Характеристика новой техники органотипической культуры сетчатки человека

Charisse Y. J. Kuo; Henry H. Louie; Ilva D. Rupenthal; Odunayo  O. Mugisho

doi:10.3791/62046

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Характеристика новой техники органотипической культуры сетчатки человека

4.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62046

⸱

9 июня 2021 г.

Charisse Y. J. Kuo^*¹ , Henry H. Louie¹ , Ilva D. Rupenthal¹ , Odunayo O. Mugisho^*¹

¹Buchanan Ocular Therapeutics Unit, Department of Ophthalmology and the New Zealand National Eye Centre, University of Auckland

^* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Это исследование направлено на разработку новой модели органотипической культуры сетчатки человека (HORC), которая предотвращает компрометацию целостности сетчатки во время эксплантации. Это достигается путем культивирования сетчатки с шелужащимся стекловидным и нижележащим пигментом сетчатки эпителием-сосудистой оболочкой (RPE-сосудистой оболочкой) и склерами.

Аннотация

Предыдущие модели органотипической культуры сетчатки человека (HORC) использовали отслоивающиеся сетчатки; однако без структурной поддержки, приданной пигментным эпителием-сосудистой оболочкой сетчатки (RPE-сосудистой оболочкой) и склерой, целостность хрупкой сетчатки может быть легко нарушена. Целью этого исследования была разработка новой модели HORC, которая содержит сетчатку, RPE-хориозию и склеру для поддержания целостности сетчатки при культивировании эксплантов сетчатки.

После разрезания по окружности вдоль лимбуса для удаления радужной оболочки и хрусталика, были сделаны четыре глубоких разреза, чтобы сплющить глазник. В отличие от предыдущих протоколов HORC, трефин использовался для разрезания не только сетчатки, но и RPE-сосудистой оболочки и склеры. Полученную трехслойную эксплантировали в течение 72 ч. Окрашивание гематоксилином и эозином (H & E) использовалось для оценки анатомических структур, а экспланты сетчатки дополнительно характеризовались иммуногистохимией (IHC) для апоптоза, целостности клеток Мюллера и воспаления сетчатки. Чтобы подтвердить возможность индукции заболевания, экспланты подвергались воздействию высокого уровня глюкозы (HG) и провоспалительных цитокинов (Cyt), чтобы имитировать диабетическую ретинопатию (DR). Анализ магнитной бусины Luminex использовался для измерения связанных с DR цитокинов, высвобождаемых в культуральная среда.

Окрашивание H & E выявило отчетливые ламели сетчатки и компактные ядра в эксплантатах сетчатки с нижележащей RPE-сосудистой оболочкой и склерой, в то время как сетчатка без нижележащих структур продемонстрировала уменьшенную толщину и сильную потерю ядер. Результаты IHC показали отсутствие апоптоза и воспаления сетчатки, а также сохранение целостности клеток Мюллера. Анализы Luminex показали значительно повышенную секрецию DR-ассоциированных провоспалительных цитокинов в эксплантатах сетчатки, подвергшихся воздействию HG + Cyt, по сравнению с исходными уровнями через 24 ч.

Мы успешно разработали и охарактеризовали новый протокол HORC, в котором целостность сетчатки сохранялась без апоптоза или воспаления сетчатки. Более того, индуцированная секреция DR-ассоциированных провоспалительных биомаркеров при воздействии эксплантов сетчатки на HG + Cyt предполагает, что эта модель может быть использована для клинически транслируемых исследований заболеваний сетчатки.

Введение

Сетчатка является узкоспециализированной глазной структурой, ответственной за преобразование входящей световой энергии в электрические сигналы, которые затем обрабатываются мозгом для визуального восприятия. Сетчатка человека содержит динамический диапазон типов клеток, высокоорганизованных в уникальную ламеллярную структуру, состоящую из двух синаптических и трех ядер слоя¹ (рисунок 1). Гомеостаз сетчатки поддерживается сложными связями между нейроретинальными клетками, кровеносными сосудами, нервами, соединительными тканями и RPE^1. Из-за сложной анатомии и физиологии сетчатки механизмы мно....