Здесь мы описываем простой метод, который сочетает в себе РНК флуоресценции на месте гибридизации (РНК-ФИШ) с иммунофторесценцией для визуализации тяжелой острой коронавируса респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) РНК. Этот протокол может повысить понимание молекулярных характеристик взаимодействий РНК-хозяина SARS-CoV-2 на одноклеточном уровне.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Визуализация ТОРС-КоВ-2 с использованием иммуноРНК-флуоресценции в гибридизации Ситус
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Эта рукопись содержит протокол для на месте гибридизации цепной реакции (HCR) в сочетании с иммунофлюоресценцией для визуализации тяжелой острой коронавируса респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) РНК в клеточной линии и трехмерных (3D) культур эпителия дыхательных путей человека. Метод позволяет высокоспецифическую и чувствительную визуализацию вирусной РНК, опираясь на HCR, инициированный локализацией зонда. Сплит-инициатор зонды помогают усилить сигнал флуоресцентно помечены усилители, в результате чего незначительные фоновые флуоресценции в конфокальной микроскопии. Маркировка усилителей различными флуоресцентными красителями облегчает одновременное распознавание различных целей. Это, в свою очередь, позволяет картировать инфекцию в тканях, чтобы лучше понять вирусный патогенез и репликацию на одноклеточном уровне. Соединение этого метода с иммунофлуоресценцией может способствовать лучшему пониманию взаимодействий между принимающей вирусом, включая чередование эпигенома хозяина и путей иммунного ответа. Благодаря чувствительной и специфической технологии УВКБ этот протокол также может использоваться в качестве диагностического инструмента. Важно также помнить, что метод может быть легко изменен, чтобы позволить обнаружение любой РНК, в том числе некодирующих РНК и РНК вирусов, которые могут возникнуть в будущем.
Введение
ТОРС-КоВ-2 — новый бетакоронавирус человека, возникший в конце 2019 года, вызвав беспрецедентную пандемию несколько месяцев спустя. Поскольку вирус является новым для науки, большая часть его биологии и его влияние на клетки-хозяина остаются неизвестными. Таким образом, картирование вирус-клеток и ткани тропизма во время инфекции имеет важное значение, если его основные биологические характеристики и его влияние на хозяина должны быть поняты. Для изучения взаимодействия вирусов и принимающих вирусов используется несколько методов, включая биохимические, биологические и физические анализы. На месте гибридизации является распространенным методом, который использует поме....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Буферная подготовка
- Для 500 мл 2x буфера PHEM, комбинат 18,14 гпиперазина-N,НО-бис(2-этанесульфоновая кислота) (PIPES), 6,5 г 4-(2-гидроксиэтил)-1 пиперазин этанесульфоновая кислота (HEPES), 3,8 г тетраакетической кислоты этиленгликоль (EGTA) и 0,99 г сульфата магния (MgSO4). Сделайте объем до 400 мл с дистиллированной водой (dH2O), перемешать, и настроить рН до 7,0 с помощью 10 М гидроксида калия (KOH) или гидроксида натрия (NaOH). Сделайте окончательный объем до 500 мл, а затем разделите на 50 мл aliquots. Хранить при -20 градусов по Цельсию до тех пор, пока требуется.
ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер не будет ясен, пока рН не достигн....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Протокол иммуно-РНК-ФИШ, описанный в этой рукописи, был выполнен с использованием двух клеточных систем: клеточной линии Веро и 3D-культуры HAE. Основные шаги для обеих клеточных моделей показаны в таблице 2. Протокол РНК-ФИШ для визуализации SARS-CoV-2 в культурах HAE включает в себя шаги, которые характерны для образцов тканей, т.е. проницаемые со 100% MeOH и регидратации через градуированные серии MeOH-PBS и 0,1% Tween решений. Иммунофлюоресценция была выполнена после .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Immuno-RNA-FISH является надежным методом двойного окрашивания РНК и клеточных белков. Здесь описан модифицированный иммуно-РНК-ФИШ протокол, который позволяет обнаруживать РНК ТОРС-КоВ-2 и клеточные белки в клеточных линиях и культурах HAE. Этот протокол может быть адаптирован для использования в различных моделях клеток, включая монослой клеток или конкретных тканей. Этот метод опирается на концепцию УВКБ, инициированную соответствующей локализацией зондов. Далее, использование сплит-инициатор зондов, чтобы начать усил.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, чтобы заявить.
Благодарности
Эта работа была поддержана Министерством науки и высшего образования для исследований ПО ТОРС-КоВ-2, а также грантами Национального научного центра (гранты UMO2017/27/B/N'6/02488 К.П. и УМО-2018/30/E/N'1/00874 К.К.-П.).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Оборудование | |||
| Конфокальный микроскоп LSM 880 | ZEISS | ||
| Grant Bio, мини качалка-шейкер | Fisher Scientific | 12965501 | |
| инкубатор Galaxy170R | New Brunswick | CO170R-230-1000 | |
| Термомиксер Comfort | Eppendorf | 5355 000 011 | |
| Материалы | |||
| 15 мм x 15 мм покровные стекла No 1 | LabSolute | 7695022 | |
| 1,5 мл пробирки | FL-MEDICAL | 5.350.023.053 | |
| 12-луночная пластина | TTP | 92412 | |
| Коническая центрифужная трубка | Sarstedt | 5.332.547.254 | |
| парапленка | Sigma | P7793-1EA | |
| серологические пипетки | VWR Collection | 612-5523P, 612-5827P | |
| предметное стекло | PTH CHEMLAND | 04-296.202.03 | |
| Transwell ThinCerts | Grainer bio-one | 665641 | |
| Реагенты | |||
| Alexa флуорофор 488-конъюгированные вторичные антитела | Invitrogen | ||
| β 5-тубулин | Santa Cruz Biotechnology | sc-134234 | |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | |
| Динатрийфосфат | Sigma | S51136-500G | |
| EGTA | BioShop | EGT101.25 | |
| HCR Amplification Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BAM01522 | Буфер также может быть подготовлен doi:10.1242/dev.165753: Дополнительная информация |
| усилитель HCR B1-h1 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | ||
| усилитель HCR B1-h2 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | ||
| Буфер для гибридизации зондов HCR | Molecular Instruments, Inc. | BPH03821 | Буфер также может быть подготовлен doi:10.1242/dev.165753: Набор зондов |
| HCR для SARS-CoV-2 Ncapsid | Molecular Instruments, Inc. | PRE134 | |
| Промывочный буфер зонда HCR | Molecular Instruments, Inc. | BPW01522 | Буфер также может быть приготовлен doi:10.1242/dev.165753: Дополнительная информация |
| HEPES | BioShop | HEP001.100 | |
| Сульфат магния гептагидрат | Sigma | 63138-250G | |
| Метанол | Sigma | 32213-1L-M | |
| Монокалия | фосфат Sigma | P5655-100G | |
| Параформальдегид | Sigma | P6148-1KG | |
| ТРУБКИ | BioShop | PIP666.100 | |
| Хлорид калия | Sigma | P5405-250G | |
| Пролонгированный алмаз Antifade Монтажная среда | Invitrogen | P36970 | |
| Хлорид натрия | BioShop | SOD001.5 | |
| Тринатрия цитрат 2-гидрат | POCH | 6132-04-3 | |
| Твин-20 | BioShop | TWN580.500 | |
| Программное обеспечение | |||
| Флуоресцентный спектрапросмотрщик | Моделирование спектральных параметров | ||
| ImageJ Fiji | Получение и обработка изображений z-стека |
Ссылки
- Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145, (2018).
- Milewska, A., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
