочную среду; инкубировать блюдо в 5% CO2 увлажненный инкубатор при 37 °C в течение 24 ч.
    8. Центрифугируют клеточную суспензию в течение 5 мин при 200 × г при комнатной температуре и выбрасывают супернатант. Повторно суспендируют клетки в 1 мл свежей дифференцировки и подсчитывают клетки с помощью гемоцитометра.
  2. Дифференцировка нагруженных Ячеек
    1. Выполните протокол поглощения (раздел 5.1). Семена 8 × 104 MNP-нагруженных клеток на блюде с коллагеновым покрытием типа l 35 мм в присутствии дифференцировочной среды (см. протокол коллагенового покрытия в разделе 4.1). Через 24 ч добавляют 1:100 свежего мышиного фактора роста бета-нерва (β-NGF) (конечная концентрация 50 нг/мл).
    2. Обновляйте дифференцировочную среду и добавляйте свежий мышиный β-NGF каждые 2 дня. Снимок клеток каждые 2 дня с помощью оптической микроскопии. После формирования сети (6-8 дней для клеток PC12) визуализируют клетки с помощью конфокальной микроскопии и наблюдают флуоресценцию частиц.
  3. Анализ жизнеспособности для MNP-нагруженных ячеек: тест жизнеспособности клеток 2,3-бис-(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-2H-тетразолий-5-карбоксанилид (XTT).
    1. Подготовьте основную питательную среду согласно шагу 5.1.1. Культивируют клетки PC12 с МНП в различных концентрациях (0,1 мг/мл, 0,25 мг/мл и 0,5 мг/мл в основной питательной среде), а также без МНП для контроля в трех количествах в плоской 96-скважинной пластине (общий объем 100 мкл/скважина). Инкубируют клетки в течение 24 ч в 5% CO2,увлажненный инкубатор при 37 °C.
    2. Подготовьте заготовки колодцев, содержащие среду без ячеек, для коррекции фона. Разморозить раствор реагента XTT и реакционный раствор, содержащий N-метилдибензопиразин метилсульфат) в ванне с 37 °C непосредственно перед применением. Осторожно закручивайте до получения прозрачных растворов.
    3. Для одной 96-скважинной пластины смешайте 0,1 мл активационного раствора с 5 мл реагента XTT. Добавляют в каждую скважину 50 мкл реакционного раствора, слегка встряхивают пластину для равномерного распределения красителя в скважинах, а затем инкубируют пластину в инкубаторе в течение 5 ч.
    4. Измерьте поглощение образца по отношению к пустым скважинам с помощью считывателя иммуноферментного анализа (ИФА) на длине волны 450 нм. Измерьте эталонное поглощение, используя длину волны 630 нм, и вычтите ее из измерения 450 нм.
    5. Поскольку незначительная самопроизвольный абсорбентность происходит в культурической среде, инкубированной с реагентом XTT при 450 нм, вычтите среднюю абсорбентность заготовок из поглощения других скважин. Вычтите значения сигнала из параллельных образцов МНП при тех же проверенных концентрациях, что и образцы клеток.
  4. Анализ жизнеспособности для Ямно-нагруженных ячеек: тест жизнеспособности клеток на основе ресазурина
    1. Подготовьте базовую питательную среду в соответствии с этапом 5.1.1. Культивируют клетки PC12 с MNPs в различных концентрациях (0,1 мг/мл, 0,25 мг/мл и 0,5 мг/мл в основной питательной среде) и без МНПц в качестве контроля в трехместном виде в плоской 96-колодезной пластине в течение 24 ч. Инкубируют клетки в течение 24 ч в 5% CO2 инкубаторе при 37 °C. Подготовьте пустые колодцы, содержащие среду без ячеек.
    2. Промывайте ячейки с 1x PBS. Добавляют реагент на основе реазурина (10% мас./об.) в среду и инкубируют в течение 2 ч в инкубаторе при 37 °C.
    3. Поместите 150 мкл аликвот образцов в считыватель ИФА и измерьте поглощение при длине волны возбуждения 560 нм и длине волны излучения 590 нм. Вычтите значения сигнала из параллельных образцов МП при тех же проверенных концентрациях, что и образцы клеток.

6. Характеристика концентрации MNP внутри клеток с использованием индуктивно связанной плазмы (ICP)

  1. Подготовьте базовую питательную среду в соответствии с этапом 5.1.1. Культивируют клетки PC12 с МНП в различных концентрациях (0,1 мг/мл, 0,25 мг/мл и 0,5 мг/мл в основной питательной среде) и без МНП в качестве контроля в трехместном виде в плоской 96-скважинной пластине (общий объем 100 мкл/скважина). Инкубируют в 5% CO2,увлажненный инкубатор при 37 °C в течение 24 ч.
  2. Переложите суспензию в центрифужную трубку (из каждой скважины отдельно), ячейки центрифуги при 200 × г в течение 5 мин при комнатной температуре и выбросьте супернатант. Повторно суспендируют клетки в 1 мл свежей дифференцировки и подсчитывают клетки с помощью гемоцитометра.
  3. Лизировать клетки путем обработки 100 мкл 70% азотной кислоты в каждую скважину отдельно в течение не менее 15 мин. Добавьте 5 мл DDW в лизированные ячейки и отфильтруйте растворы.
  4. Измерьте концентрацию железа с помощью ВЧД и используйте количество клеток для записи концентрации Fe на клетку.

7. Дифференцировка и рост клеток на магнитной платформе

  1. Очистите узорчатую подложку 70% v/v/ этанолом и поместите субстрат в 35 мм культурную чашку в вытяжке. Поместите большой магнит (~ 1500 Oe) под узорчатую подложку на 1 мин и извлеките магнит, сначала переместив тарелку вверх и прочь от магнита, а затем выньте магнит из вытяжки. Включите ультрафиолет на 15 минут.
  2. Покрыть субстрат коллагеном типа 1 в соответствии с разделом 4.2. Приостановить клетки после поглощения клеточного MNP (раздел 5.1), посеять 105 клеток в 35 мм культурального блюда и добавить 2 мл дифференцированной среды. Инкубируют культуру в 5% CO2,увлажненный инкубатор при 37 °C.
  3. Через 24 ч добавить 1:100 свежих мышиных β-NGF (конечная концентрация 50 нг/мл). Обновляйте дифференцировочную среду и добавляйте свежий мышиный β-NGF каждые 2 дня. Снимайте клетки каждые 2 дня с помощью световой микроскопии, а после формирования сети выполняйте иммуноокрашивание клеток (раздел 8.1).

8. Окрашивание нагруженных ячейками MNP

  1. Иммуноокрашивание тубулина
    1. Приготовьте 4% раствор параформальдегида (PFA), смешивая 10 мл 16% мас./об.раствора PFA, 4 мл 10x PBS и 26 мл DDW. Приготовьте 50 мл 1% PBT, добавив 500 мкл неионного поверхностно-активного вещество к 50 мл 1x PBS. Приготовьте 50 мл 0,5% PBT, смешав 25 мл 1% PBT с 25 мл 1x PBS. Готовят блокирующий раствор, смешивая 1% бычий сывороточный альбумин и 1% нормальную ослиную сыворотку в 0,25% ПБТ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте PFA только внутри химического капота.
    2. Удалите надмную среду из клеток. Зафиксируйте MNP-нагруженные ячейки в 4% PFA в течение 15 мин при комнатной температуре внутри химической вытяжки. Промывайте MNP-нагруженные ячейки 3x в 1x PBS, по 5 мин каждая стирка, внутри химической вытяжки.
    3. Пермеабилизируйте MNP-нагруженные ячейки 0,5% PBT в течение 10 мин. Инкубируют MNP-нагруженные клетки сначала в блокирующем растворе в течение 45 мин при комнатной температуре, а затем с антителом против α-тубулина кролика в блокирующем растворе на ночь при 4 °C. Мойте MNP-нагруженные ячейки 3x в 1x PBS, по 5 мин каждая стирка.
    4. Инкубировать MNP-нагруженные клетки с Cy2-конъюгированным ослиным анти-кроликовым вторичным антителом в течение 45 мин в темноте и при комнатной температуре. Мойте MNP-нагруженные ячейки 3x в 1x PBS, по 5 мин каждая стирка.
    5. Выполняйте конфокальные изображения. Для тубулина используют длину волны возбуждения 492 нм и длину волны излучения 510 нм. Для МП (родамин) используют длину волны возбуждения 578 нм и длину волны излучения 613 нм.
  2. Ядерное окрашивание 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI)
    1. Мойте MNP-нагруженные ячейки 3x в 1x PBS, по 5 мин каждая стирка. Удалите избыток жидкости вокруг образца, добавьте 1 каплю (~50 мкл) монтажной среды, содержащей DAPI, чтобы покрыть площадь 22 мм х 22 мм, и инкубировать в течение 5 минут в темноте и при комнатной температуре.
    2. Мойте MNP-нагруженные ячейки 3x в 1x PBS, по 5 мин каждая стирка. Выполняйте конфокальные изображения. Для DAPI используйте длину волны возбуждения 358 нм и длину волны излучения 461 нм. Для МП (родамин) используют длину волны возбуждения 578 нм и длину волны излучения 613 нм.

9. Измерения и статистический анализ

  1. Морфометрический анализ дифференцировки MNP-нагруженных клеток
    1. Для измерения количества пересечений на различных расстояниях от тела клетки приобретают фазовые изображения культивированных клеток до 3 дней после лечения НГФ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если это будет сделано позже, клетки могут развить сети, предотвращающие измерение разрешения одной ячейки.
      1. Откройте изображения в программе обработки изображений ImageJ и используйте плагин NeuronJ, который позволяет полуавтоматическая трассировка нейритов и измерение длины36. С помощью плагина neurite tracer отслеживайте нейриты и преобразуйте данные в двоичные изображения. Определите центр сомы.
      2. Выполните анализ Sholl, доступный в подключаемом модуле NeuronJ. Определите максимальный радиус. Повторите эксперимент три раза. Анализируйте более 100 клеток в каждом эксперименте.
  2. Анализ локализации клеток
    1. Чтобы определить процент клеток, локализованных на магнитной области после 3 дней инкубации, приобретите конфокальные микроскопические изображения клеток с поглощением MNP и без него. Используйте окрашивание DAPI (раздел 8.2).
    2. Вручную подсчитайте ячейки поверх или частично поверх узора (касаясь клеток) и клетки, которые не являются таковым. Повторите три эксперимента. Анализ более 400 клеток с помощью MNP и без поглощения.
    3. Рассчитайте относительную долю клеток, которые находятся поверх магнитных паттернов, от общего числа клеток, с MNPs и без них. Кроме того, рассчитайте процент эффективной площади магнитного паттерна, добавив диаметр тела ячейки к ширине паттерна, чтобы определить случайную вероятность попадания клеток на магнитный паттерн.
    4. Выполните один Z-тестобразца, чтобы проанализировать, является ли распределение клеток результатом изотропной посадки клеток или есть ли предпочтительное смещение магнитной картины.
  3. Анализ направленности роста
    1. Для количественной оценки влияния на направленность роста нейритов приобретите конфокальные микроскопические изображения клеток с лечением MNP и без него после 8 дней инкубации. Выполняют иммунокрасивание (раздел 8.1).
    2. Используя программное обеспечение ImageJ, измерьте угол между нейритом ячейки и магнитными полосами в обоих условиях.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Анализируйте только нейриты, которые происходят из сом, расположенных на магнитных полосах.
    3. Постройте распределение углов нейритов относительно направления полос (Δθ). Выполните хи-квадратную проверку распределения Δθ, чтобы продемонстрировать, что распределение не является нормальным или однородным.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Изготовлены магнитные платформы с различными геометрическими формами(рисунок 1А). Магнитные паттерны осаждались путем напыления: 14 многослойных Co80Fe20 и Pd, 0,2 нм и 1 нм соответственно. Электронная микроскопия показала, что общая высота магнитных паттернов составляет ~18 нм(рисунок 1B). Это уникальное многослойное осаждение FM создает стабильную платформу с перпендикулярной анизотропией намагниченности (...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Репрезентативные результаты демонстрируют эффективность представленной методологии контроля и организации формирования нейронных сетей в микроновом масштабе. Ячейки PC12 с MNP-нагрузкой оставались жизнеспособными и были преобразованы в магниточувствительные единицы, которые притягивались магнитными силами от FM-электродов к определенным участкам. Лучше всего это продемонстрировано на рисунке 5C,где клетки преимущественно прилипают к более крупным вершинам шестиугольника, а не к тонким линиям...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Это исследование было поддержано Министерством науки и технологий Израиля и Израильским научным фондом (569/16).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
16% Параформальдегид (формальдегид) водный растворЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ НАУКИ15710
6-луночный планшет для культивирования клетокFALCON353846
96-луночный планшет для культивирования клетокSPL Биологические науки30096
Раствор амфотерицина BBiological Industries03-028-1B
AZ 1514H фоторезистМикрохимикаты
AZ 351 B проявительMicroChemicals GmbH
Бычий сывороточный альбумин (BSA)Biological Industries03-010-1B
Колба для клеточных и тканевых культурBiofilTCF00225075,0 см^2 250 мл Вентиляционная крышка, необработанная
чашка для клеточных культурGreiner Bio-One627-16035 мм
Набор для пролиферации клеток (на основе XTT)Biological Industries20-300-1000
Центрифужная пробиркаBiofilCFT02150050 мл
Co80Fe20 в % распыления мишениACI Alloys99,95%
Коллаген типа ICorning Inc.354236Rat Tail, диапазон концентраций 3-4 мг/мл
Конфокальный микроскопLeicaTCS SP5
Cy2-конъюгированный AffiniPure Donkey Anti-rabbit вторичное антителоJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.711-165-152
DAPI fluoromount-GSouthernBiotech0100-20
Игла одноразоваяKDL23 G
Одноразовая   шприцMedispo116022764010 мл
Донорская сыворотка для лошадейBiological Industries04-124-1A
ИФА считывательMerk MilliporeBioTek synergy 4 hybrid считыватель микропланшетов
Этанол 70%ROMICAL LTD19-009102-80
Абсолютный этанол (обезвоженный)Biolab-chemicals52505
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Biological Industries04-127-1A
Свежая мышиная β-NGFPeprotech450-34
GMW C-frame электромагнит .Бакли Системс ЛТД3470, 45 мм
Соляная кислота 32%DAEJUNG CHEMICAL & METALS4170-4100
ImageJ Национальныйинститут здравоохранения США, BethesdaПлагин NeuronJ
Индуктивно связанная плазма (ICP)Ametek SpectroSPECTRO ARCOS ICP-OES, FHX22 MultiView плазма
Keithley источник-измеритель Keithley2400
Система переключения Keithley3700
L-глутаминБиологическая промышленность03-020-1B
Световой микроскопLeicaDMIL Светодиодная
безмасочная фотолитографияHeidelberg Inst.MLA150
Предметные стекла для микроскопаBAR-NAORBN1042000C
азотной кислотой 70%Sigma-Aldrich438073
Нормальная ослиная сыворотка (NDS)SigmaD9663
PBS 10xhylabsBP507/1LD
PC12 клеточная линияATCCCRL-1721
Pd распыление мишеньACI Alloys99,95%
Пенициллин-стрептомицин нистатинраствор Биологическая промышленность03-032-1B
Реагент жизнеспособности клеток PrestoBlueМолекулярные зондыA-13261на основе резазурина
Антитела кролика к альфа;-тубулинуSanta Cruz Biotechnology, Inc.
Система радиочастотного магнетронного распыленияOrion AJA Int.Orion 8
RPMI 1640 с l-глутаминомBiological Industries01-100-1A
Ультразвуковая ваннаKUDOSSK3210HPЧастота: 53 кГц. Мощность ультразвука:
магнитометр SQUIDQuantum Design, CA
Triton X-100CHEM-IMPEXINTERNATIONAL 1279неионогенное поверхностно-активное вещество
XTT реагент
GmbH мощностью 135 Вт жизнеспособности клеток XTT

Ссылки

  1. Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering. 5 (1), 293-347 (2003).
  2. Kim, Y., Haftel, V. K., Kumar, S., Bellamkonda, R. V. The role of aligned polymer fiber-based constructs in the bridging of long peripheral nerve gaps. Biomaterials. 29 (21), 3117-3127 (2008).
  3. Dvir, T., Timko, B. P., Kohane, D. S., Langer, R. Nanotechnological strategies for engineering complex tissues. Nature Nanotechnology. 6 (1), 13-22 (2011).
  4. Antman-Passig, M., Shefi, O. Remote Magnetic orientation of 3D collagen hydrogels for directed neuronal regeneration. Nano Letters. 16 (4), 2567-2573 (2016).
  5. Hardelauf, H., et al. Micropatterning neuronal networks. Royal Society of Chemistry. 139 (1), 3256-3264 (2014).
  6. Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nature Nanotechnology. 8 (2), 83-94 (2013).
  7. Sahyouni, R., et al. Interfacing with the nervous system: a review of current bioelectric technologies. Neurosurgical Review. 42 (2), 227-241 (2019).
  8. Mcguire, A. F., Santoro, F., Cui, B. Interfacing cells with vertical nanoscale devices: applications and characterization. Annual Review of Analytical Chemistry. 111226 (1), 1-12 (2018).
  9. Marcus, M., et al. Interactions of neurons with physical environments. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), (2017).
  10. Lim, J. Y., Donahue, H. J. Cell sensing and response to micro- and nanostructured surfaces produced by chemical and topographic patterning. Tissue Engineering. 13 (8), 1879-1891 (2007).
  11. Park, M., et al. Control over neurite directionality and neurite elongation on anisotropic micropillar arrays. Small. 12 (9), 1148-1152 (2016).
  12. Rutten, W. L. C., Ruardij, T. G., Marani, E., Roelofsen, B. H. Neural networks on chemically patterned electrode arrays: towards a cultured probe. Acta Neurochirurgica Supplement. 97 (2), 547-554 (2007).
  13. Bongaerts, M., et al. Parallelized manipulation of adherent living cells by magnetic nanoparticles-mediated forces. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6560(2020).
  14. Kilgus, C., et al. Local gene targeting and cell positioning using magnetic nanoparticles and magnetic tips: comparison of mathematical simulations with experiments. Pharmaceutical Research. 29 (5), 1380-1391 (2012).
  15. Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo. Nanomedicine. 7 (9), London, England. 1425-1442 (2012).
  16. Gahl, T. J., Kunze, A. Force-mediating magnetic nanoparticles to engineer neuronal cell function. Frontiers in Neuroscience. 12, 299(2018).
  17. Goranov, V., et al. 3D Patterning of cells in magnetic scaffolds for tissue engineering. Scientific Reports. 10 (1), 1-8 (2020).
  18. Kunze, A., et al. Engineering cortical neuron polarity with nanomagnets on a chip. ACS Nano. 9 (4), 3664-3676 (2015).
  19. Tay, A., Di Carlo, D. Magnetic nanoparticle-based mechanical stimulation for restoration of mechano-sensitive ion channel equilibrium in neural networks. Nano Letters. 17 (2), 886-892 (2017).
  20. Tseng, P., Judy, J. W., Di Carlo, D. Magnetic nanoparticle-mediated massively parallel mechanical modulation of single-cell behavior. Nature Methods. 9 (11), 1113-1119 (2012).
  21. Lee, H., Liu, Y., Ham, D., Westervelt, R. M. Integrated cell manipulation system - CMOS/microfluidic hybrid. Lab on a Chip. 7 (3), 331-337 (2007).
  22. Alon, N., et al. Magnetic micro-device for manipulating PC12 cell migration and organization. Lab on a Chip. 15 (9), 2030(2015).
  23. Tseng, P., Di Carlo, D., Judy, J. W. Rapid and dynamic intracellular patterning of cell-internalized magnetic fluorescent nanoparticles. Nano Letters. 9 (8), 3053-3059 (2009).
  24. Marcus, M., et al. Iron oxide nanoparticles for neuronal cell applications: uptake study and magnetic manipulations. Journal of Nanobiotechnology. 14, 37(2016).
  25. Petters, C., Dringen, R. Accumulation of iron oxide nanoparticles by cultured primary neurons. Neurochemistry International. 81, 1-9 (2015).
  26. Sun, Z., et al. Characterization of cellular uptake and toxicity of aminosilane-coated iron oxide nanoparticles with different charges in central nervous system-relevant cell culture models. International Journal of Nanomedicine. 8, 961-970 (2013).
  27. Pinkernelle, J., Calatayud, P., Goya, G. F., Fansa, H., Keilhoff, G. Magnetic nanoparticles in primary neural cell cultures are mainly taken up by microglia. BMC Neuroscience. 13 (1), 32(2012).
  28. Shubayev, V. I., Pisanic, T. R., Jin, S. Magnetic nanoparticles for theragnostics. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 467-477 (2009).
  29. Pankhurst, Q. A., Connolly, J., Jones, S. K., Dobson, J. Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine. Journal of Physics D: Applied Physics. 36 (13), 167-181 (2003).
  30. Krishnan, K. M. Biomedical nanomagnetics: a spin through possibilities in imaging, diagnostics, and therapy. IEEE Transactions on Magnetics. 46 (7), 2523-2558 (2010).
  31. Johannsen, M., et al. Thermotherapy of prostate cancer using magnetic nanoparticles: feasibility, imaging, and three-dimensional temperature distribution. European Urology. 52 (6), 1653-1662 (2007).
  32. Roet, M., et al. Progress in neuromodulation of the brain: A role for magnetic nanoparticles. Progress in Neurobiology. 177, 1-14 (2019).
  33. Polak, P., Shefi, O. Nanometric agents in the service of neuroscience: Manipulation of neuronal growth and activity using nanoparticles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 11 (6), 1467-1479 (2015).
  34. Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PloS One. 11 (2), 0150290(2016).
  35. Riggio, C., et al. The orientation of the neuronal growth process can be directed via magnetic nanoparticles under an applied magnetic field. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 10 (7), 1549-1558 (2014).
  36. Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
  37. Marcus, M., et al. Magnetic organization of neural networks via micro-patterned devices. Advanced Materials Interfaces. 7 (19), 2000055(2020).
  38. Kachlon, Y., Kurzweil, N., Sharoni, A. Extracting magnetic anisotropy energies in Co/Pd multilayers via refinement analysis of the full magnetoresistance curves. Journal of Applied Physics. 115 (17), 173911(2014).
  39. Gura, S., Margel, S. Nucleation and growth of magnetic metal oxide nanoparticles and its use. European Patent Office Publ of Application with search report. , EP19990925247 (1999).
  40. Baranes, K., Kollmar, D., Chejanovsky, N., Sharoni, A., Shefi, O. Interactions of neurons with topographic nano cues affect branching morphology mimicking neuron-neuron interactions. Journal of Molecular Histology. 43 (4), 437-447 (2012).
  41. Baranes, K., Chejanovsky, N., Alon, N., Sharoni, A., Shefi, O. Topographic cues of nano-scale height direct neuronal growth pattern. Biotechnology and Bioengineering. 109 (7), 1791-1797 (2012).
  42. David-Pur, M., Bareket-Keren, L., Beit-Yaakov, G., Raz-Prag, D., Hanein, Y. All-carbon-nanotube flexible multi-electrode array for neuronal recording and stimulation. Biomed Microdevices. 16 (1), 43-53 (2014).
  43. Walia, S., et al. Flexible metasurfaces and metamaterials: A review of materials and fabrication processes at micro-and nano-scales. Applied Physics Reviews. 2, 11303(2015).
  44. Ngo, D. T., et al. Perpendicular magnetic anisotropy and the magnetization process in CoFeB/Pd multilayer films. Journal of Physics D: Applied Physics. 47 (44), (2014).
  45. Barsukov, I., et al. Field-dependent perpendicular magnetic anisotropy in CoFeB thin films. Applied Physics Letters. 105 (15), 152403(2014).
  46. Zhang, S., Gao, H., Bao, G. Physical principles of nanoparticle cellular endocytosis. ACS Nano. 9 (9), 8655-8671 (2015).
  47. Marcus, M., Skaat, H., Alon, N., Margel, S., Shefi, O. NGF-conjugated iron oxide nanoparticles promote differentiation and outgrowth of PC12 cells. Nanoscale. 7 (3), 1058-1066 (2015).
  48. Marcus, M., et al. Magnetic targeting of growth factors using iron oxide nanoparticles. Nanomaterials. 8 (9), 707(2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

PC12

Похожие статьи