Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Мышиная модель хронического панкреатита с помощью инфузии TNBS желчных протоков

3.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62080

⸱

28 февраля 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Medical University of South Carolina, 2Ralph H. Johnson Veterans Affairs Medical Center

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Хронический панкреатит (ХП) – это заболевание, характеризующееся воспалением и фиброзом поджелудочной железы, часто связанное с трудноизлечимыми болями в животе. Эта статья посвящена совершенствованию метода генерации мышиной модели CP с помощью инфузии желчных протоков с 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислотой (TNBS).

Аннотация

Хронический панкреатит (ХП) является сложным заболеванием, включающим воспаление и фиброз поджелудочной железы, атрофию желез, боль в животе и другие симптомы. Для изучения ДЦП было разработано несколько моделей грызунов, из которых инфузионная модель желчного протока 2,4,6-тринитробензоловой сульфоновой кислоты (TNBS) воспроизводит особенности невропатичной боли, наблюдаемой при ДЦП. Тем не менее, инфузия препарата желчных протоков у мышей технически сложна. Данный протокол демонстрирует процедуру инфузии TNBS желчных протоков для генерации модели мыши CP. TNBS вливали в поджелудочную железу через ампулу Фатера в двенадцатиперстной кишки. Этот протокол оптимизировал объем препарата, хирургические методы и обращение с лекарствами во время процедуры. Мыши, получаемые TNBS, показали особенности CP, отраженные в снижении массы тела и веса поджелудочной железы, изменениях в поведении, связанном с болью, и аномальной морфологии поджелудочной железы. С этими улучшениями смертность, связанная с инъекцией TNBS, была минимальной. Эта процедура не только имеет решающее значение для создания моделей заболеваний поджелудочной железы, но также полезна для местной доставки лекарств поджелудочной железе.

Введение

Хронический панкреатит (ХП) является хроническим воспалительным заболеванием, характеризующимся атрофией поджелудочной железы, фиброзом, болью в животе и возможной потерей как экзокринных, так и эндокринных функций1. Современные медицинские и хирургические методы лечения не являются лечебными, но предпринимаются для облегчения симптомов, которые являются следствием заболевания: рефрактерная боль в животе, эндокринная и экзокриновая дисфункция. Поэтому срочно необходимы более эффективные методылечения 2. Животные модели обеспечивают важный инструмент для развития лучшего понимания заболевания и исследования потенциальных терапевтических средств3. Было разработано несколько моделей мышей для CP, из которых обычно используются модели церулеина и / или алкоголя. Было показано, что церулеин, олигопептидно-стимулирующий секрецию поджелудочной железы, воспроизводимо индуцирует модель CP с атрофией поджелудочной железы, фиброзом, среди прочих4. Другая распространенная модель использует серийные инъекции L-аргинина, который вызывает экзокриновую недостаточность, аналогичную той, которая наблюдается у пациентов с человеческим5. ДЦП также может быть индуцирована полным или частичным лигированием протоков поджелудочной железы, а также гипертонией протоков поджелудочной железы6,7. Несмотря на разнообразие животных моделей, доступных для ДЦП, ни одна из этих моделей эффективно не воспроизводит боль в животе, испытываемую пациентами сДЦП 8.

Предыдущие исследования показали, что местная инъекция поджелудочной железы 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислоты (ТНБС) воспроизводит постоянную боль, испытываемую пациентами сДЦП 9,10,11. Мыши, получавших TNBS, продемонстрировали абдоминальную гиперчувствительность и повышенное поведение, связанное с болью, а также «генерализованную гиперчувствительность» к болевым раздражителям, явление, которое наблюдалось у пациентов с ДЦП10. В дополнение к точному имитированию боли CP, модель TNBS также воспроизводит другие патологические особенности состояния человека, такие как фиброз, инфильтрация мононуклеарных клеток и замена ацинарных клеток жировойтканью 10,12. Тем не менее, инфузия TNBS через желчный проток является технически сложной процедурой у мышей, которая может привести к смерти. Насколько нам известно, не существует визуального протокола, чтобы показать, как выполняется инфузия желчных протоков. В этой статье мы продемонстрируем процедуру инфузии желчи TNBS для генерации модели мыши CP. Эта процедура поможет создать ценные животные модели для изучения ДЦП и других заболеваний поджелудочной железы и может быть использована для влития других материалов (например, вируса, клеток) в поджелудочную железу13.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры были проведены с одобрения институциональных комитетов по уходу за животными и их использованию в Медицинском университете Южной Каролины и Медицинском центре Ральфа Х. Джонсона. В этом исследовании использовались самцы мышей C57BL/6J в возрасте от 8 до 10 недель. Мышей размещали по стандартному циклу 12 светлых/ 12 темных с ad libitum доступом к пище и воде.

1. Приготовление раствора TNBS для инъекций

  1. Готовят 10% этанол в 0,9% физиологического раствора. Растворить запас TNBS (см. Таблицу материалов)в 10% этаноле до конечной концентрации 7,5 мМ путем добавления 7,5 мкл TNBS в 1 мл 10% этанола.
    ВНИМАНИЕ: TNBS представляет химическую опасность. Подготовьте раствор внутри вытяжного капюшона и используйте средства индивидуальной защиты, такие как перчатки, очки и лабораторный халат, чтобы избежать прямого контакта с TNBS.
  2. Загрузите 50 мкл 0,75% раствора TNBS в инсулиновый шприц с помощью иглы 31-го калибра. Загрузите 50 мкл 10% этанола в физиологический раствор в шприц того же размера, что и управление транспортным средством. Поместите шприцы на лед и защитите их от света до тех пор, пока это не понадобится.

2. Подготовка и хирургия мышей

  1. Сбрить волосы из брюшной полости хирургической области.
  2. Вводят одну упреждающей дозу анальгетика (например, бупренорфина 0,1 мг/кг в.п.) перед операцией.
  3. Индуцировать и поддерживать мышь под общим наркозом с 1,5-2% изофлурана и 1 л/мин кислорода. Подтвердите анестезию, ущипнив щипать ноши и наблюдая за животным на отсутствие рефлекса.
  4. Поместите мышь на нагретую хирургическую прокладку во время операции. Наносите ветеринарную мазь на каждый глаз, когда мышь находится под наркозом.
  5. Продезинфицируйте место операции, протирая хирургическую область 3x 2% йода, а затем 70%спиртом (Таблица материалов).
  6. Выполните лапаротомию микроножами для создания разреза 0,5-1 см.
  7. Осторожно обнажите двенадцатиперстную кишки и найдите общий желчный проток с помощью ватных тампонов(Таблица материалов).
  8. Поместите прямой микро-гемозажим(Таблица материалов)над проксимальным общим протоком, чтобы предотвратить поступление TNBS или растворов транспортных средств в печень и желчный пузырь(рисунок 1A,B).
  9. Осторожно обнажите двенадцатиперстную кишку и вставьте иглу в проток поджелудочной железы через сосочек Фатера.
  10. Как только игла находится внутри протока, поместите изогнутый микро-гемозажим(Таблица материалов)над двенадцатиперстной кишкой, окружающей иглу(рисунок 1А),чтобы закрепить иглу на месте и предотвратить попадание введенного раствора в двенадцатиперстную кишки.
  11. Постепенно вводят раствор (ТНБС или носитель) в проток поджелудочной железы в течение одного мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: TNBS необходимо вводить медленно в течение одной минуты времени, и легко контролировать скорость инфузии, когда поджелудочная железа перфузирована инсулиновым шприцем с иглой 5/16 дюйма и 31G. Держите руку как можно более устойчивой, чтобы избежать прокалывания желчного протока. Если TNBS успешно введен, желтый цвет может быть виден внутри поджелудочной железы.
  12. После инфузии осторожно снимите микрозажим возле печени, а затем удалите микрозажим, удерживая иглу и двенадцатиперстную кишки.
  13. Осторожно верните двенадцатиперстную кишки в исходное положение.
  14. Оставьте 0,5 мл теплого стерильного физиологического раствора (36-37 °C) в брюшной полости до закрытия, чтобы помочь двенадцатиперстной кишки вернуться в исходное положение и помочь с восстановлением перистальтики.
  15. Закройте разрез в мышечном слое с помощью непрерывного шва с 5-0 швом. Закройте кожу прерывым швом швом 4-0.
  16. Поместите клетку, содержащую мышей, на грелку, чтобы обеспечить восстановление после анестезии.
  17. Подтвердите, что мыши теплые и способны к спонтанному движению, прежде чем вернуть их в комнату для хранения.
  18. Продолжайте принимать анальгетик (например, бупренорфин 0,1 мг/кг в/кг в/п.) каждые 12 ч и дополнительное тепло в течение 48 ч после операции.

3. Мониторинг поведения мыши

  1. Снимают швы на 7 день после операции.
  2. Ежедневно контролируйте здоровье и поведение мышей в течение первой недели после операции. Следите за признаками дистресса, такими как вокализация, сгорбленная поза спины или снижение локомоции. Измеряйте массу тела через день.
  3. Используйте мононити фон Фрея (VFF) для измерения абдоминальной механической гиперчувствительности до и через 2, 3 недели после операции, как описано9,14.
    1. Применяют ФПФ различных приложенных сил в порядке возрастания к верхней области живота 10 раз в 1-2 с. Рассматривайте поднятие, втягивание или облизывание живота (реакция отмены) как положительную реакцию.
    2. Применяйте более сильный стимул, если положительный ответ не наблюдается, и более слабый стимул, если наблюдается положительный ответ. Порог вывода — это сила, с которой мышь реагирует в 50% случаев.

4. Сбор и гистологический анализ тканей поджелудочной железы

  1. Приносят мышей в жертву под наркозом при вывихе шейки матки, и тщательно рассекивают поджелудочную железу от кишечника и других органов.
  2. Зафиксируйте поджелудочную железу в 10% параформальдегиде в течение 24 ч, вставьте в парафин, вырежьте участки тканей толщиной 5 мкм и поместите их на стеклянные слайды для окрашивания.
  3. Выполняют гематоксилин-эозин и трихромное окрашивание Массона с использованием стандартных методов, как сообщалосьранее 4.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Процедуры инфузии желчных протоков были оптимизированы для снижения смертности мышей, связанной с этой процедурой10. TNBS впервые давали в общем объеме 35 мкл или 50 мкл. Инъекция ТНБС в объеме 50 мкл может достичь всей поджелудочной железы и вызвать более однородный фенотип заболевания(рисунок 1В). Кроме того, инъекция TNBS с использованием инсулинового шприца с иглой 31G может лучше контролировать скорость инфузии по сравнению с обычными шприцевыми шприцевыми шприце...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Инфузия желчных протоков TNBS для индуцирования хронического панкреатита технически сложна у мышей, так как до 22,5% мышей могут умереть в течение 3-4 дней после инфузии препарата10. Здесь этот отчет уточнил процедуру, основанную на предыдущих исследованиях, и снизил раннюю смертность мышей до <10%. Например, увеличенный объем препарата (с 35 мкл до 50 мкл) может гарантировать, что препараты достигнут всей поджелудочной железы. Использование инсулинового шприца и меньшего размера иглы (31G) уменьш...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Все авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

Это исследование было поддержано Департаментом по делам ветеранов (VA-ORD BLR & D Merit I01BX004536) и грантами Национального института здравоохранения No 1R01DK105183, DK120394 и DK118529 для HW. Мы благодарим д-ра Хунджу Ву за обмен техническим опытом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10% нейтральный буферизованный формалин v/vFisher Scientific23426796
Спиртовые прокладки, стерильныеFisher Scientific22-363-750
Система для анестезии животныхVetEquip, Inc.
Бупренорфина гидрохлорид, инъекцияPar Sterile Products, LLCNDC 42023-179-05
Центрифужные пробирки, 15 мл FisherScientific0553859A
Этанол, абсолютный (200 пруф), класс молекулярной биологии FisherScientificBP2818500
Сверхтонкие микродиссекционные ножницы 4" прямые острыеRoboz Surgical Instrument Co.RS-5882
Щипцы Graefe 4 дюйма с экстра нежным наконечникомRoboz Surgical Instrument Co.RS-5136
Подогреваемая прокладкаAmazonB07HMKMBKM
Hegar-Baumgartner Иглодержатель 5.25"Робоз Хирургический Инструмент Ко.RS-7850
Инсулиновый шприц с иглой 31 калибраBD324909
Прокладки для подготовки йодаFisher Scientific19-027048
Изофлуранпирамал для интенсивной терапииNDC 66794-017-25
Микрозажим для наложения щипцов 5,5"Робоз Хирургический Инструмент Ко.RS-5410
Микрозажим, прямой прочный изогнутый 1x6 ммRoboz Surgical Instrument Co.RS-5433
Микрозажим, прямой, ширина зажима 0,75 ммRoboz Surgical Instrument Co.RS-5420
Раствор пикрилсульфоновой кислоты, TNBS, 1М в H2OMillipore Sigma92822-1ML
Полипропиленовый шовный материал 4-0Med-Vet InternationalMV-8683
Полипропиленовый шовный материал 5-0Med-Vet InternationalMV-8661
Хлорид натрия, 0,9% раствор для внутривенного введенияVWR2B1322Q
Хирургическая простыня, стерильнаяMed-Vet InternationalDR1826
Тканевая кассетаFisher Scientific22-272416
Von Frey filamentsBiosebEB2-VFF
901806

Ссылки

  1. Klauss, S., et al. Genetically induced vs. classical animal models of chronic pancreatitis: a critical comparison. The Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 32, 5778-5792 (2018).
  2. Liao, Y. H., et al. Histone deacetylase 2 is involved in µ-opioid receptor suppression in the spinal dorsal horn in a rat model of chronic pancreatitis pain. Molecular Medicine Reports. 17 (2), 2803-2810 (2018).
  3. Gui, F., et al. Trypsin activity governs increased susceptibility to pancreatitis in mice expressing human PRSS1R122H. The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 189-202 (2020).
  4. Sun, Z., et al. Adipose Stem Cell Therapy Mitigates Chronic Pancreatitis via Differentiation into Acinar-like Cells in Mice. Molecular Therapy. 25 (11), 2490-2501 (2017).
  5. Aghdassi, A. A., et al. Animal models for investigating chronic pancreatitis. Fibrogenesis and Tissue Repair. 4 (1), 26(2011).
  6. Scoggins, C. R., et al. p53-dependent acinar cell apoptosis triggers epithelial proliferation in duct-ligated murine pancreas. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 279 (4), 827-836 (2000).
  7. Bradley, E. L. Pancreatic duct pressure in chronic pancreatitis. The American Journal of Surgery. 144 (3), 313-316 (1982).
  8. Zhao, J. B., Liao, D. H., Nissen, T. D. Animal models of pancreatitis: can it be translated to human pain study. World Journal of Gastroenterology. 19 (42), 7222-7230 (2013).
  9. Winston, J. H., He, Z. J., Shenoy, M., Xiao, S. Y., Pasricha, P. J. Molecular and behavioral changes in nociception in a novel rat model of chronic pancreatitis for the study of pain. Pain. 117 (1-2), 214-222 (2005).
  10. Cattaruzza, F., et al. Transient receptor potential ankyrin 1 mediates chronic pancreatitis pain in mice. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (11), 1002-1012 (2013).
  11. Bai, Y., et al. Anterior insular cortex mediates hyperalgesia induced by chronic pancreatitis in rats. Molecular Brain. 12 (1), 76(2019).
  12. Puig-Diví, V., et al. Induction of chronic pancreatic disease by trinitrobenzene sulfonic acid infusion into rat pancreatic ducts. Pancreas. 13 (4), 417-424 (1996).
  13. Zhang, Y., et al. PAX4 Gene Transfer Induces alpha-to-beta Cell Phenotypic Conversion and Confers Therapeutic Benefits for Diabetes Treatment. Molecular Therapy. 24 (2), 251-260 (2016).
  14. Ceppa, E. P., et al. Serine proteases mediate inflammatory pain in acute pancreatitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (6), 1033-1042 (2011).
  15. Puig-Divi, V., et al. Induction of chronic pancreatic disease by trinitrobenzene sulfonic acid infusion into rat pancreatic ducts. Pancreas. 13 (4), 417-424 (1996).
  16. Xu, G. Y., Winston, J. H., Shenoy, M., Yin, H., Pasricha, P. J. Enhanced excitability and suppression of A-type K+ current of pancreas-specific afferent neurons in a rat model of chronic pancreatitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 291 (3), 424-431 (2006).
  17. Drewes, A. M., et al. Pain in chronic pancreatitis: the role of neuropathic pain mechanisms. Gut. 57 (11), 1616-1627 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Инфузия в желчный протокфиброз поджелудочной железывоспаление поджелудочной железынейропатическая больатрофия поджелудочной железыхирургическая техникадоставка лекарственных средств в поджелудочную железу
Мышиная модель хронического панкреатита с помощью инфузии TNBS желчных протоков
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.