R-Loop Анализ с помощью Dot-Blot

Summary

В этом протоколе подробно описан простой метод, который количественно определяет R-петлю, трехцепочечную структуру нуклеиновой кислоты, состоящую из гибрида РНК-ДНК и смещенной цепи ДНК.

Abstract

Трехцепочечная структура нуклеиновой кислоты, R-петля, все чаще признается за ее роль в регуляции генов. Первоначально считалось, что R-петли являются побочными продуктами транскрипции; но недавние открытия меньшего количества R-петель в больных клетках ясно показали, что R-петли играют функциональную роль в различных клетках человека. Далее, крайне важно понять роль R-петель и то, как клетки уравновешивают их численность. Проблемой в этой области является количественное определение R-петель, поскольку большая часть работы опирается на моноклональное антитело S9.6, специфичность которого для гибридов РНК-ДНК была поставлена под сомнение. В данной работе мы используем дот-блоттинг с антителом S9.6 для количественного определения R-петель и демонстрируем чувствительность и специфичность этого анализа с РНКазой H, РНКазой T1 и РНКазой III, которые расщепляют гибриды РНК-ДНК, одноцепочечную РНК и двухцепочечную РНК соответственно. Этот метод отличается высокой воспроизводимостью, использует общелабораторное оборудование и реактивы, а также дает результаты в течение двух дней. Этот анализ может быть использован в исследовательских и клинических условиях для количественной оценки R-петель и оценки влияния мутаций в таких генах, как сенатаксин, на распространенность R-петлей.

Introduction

Этот протокол представляет собой пошаговое руководство по анализу дот-блоттинга, который позволяет быстро провести сравнительную оценку распространенности R-петли, трехцепочечной структуры нуклеиновой кислоты. R-петля образуется, когда РНК вторгается в двухцепочечную ДНК с образованием гибрида РНК-ДНК и вытесняет другую цепь ДНК. R-петли обнаруживаются на разных стадиях жизненного цикла РНК. В транскрипционном комплексе зарождающаяся РНК синтезируется комплементарно матричной ДНК, а нематричная цепь вытесняется. Короткий гибрид РНК-ДНК (<10.н.) разрешается высвобождать зарождающуюся РНК, чтобы она могла покинуть РНК-полимеразный комплекс через выходной канал ^1,2. Вне транскрипционного комплекса зарождающаяся РНК находится близко к своей ДНК-матрице, которая все еще немного раскручивается после копирования, поэтому РНК может регибридизироваться со своей матрицей ДНК, образуя R-петли³. Кроме того, R-петли могут образовываться при столкновении репликационных и транскрипционных комплексов⁴, а также при антисмысловой транскрипции⁵. Учитывая множество возможностей для их образования, R-петли не являются редкостью и могут быть обнаружены в 3-5%^генома человека6, в зависимости от статуса транскрипции клетки. R-петли обнаружены в промоторах^{гена 7} и сайтах терминации⁵ в мРНК, а также вдоль рибосомной РНК⁸, а также в транспортной РНК⁹. R-петли также находятся в теломерных областях хромосом.

R-петли играют регулирующую роль. Они регулируют экспрессию генов, воздействуя на транскрипцию в промоторах^10,11, опосредуя рекомбинацию переключателей классов¹² и облегчая редактирование генома на основе CRISPR 13,14,15. Как и многие клеточные события, распространенность R-петли сильно титруется; слишком большое или слишком малое количество R-петель влияет на нормальную функцию клетки^16,17. R-петли регулируются различными белками, включая РНКазу Н, сенатаксин и другие хеликазы, которые раскручивают гибриды РНК-ДНК 18,19,20,21,22.

Для мониторинга распространенности R-петель полногеномные методы сначала обогащают R-петли антителом S9.6 ^8,23,24 или другими нуклеазами²⁵, включая РНКазу H 10,26,27, а затем оценивают количество обогащенных R-петель путем секвенирования. Ранние версии этих методов, основанных на секвенировании, не достигали адекватного охвата последовательностей для точного количественного определения, но быстрое совершенствование технологий секвенирования теперь позволяет проводить локусный анализ R-петли. Методы иммунофлуоресценции также использовались для количественного определения и локализации R-петель^10,17. Эти методы являются комплексными, но они непрактичны во многих клинических условиях или в качестве первоначальной оценки, поскольку требуют дорогостоящего оборудования и специализированного анализа.

Необходима процедура, которая может быть выполнена единообразно во всех лабораториях в клинических условиях. Точечные блоттинги предоставляют такую возможность, так как их можно проводить без какого-либо специального оборудования или вычислительного анализа. В качестве предварительного шага или в клинических условиях для оценки влияния мутаций на R-петли, эти дот-блоттинги должны обеспечить чувствительные и специфические результаты. Здесь мы описываем наш анализ, который идентифицирует именно R-петли; он исключает сигналы от двухцепочечной (ds) ДНК, двухцепочечной РНК и одноцепочечной РНК. Наш протокол использует антитело²⁷ S9.6 для идентификации гибридов РНК-ДНК в R-петлях и включает РНКазу H, эндорибонуклеазу, которая расщепляет и, следовательно, приводит к деградации РНК в гибриде ^{РНК-ДНК 20,28}, чтобы гарантировать, что обнаруженные сигналы являются сигналами гибридов. Мы также включили РНКазу Т1, которая расщепляет одноцепочечную РНК на гуанине^29,30, и РНКазу III, которая расщепляет двухцепочечную РНК, включая стеблевые петли^31,32, для проверки неспецифических сигналов. Антитело S9.6 распознает гибриды РНК-ДНК различной длины, даже те, которые имеют длину всего 8 нуклеотидов из³³.

Здесь мы представляем протокол, который начинается с выделения нуклеиновых кислот, за которым следует дот-блоттинг и обнаружение R-петли с антителом S9.6. Наш протокол включает в себя шаги, гарантирующие, что загружено равное количество сэмплов, а сигналы специфичны. Он обеспечивает олигонуклеотиды, которые служат положительным и отрицательным контролем. Это быстрый, простой и удобный для пользователя метод оценки распространенности R-петли.

Protocol

1. Лизис клеток для ядерного фракционирования

1. Промойте ячейки 1x фосфатно-солевым буфером (PBS) дважды. Удалите клетки из тарелок для культивирования тканей с помощью стандартных методов диссоциации клеток, таких как трипсин. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
   Примечание: Описанные ниже этапы были использованы для анализа первичных фибробластов кожи человека, хотя можно проанализировать целый ряд типов клеток. Фибробласты выращивали в базальных средах, содержащих 10% фетальной бычьей сыворотки. В качестве альтернативы, буфер для лизиса клеток (Таблица 1) может быть добавлен непосредственно в клеточную культуру после промывки.
2. Перенесите клеточную суспензию в пробирку объемом 1,5 мл для гранулирования клеток.
3. Центрифугируйте образец при 300 x g в течение 5 минут при 4 °C. Аспирируйте СМИ.
4. Дважды промойте ледяным 1x PBS, используя настройки центрифугирования в шаге 1.3.
5. Добавьте в клеточную гранулу буфер для лизиса холодной ячейки (табл. 1) (300 мкл на 2 x 10⁶ клеток). Проводите пипеткой вверх и вниз, чтобы снова суспендировать гранулу.
6. Выдерживать на льду в течение 10 минут.
7. Вращайте при 500 x g в течение 5 минут, чтобы гранулировать ядра.
8. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте ядерную таблетку в 400 мкл холодного буфера для ядерного лизиса (табл. 1).
9. Выдерживать на льду в течение 10 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фракционирование ядерного и цитоплазматического компартментов клеток обеспечивает специфичность сигнала. Качество ядерного и цитоплазматического разделения можно оценить, прежде чем продолжить работу (табл. 2).
10. Добавьте 3 мкл 20 мг/мл протеиназы К и инкубируйте в течение 3-5 ч при 55 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Указанные объемы относятся к 2 x 10⁶ ячейкам, увеличивайте или уменьшайте масштаб по мере необходимости.

2. Очистка геномной ДНК (к которой относятся гибриды РНК-ДНК)

1. Если ДНК вязкая, выполните ультразвуковую обработку для снижения вязкости (например, ультразвуковая обработка при высокой выходной мощности, 30 с ВКЛ / 30 с ВЫКЛ, в течение 2 мин с использованием водяной бани при температуре 4 °C).
2. Добавьте 400 μL элюирующего буфера (Таблица 1) и 400 μL фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (25:24:1 pH 8,0).
3. Вихрь за 10 с.
4. Вращайте при 12 000 x g в течение 5 минут при 4 °C.
5. Перенесите водную фазу (примерно 350 μл) в новую пробирку.
6. Извлеките один раз с использованием 1 объема хлороформа, вмешайте в течение 10 с, затем уменьшите при 12 000 x g в течение 5 минут при 4 °C. Перенесите водную фазу в новую пробирку (примерно 300 μл).
7. Добавьте 35 мкл 3 М ацетата натрия (pH 5,2), 1 мкл гликогена и 700 мкл ледяного 100% этанола.
8. Сделайте вихрь в течение 10 с и уменьшите при 12 000 x g в течение 30 минут при 4 °C.
9. Промойте гранулу 1 мл 70% этанола.
10. Сделайте вихрь в течение 10 с и уменьшите при 12 000 x g в течение 15 минут при 4 °C.
11. Выбросьте надосадочную жидкость и дайте гранулам высохнуть на воздухе.
12. Добавьте 12 μL элюирующего буфера и заведите вихрь на 10 с для ресуспендации. Инкубируйте образец в течение 30 минут при 37 °C с перемешиванием или при 4 °C в течение ночи для повторного суспендирования гранулы.
13. Измерьте концентрацию ДНК с помощью стандартной спектрофотометрии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Указанные объемы относятся к 2 x 10⁶ ячейкам, увеличивайте или уменьшайте масштаб по мере необходимости. ДНК (с гибридами РНК-ДНК) может храниться при температуре -20 °C, если это необходимо.

3. Блоттинг образцов ДНК (в состав которых входят гибриды РНК-ДНК) на нейлоновые мембраны

1. Приготовьте разведения нуклеиновых кислот до желаемых концентраций в элюирующем буфере (т.е. 50 нг/мкл, 25 нг/мкл или 12,5 нг/мкл). Эти образцы с диапазоном концентраций (200, 100, 50, 25, 12,5 нг) гарантируют наличие сигналов в линейном диапазоне.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно подготовьте достаточное количество образца для технических и биологических репликаций, а также для различных методов лечения РНКазой см. Шаг 5.
2. Подготовьте положительно заряженную нейлоновую мембрану таким образом, чтобы для каждого образца объемом 2 мкл оставалось место, занимающее площадь 0,5 см2.
3. Поместите 2 мкл каждого образца на 2 мембраны: одну для антитела S9.6, а другую для антитела дцДНК. В качестве альтернативы можно использовать аппарат «дот-блот» или «слот-блот», который позволяет загружать образцы с большими объемами.
4. Дайте образцам напитаться в мембране. Подождите не менее 2 минут, прежде чем сшивать мембрану ультрафиолетовым светом.
5. Поместите мембрану в центр УФ-устройства и сшейте мембрану с помощью УФ-сшивающего агента, используя настройку «Автоматическая сшивка» (1 200 μJ x 100).

4. Обнаружение гибрида РНК-ДНК с антителом к S9.6

1. Инкубировать мембрану в блокирующем растворе (5% молока в Трис-буферном физрастворе с 0,05% Tween-20 (TBST) в течение 1 ч при комнатной температуре на шейкере.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Блокирующего раствора должно быть достаточно, чтобы покрыть мембрану.
2. Инкубировать мембраны в течение ночи в первичных антителах (в 5% молоке при TBST) при 4 °C с встряхиванием. Добавьте антитела против дцДНК (разведение 1:10 000) на одну мембрану. Добавьте антитело S9.6 1 мкг/мл ко второй мембране (разведение 1:1000).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Антитела к S9.6 доступны на коммерческой основе или у доктора С. Леппла, NIAID, Национальных институтов здравоохранения.
3. Удалите первичное антитело и промойте 3 раза TBST. Выполняйте каждую стирку в течение 5-10 минут с встряхиванием при комнатной температуре.
4. Инкубируют с конъюгированными вторичными антителами к пероксидазе хрена (HRP) (против мышей, разведение 1:5000) в 5% молоке в условиях TBST с встряхиванием при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Анти-дцДНК и анти-РНК-ДНК гибрид являются мышиными антителами.
5. Удалите вторичное антитело и 3 раза промывайте TBST в течение 5-10 минут с встряхиванием при комнатной температуре.
6. Разработка с использованием реагентов с усиленной хемилюминесценцией (ECL) для получения сигналов для визуализации.
7. Количественная оценка интенсивности сигнала с помощью стандартных инструментов обработки изображений, таких как ImageJ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поиск и устранение неисправностей подробно описано в таблице 2.

5. Обработка рибонуклеазой для оценки специфичности сигнала

Примечание: Обработка РНКазой должна быть выполнена на образцах нуклеиновых кислот, чтобы продемонстрировать специфичность связывания S9.6. Лечение РНКазой H, но не РНКазой T1 или РНКазой III, должно привести к снижению иммуноокрашивания S9.6.

1. Расщепляйте образцы, содержащие гибриды РНК-ДНК, готовя их в четырех отдельных пробирках. Обработайте каждый из 4 образцов либо 5 U РНКазой H, 1000 U РНКазой T1, 0,5 U РНКазой III, либо имитацией. Образцы инкубировать при 37 °C в течение 15 минут в объемах 20 μл.
2. Загрузите 2 мкл каждого образца на мембрану, как описано в разделе 3.

6. Получение олигонуклеотидных контролей для оценки специфичности сигнала

Олигонуклеотидный контроль может быть использован для демонстрации специфичности связывания S9.6. S9.6 распознает гибриды РНК-ДНК, но не дцДНК или дцРНК контроль, как сообщалось ранее³⁴.

1. Растворить олигонуклеотиды (табл. 3) в буфере для отжига (10 мМ Трис, рН 8,0; 50 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА) до 100 мкМ.
2. Подготовьте 4 реакционные пробирки для
   1. Гибрид РНК-ДНК #1: Смешайте 10 μл верхней цепи ssRNA с 10 μL нижней цепи ssDNA и 80 μL буфера для отжига.
   2. Гибрид РНК-ДНК #2: Смешайте 10 мкл верхней цепи одноцепочечной ДНК с 10 мкл нижней цепи одноцепочной РНК и 80 мкл буфера для отжига.
   3. дцРНК: Смешайте 10 мкл верхней цепи ссРНК с 10 мкл нижней цепи мРНК и 80 мкл буфера для отжига.
   4. dsDNA: Смешайте 10 μл верхней цепи ssDNA с 10 μL нижней цепи ssDNA и 80 μL буфера для отжига.
3. Нагрейте 4 смеси с шага 6.2 при температуре 95 °C в течение 10 минут.
4. Дайте трубкам медленно остыть до комнатной температуры, чтобы обеспечить повторный отжиг прядей. Отожженные стандарты можно хранить при температуре -20 °C для последующего использования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность отжига следует проверять с помощью электрофореза без денатурации гелем. Дуплексы мигрируют медленнее, чем неотожженные олигонуклеотиды (табл. 2).
5. Загрузите по 2 мкл каждого образца на 2 мембраны, одну для антитела S9.6 и одну для антитела к дцДНК, как описано в разделе 3.
6. Выполните действия, описанные в разделе 4.

7. Количественная оценка и нормализация интенсивности сигнала R-контура S9.6 с использованием ImageJ.

1. Сохраняйте изображения S9.6, окрашивания dsDNA в формате TIFF и анализируйте их с помощью программы ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).
2. Выберите опцию инвертирования изображения (Правка | Инвертировать). После инверсии каждая точка будет видна белой на темном фоне.
3. Используйте инструмент выбора овального изображения, чтобы выбрать овал, который достаточно велик, чтобы окружить самую большую точку на изображении.
4. Используйте менеджер ROI, чтобы добавить выбранную область для количественной оценки. Убедитесь, что выбраны опции «Показать все» и «Метки», чтобы можно было визуализировать интересующие области.
5. Используйте ту же овальную область выделения, которая использовалась на шаге 7.3, чтобы добавить дополнительные области интереса вокруг каждой точки, подлежащей количественной оценке. Используйте сочетание клавиш Command + Shift + E для копирования выделенной области из шага 7.3 на каждую из последующих точек.
6. Измерьте интегрированную плотность каждой из областей интереса.
7. Разделите интенсивность сигнала S9.6 для каждого образца на измерение dsDNA, чтобы получить отношение сигнала S9.6/dsDNA. Проверьте результаты, повторив эксперименты (по крайней мере, в три раза для регистрации сигнала S9.6 и dsDNA). Стандартная ошибка среднего значения может быть рассчитана на основе отношения сигналов S9.6/dsDNA.

Results

Ферментативная терапия для оценки специфичности антител S9.6 (РНК-ДНК).
Были выращены первичные фибробласты кожи человека¹⁷. ДНК с гибридами РНК-ДНК была выделена и количественно определена. Два мкг образцов расщепляли с помощью РНКазы Т1, РНКазы Н или РНКазы III в течение 15 мин при 37 °С. Также был проанализирован макет образца для сравнения с образцами, обработанными РНКазой. Образцы (200, 100, 50, 25, 12,5 или 6,25 нг) промокали на двух разных мембранах, как описано в разделе 3. Мембраны были сшиты, заблокированы, и одну из них зондировали антителом S9.6 (рис. 1A).

Результаты показали, что сигнал S9.6 коррелирует с обилием загруженного образца. Лечение РНКазой H, но не РНКазой T1 или РНКазой III, приводит к снижению окрашивания S9.6.

Вторую мембрану зондировали с антителом к дцДНК (рис. 1B) для нормализации. Изображение J было использовано для анализа интенсивности сигнала. Образцы с концентрацией 50 нг были отобраны для количественного определения, поскольку интенсивность сигнала от антител к S9.6 и дцДНК находилась в динамическом диапазоне. Интенсивность сигнала была нормализована по сравнению с таковыми в имитационных образцах. Данные представлены на рисунке 2.

Дот-блоттинг антител S9.6 с использованием синтетических нуклеотидных контролей.
Для оценки специфичности антитела S9.6 мы использовали олигонуклеотиды, соответствующие дцРНК, дцДНК и РНК-ДНК, как описано в разделе 6. Серию разведения нуклеотидов РНК-ДНК, дцРНК и дцДНК готовили и промокали на нейлоновую мембрану, как описано в разделе 3. Мембрану зондировали антителом S9.6 (рис. 3). Результаты показали, что антитело S9.6 специфически связывается с гибридами РНК-ДНК дозозависимым образом и демонстрирует минимальную перекрестную реактивность к дцРНК и дцДНК.

Рисунок 1: Специфичность S9.6 по методу дот-блоттинга, загруженного нуклеиновыми кислотами из фибробластов человека. Образцы нуклеиновых кислот из фибробластов человека подвергали либо имитационной обработке, либо обработке РНКазой Т1, РНКазой Н или РНКазой III, а затем загружали на нейлоновые мембраны в серии разведения 200, 100, 50, 25, 12,5 и 6,25 нг на 2 мкл точки. Затем мембраны зондировали антителом S9.6 (A) или антителом dsDNA (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Количественное определение окрашивания R-петлей S9.6. Образцы массой 50 нг из рисунка 1 были выбраны для количественного определения с помощью ImageJ. Сигнал S9.6 делили на интенсивность сигнала дцДНК, а затем нормализовали до фиктивного образца в соответствии с шагами, описанными в разделе 7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: S9.6 dot-blot с использованием олигонуклеотидного контроля. Антитела S9.6 дот-блоттинг против ряда разведенных синтетических олигонуклеотидов в виде дцРНК, дцДНК или гибрида РНК-ДНК. S9.6 специфически связывается с гибридами РНК-ДНК дозозависимым образом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Буфер для лизиса клеток	Для 10 мл	Для 200 мл	Финальная кон.
Вода, без нуклеаз	9 мл	180 мл	-
10% NP-40	0,5 мл	10 мл	0.5%
2М KCl	0,4 мл	8 мл	80 мМ
ТРУБЫ 0,5 М (pH 8,0)	100 мкл	2 мл	5 мМ
Буфер для ядерного лизиса	Для 10 мл	Для 200 мл	Финальная кон.
Вода, без нуклеаз	8,65 мл	173 мл	-
10% паспорта безопасности	1 мл	20 мл	1%
1М Tris-HCl (pH 8,0)	0,25 мл	5 мл	25 мМ
0,5 М ЭДТА	100 мкл	2 мл	5 мМ
Элюирующий буфер	Для 10 мл	Для 200 мл	Финальная кон.
1М Tris-Cl, pH 8,5	0,1 мл	2 мл	10 мМ
Вода, без нуклеаз	9,9 мл	198 мл	-

Таблица 1. Подготовка буферов

Шаг	Проблема	Возможная причина	Решение
1.9	Н/Д	Проверка фракционирования клеток	Качество ядерного и цитоплазматического разделения можно оценить путем добавления в клетку стандартных коктейлей ингибиторов протеазы и буферов для лизиса ядра (табл. 1).  Цитоплазматические и ядерные фракции могут быть оценены с помощью вестерн-блоттинга, чтобы подтвердить адекватное ограничение мечения цитоплазматическими маркерами (например, GAPDH или HSP90) в цитоплазматических фракциях и мечение ядерными маркерами (например, HDAC1 или Histon H3) в ядерных фракциях. Вклад митохондриального загрязнения в ядерную фракцию может быть оценен с помощью количественного ПЦР-анализа с использованием зондов, специфичных для митохондриальной ДНК.
2.1	Проба слишком вязкая	Слишком большое количество ячеек.	Уменьшите ДНК вдвое и перейдите к шагу ультразвуковой обработки 2.1
2.12	Нет видимых гранул	Недостаточное количество исходного материала или потери при экстракции.	Начните с самого начала, используя больше ячеек.
2.13	Низкая концентрация ДНК
3.1	Недостаточно ДНК для разведения
3.4	Образец не будет насыщаться мембраной		Замочите мембрану в 1x TBST. Дайте лишнему буферу высохнуть и начните с шага 3.4
4.6	Обнаружен пятнистый или крапчатый рисунок		Добавьте в образец 0,1% додецилсульфата натрия (SDS) и продолжайте на шаге 3.1
4.6	Точки имеют вид «кофейного кольца»		Добавьте в образец 0,01% саркозила и продолжайте с шага 3.1
5.2	Контроль RNaseH не показывает снижения сигнала	Переваривание рибонуклеазы неполное.	Увеличьте инкубацию или увеличьте концентрацию ферментов.
6.5	Нет сигнала для олигорегуляторов	Дуплекс не был сформирован. Олигонуклеотиды не были должным образом отожжены.	Проверьте соотношение олигонуклеотидов и буфера для отжига.
6.5	Сигнал S9.6 не специфичен для гибридов	Партия антител S9.6 имеет неспецифическое связывание	Валидация чувствительности и специфичности новых партий антител S9.6 с использованием ферментов РНКазы или анализа синтетических олигонуклеотидов.

Таблица 2: Устранение неполадок

ssRNA, верхняя цепь	5'-UGGGGGCUCGUCCGGGAUAUGGGAACCACUGAUCCC-3'
ssDNA, верхняя прядь	5'-TGGGGGCTCGTCCGGGATATGGGAACCACTGATCCC-3'
ssRNA, нижняя цепь	5'-GGGAUCAGUGGUUCCCAUCGGACGAGCCCCCA-3'
ssDNA, нижняя цепь	5'-GGGATCAGTGGTTCCCATATCCCGGACGAGCCCCCA-3'

Таблица 3. Контроль олигонуклеотидных последовательностей

Discussion

3-цепочечные нуклеиновые кислоты, R-петли, образуются на разных стадиях жизненного цикла РНК и все чаще регулируют клеточные процессы. Чтобы полностью понять R-петли, необходимы надежные методы обнаружения R-петель. В данной статье мы описываем подход к исследованию обилия R-петель с использованием антитела^{S9.6 8,23,24}. Этот метод позволяет быстро оценить распространенность R-петли из клеток и образцов тканевых культур. Для этого не требуется специальное оборудование, или большое количество исходного материала. Он обеспечивает специфические и воспроизводимые результаты с помощью комбинации РНКазных методов лечения.

Некоторые сообщали об опасениях по поводу специфичности антитела S9.6. Как и в случае с любым реагентом, в отношении антитела S9.6 может наблюдаться вариабельность от партии к партии. Наш протокол включает в себя РНКазу H, РНКазу T1 и РНКазу III для проверки специфичности сигнала. Кроме того, мы используем синтетические олигонуклеотиды для обеспечения специфичности каждой партии антител к S9.6.

Биология R-петли — это растущая область; Разработка надежных методов обнаружения и количественной оценки, подобных представленному здесь, облегчит механистические исследования для выяснения того, когда образуются R-петли, как они регулируются и что они регулируют. При наличии соответствующего контроля этот дот-блоттинг является простым методом скрининга распространенности R-петли в клинических и исследовательских условиях.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Антитело против дцДНК	Abcam	ab27156
Гибридное антитело против РНК-ДНК (S9.6)	Kerafast	ENH001
Ультразвуковой аппарат Biorupter	Diagenode	UCD-200
EB Buffer	Qiagen	19086
EDTA (0.5M)	Invitrogen	AM9261
Hybond N+ нейлоновая мембрана	GE healthcare Life Науки	RPN203B
KCl (2M)	Invitrogen	AM9640G
NP-40 (Igepal CA-630)	Sigma	I8896
PBS	Invitrogen	10010-023
Фенол:хлороформ:изоамиловый спирт	Invitrogen	15593031
ТРУБКИ (0,5M, pH 8,0)	VWR	AAJ61406-AE
Proteinase K	Qiagen	19131
РНКаза III	Invitrogen	AM2290
РНКаза H	New England Biolabs	M0297
РНКаза T1	ThermoFisher Sci.	EN0541
SDS (10%)	Invitrogen	15553027
ацетат натрия (3M, pH 5,2)	Invitrogen	AM9740
Tris-buffered (10X)	Corning	46-012-CM
Tris-HCl (1M, pH 8,0)	KD Medical	RGF-3360
TrypLE	Invitrogen	12605010
Tween-20	Sigma	P9416
UV Stratalinker 2400	Stratagene	Stratalinker 2400
Ватман маркерная ручка	Sigma	WHA10499001