Этот протокол описывает рутинный метод использования последовательной блочной сканирующей электронной микроскопии (SBF-SEM), мощного метода 3D-визуализации. Успешное применение SBF-SEM зависит от правильной фиксации и окрашивания тканей, а также тщательного рассмотрения настроек визуализации. Этот протокол содержит практические соображения для всего этого процесса.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Последовательная блочно-лицевая сканирующая электронная микроскопия (SBF-SEM) образцов биологических тканей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Последовательная блочная сканирующая электронная микроскопия (SBF-SEM) позволяет коллекционировать от сотен до тысяч серийно зарегистрированных ультраструктурных изображений, предлагая беспрецедентный трехмерный вид микроанатомии тканей. В то время как sBF-SEM в последние годы наблюдается экспоненциальный рост использования, технические аспекты, такие как надлежащая подготовка тканей и параметры визуализации, имеют первостепенное значение для успеха этого метода визуализации. Эта система визуализации выигрывает от автоматизированного характера устройства, позволяя оставлять микроскоп без присмотра во время процесса визуализации, с автоматизированным сбором сотен изображений, возможных за один день. Однако без соответствующей тканевой подготовки клеточная ультраструктура может быть изменена таким образом, что могут быть сделаны неправильные или вводящие в заблуждение выводы. Кроме того, изображения генерируются путем сканирования лицевой стороны блока биологического образца, встроенного в смолу, и это часто создает проблемы и соображения, которые необходимо решить. Накопление электронов внутри блока во время визуализации, известное как «заряд ткани», может привести к потере контраста и неспособности оценить клеточную структуру. Более того, в то время как увеличение интенсивности / напряжения электронного пучка или снижение скорости сканирования пучка может увеличить разрешение изображения, это также может иметь неприятный побочный эффект повреждения смоляного блока и искажения последующих изображений в серии изображений. Здесь мы представляем рутинный протокол подготовки образцов биологических тканей, который сохраняет клеточную ультраструктуру и уменьшает заряд тканей. Мы также предоставляем визуальные соображения для быстрого получения высококачественных серийных изображений с минимальным повреждением тканевого блока.
Введение
Последовательная блочная сканирующая электронная микроскопия (SBF-SEM) была впервые описана Лейтоном в 1981 году, где он создал сканирующий электронный микроскоп, дополненный встроенным микротомом, который мог разрезать и визуализировать тонкие участки ткани, встроенные в смолу. К сожалению, технические ограничения ограничили его использование проводящими образцами, поскольку непроводящие образцы, такие как биологическая ткань, накапливали неприемлемые уровни зарядки (накопление электронов в образцеткани) 1. В то время как покрытие грани блока между разрезами испаривающимся углеродным снижением тканевой зарядки, это значительно увеличило время ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все животные обрабатывались в соответствии с руководящими принципами, описанными в Заявлении Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии для использования животных в исследованиях зрения и офтальмологических исследованиях и Руководящих принципах обращения с животными Колледжа оптометрии Университета Хьюстона. Все процедуры для животных были одобрены учреждениями, в которых они обрабатывались: процедуры для мышей, крыс, кроликов, морских свинок и нечеловеческих приматов были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Университета Хьюстона, процедуры для рыбок данио были одобрены Комитетом по уходу за животными и использованию животных Университет....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Роговица мыши
Этот протокол широко применялся к роговице мыши. Было показано, что с помощью визуализации SBF-SEM сеть пучков микрофибрила без эластина (EFMB) присутствует в роговице взрослой мыши. Ранее считалось, что эта сеть присутствовала только во время эмбрионального и раннего постнатального развития. SBF-SEM выявил обширную сеть EFMB по всей роговице, причем отдельные волокна были обнаружены в диаметре 100-200 нм при измерении в поперечном сечении. Также было обнаружено, что эта сеть EFMB была о.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Целью данной работы по методам является освещение методологии подготовки и визуализации тканей, которая позволила нашей лаборатории надежно захватывать изображения серийной электронной микроскопии высокого разрешения, и указать на критические шаги, которые приводят к этому результату, а также на потенциальные подводные камни, которые могут возникнуть при проведении визуализации SBF-SEM. Успех использования этого протокола требует правильной фиксации ткани, пропитки тяжелых металлов в образец, модификации встраиваемой смо.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Сэма Хэнлона, Эвелин Браун и Маргарет Гондо за их прекрасную техническую помощь. Это исследование было частично поддержано Национальными институтами здравоохранения (NIH) R01 EY-018239 и P30 EY007551 (Национальный институт глаз), частично Фондом льва для зрения, а частично NIH 1R15 HD084262-01 (Национальный институт детского здоровья и развития человека).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1/16 x 3/8 Алюминиевые заклепки | промышленные заклепки и Крепеж Ко. | 6N37RFLAP/1100 | Используется в качестве штифтов для образцов. |
| Плоская отвертка 2,5 мм | Wiha Quality Tools | 27225 | |
| Ацетоновая | электронная микроскопия Sciences | RT 10000 | Используется для разбавления серебряной краски. |
| Аспарагиновая кислота | Sigma-Aldrich | A8949 | |
| Хлорид кальция | FisherScientific | C79-500 | |
| Проводящая серебряная краска | Ted Pella | 16062 | |
| Denton Desk-II Устройство для вакуумного распыления, оснащенное стандартной мишенью из золотой фольги | Denton Vacuum | N/A | Это устройство для распыления золота, используемое авторами, альтернативы приемлемы. |
| Обоюдоострые бритвы | Fisher Scientific | 50-949-411 | |
| Встраиваемые 812 | Электронная микроскопия Sciences | 14120 | |
| Gatan 3View2 Монтируются в Tescan Mira3 Field Emission SEM | Gatan & Tescan | N/A | Это устройство SBF-SEM, используемое авторами, альтернативные варианты допустимы. |
| Флаконы со стеклянной оболочкой, 0,5 DRAM (1,8 мл) | Электронная микроскопия | Науки 72630-05 | |
| Глутеральдегидная | электронная микроскопия Науки | 16320 | |
| Gorilla Super Glue - Impact Tough | NA | NA | Упоминается как цианоакрилатный клей в тексте. |
| Ketjen Black | HM Royal | EC-600JD | упоминается как технический углерод в тексте. |
| KOH | FisherScientific | 18-605-593 | |
| Нитрат свинца | Fisher | Scientific L62-100 | |
| Микроволновая печь | Pelco | BioWave Pro | Это микроволновая печь, используемая авторами, альтернативы приемлемы. |
| Тетраоксид осмия | Sigma-Aldrich | 201030 | |
| Ферроцианид калия | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Силиконовая форма для встраивания | Ted Pella | 10504 | |
| Тригидрат натрия | Электронная микроскопия Sciences | 12300 | |
| Samco Трансферная пипетка | ThermoFisher Scientific | 202 | Используется для изготовления штифта для образцов пробирки для хранения. |
| Швейцарские игольчатые пилки | Электронная микроскопия науки | 62115 | |
| Тиокарбогидразид | Сигма-Олдрич | 223220 | |
| Uranyl Ацетат | Polysciences, Inc. | 21447-25 | |
| Reconstruction Software | |||
| Amira Software | Thermo Scientific | N/A | Используется для создания реконструкций, показанных на рисунках 5-7 и 9. |
| Фиджи (Фиджи - это просто ImageJ) | ImageJ.net | Н/Д | TrakEM2 может быть добавлен в Фиджи для ручной сегментации. |
| Браузер изображений для микроскопии (MIB) | Университет Хельсинки, Институт биотехнологии | Н/Д | |
| Реконструкт Программное обеспечение | Лаборатория нейронных систем Н | /Д | |
| Верстак SuRVoS | Алмазный источник света и Ноттингемский университет | N/A | |
| SyGlass | IstoVisio, Inc. | Н/Д | Позволяет проводить реконструкцию в виртуальной реальности и методах реконструкции на основе гистограммы. |
Ссылки
- Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scanning Electron Microscopy. , Pt 2 73-76 (1981).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscop....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
