Методическая статья

Лазерная микродиссекция хирургических тканей для выявления аберрантной экспрессии генов при нарушенном заживлении ран при сахарном диабете 2 типа

DOI:

10.3791/62091

⸱

13 января 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Skin Sciences, University of Bradford, 2The Charles Institute of Dermatology, School of Medicine, University College Dublin, 3University of Baghdad

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот метод дает руководство по нанесению ран ex vivo , выполнению микродиссекции лазерного захвата и количественной оценке изменений экспрессии генов, связанных с плохими процессами заживления ран при диабете, с использованием клинически значимых тканей человека.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Глобальная распространенность сахарного диабета 2 типа (СД2) растет быстрыми темпами. Пациенты с СД2 страдают от множества осложнений, одним из которых является нарушение заживления ран. Это может привести к развитию незаживающих язв или язв на стопе и, в конечном итоге, к ампутации. У здоровых людей заживление ран следует контролируемой и перекрывающейся последовательности событий, охватывающей воспаление, пролиферацию и ремоделирование. При СД2 один или несколько из этих этапов становятся дисфункциональными. Современные модели для изучения нарушения заживления ран при СД2 включают анализы царапин ран in vitro, кожные эквиваленты или животные модели для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе заживления ран, и/или потенциальных терапевтических вариантов. Тем не менее, они не полностью повторяют сложный процесс заживления ран у пациентов с СД2, а кожные тесты ex vivo у человека проблематичны из-за этичности взятия пункционной биопсии у пациентов, у которых известно, что они плохо заживут. Здесь описан метод, с помощью которого профили экспрессии специфических клеток, участвующих в (дис)функциональной реакции заживления ран у пациентов с СД2, могут быть исследованы с использованием излишков ткани, отброшенных после ампутации или плановой косметической хирургии. В этом протоколе образцы донорской кожи собираются, ранятся, культивируются ex vivo на границе раздела воздушной жидкости, фиксируются в разные моменты времени и разрезаются. Конкретные типы клеток, участвующие в заживлении ран (например, эпидермальные кератиноциты, дермальные фибробласты (папиллярные и сетчатые), сосудистая сеть) выделяют с помощью микродиссекции лазерного захвата, а различия в экспрессии генов анализируют с помощью секвенирования или микрочипа, а представляющие интерес гены дополнительно валидируют с помощью количественной ПЦР. Этот протокол может быть использован для выявления врожденных различий в экспрессии генов между плохо заживающей и неповрежденной кожей у пациентов с диабетом или без него, используя ткани, обычно отбраковываемые после операции. Это позволит лучше понять молекулярные механизмы, способствующие развитию хронических ран при СД2 и потере нижних конечностей.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Заболеваемость диабетом 2 типа растет во всем мире, что обусловлено эпидемией ожирения и отсутствием физической активности. У этих пациентов часто наблюдается плохое заживление ран, и у 25% пациентов развивается хроническая незаживающая рана1. Механизмы, лежащие в основе этого, сложны и не до конца понятны, что ограничивает скорость открытия новых методов лечения. Одним из факторов, способствующих этому, является отсутствие подходящей модели для изучения заживления ран у пациентов с сахарным диабетом 2 типа. Таким образом, цель данного метода состоит в том, чтобы предоставить физиологически актуальную модель ex vivo для изучения заживления ран у лиц с риском хронических ран, что позволит проводить транскриптомный анализ для дальнейшей идентификации новых терапевтических мишеней.

В настоящее время существует несколько моделей для изучения заживления ран, и каждая из них имеет свои сильные и слабые стороны. Широко используются животные модели in vivo, такие как мышь db/db2 или крысы с диабетом3, вызванные стрептозотоцином; Тем не менее, раны на моделях грызунов заживают за счет сокращения, которое сильно отличается от механизма, используемого в человеческом организме, и имеют ограниченный успех вклинических испытаниях. Преимущества использования человеческих тканейхорошо известны, но они осложняются этичностью нанесения экспериментальных ран людям, у которых уже известно, что у них нарушена реакция заживления ран. Следовательно, исследования на людях с диабетом чаще всего направлены на воспалительную реакцию, а не на эксперименты на иссеченнойткани. Также доступны модели Organ-on-a-Chip7 и искусственная кожа8. Их преимущество заключается в том, что они позволяют анализировать вклад клеток человека, но дают мало указаний на межпациентскую вариабельность. Таким образом, клинически значимые модели для изучения прогресса заживления ран в уязвимых группах пациентов могут ускорить механистическое понимание и открытие лекарств в этой области.

Протокол ранения ex vivo , описанный ниже, адаптирован из Stojadinovic and Tomic-Canic, 20139. Он подходит для изучения транскрипционных данных контролируемого ранения образцов тканей человека ex vivo и может быть применен к клиническим образцам от пациентов с плохим заживлением ран (например, диабет 2 типа, пожилые люди) с целью расширения знаний о том, как влияет на заживление ран в этих условиях и потенциально как оно может быть восстановлено.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол основан на предоставлении хирургической ткани человека. Перед началом эксперимента было получено этическое одобрение и информированное согласие пациента, и исследование соответствовало принципам, изложенным в Хельсинкской декларации.

1. Забор тканей и нанесение ран ex vivo

  1. Соберите хирургическую ткань после ампутации/операции конечности в стерильный контейнер, содержащий модифицированную среду Dulbecco Eagle Medium (DMEM) с 5% пенициллин-стрептомицин-фунгизона, 2 мМ L-глутамина и 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS; полная питательная среда).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Собранную таким образом ткань можно хранить при температуре 4 °C до 24 часов до начала эксперимента. Чтобы обеспечить жизнеспособность ткани для экспериментов ex vivo , рекомендуется обрабатывать ткань как можно скорее или поддерживать фиксированный временной промежуток между сбором и ранением для стандартизации экспериментов по нескольким донорским тканям. Если ткань должна храниться в течение какого-либо периода времени, в образец следует добавить раствор для стабилизации РНК для поддержания целостности РНК.
  2. С помощью стерильных щипцов перенести ткань в чашку Петри диаметром 60 мм, заполненную стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS) с добавлением 5% пенициллин-стрептомицина-фунгизона. Срежьте жир с дермы с помощью стерильного скальпеля и/или хирургических ножниц и выбросьте. Переложите салфетку в свежую чашку Петри, наполненную стерильным ПБС.
  3. Соедините два стерильных лезвия вместе таким образом, чтобы между ними был зазор в 1 мм. Разрежьте две параллельные линейные линии, расположенные на расстоянии ~1 мм друг от друга, по длине эпидермиса и верхней части сосочкового слоя дермы10,11.
  4. Удалите эпидермис между линиями надрезов с помощью стерильных щипцов и хирургических ножниц, чтобы создать линейную рану.
  5. С помощью скальпеля разрежьте ткань на небольшие прямоугольники (максимальный размер 1 см2 ), охватывающие рану с неповрежденным эпидермисом с обеих сторон.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для поддержания целостности тканей и последующей РНК шаги 1.2-1.5 должны быть выполнены как можно быстрее.
  6. Сделайте изображение раненой ткани с помощью микродиссекционного микроскопа с 4-кратным увеличением, чтобы поле зрения захватывало всю рану и окружающие неповрежденные эпидермальные ткани.
  7. С помощью стерильных щипцов поместите тканевые прямоугольники на вкладыш для тканевых культур в 6-луночный планшет и аккуратно внесите в лунку 2 мл полной питательной среды. Это обеспечит культивирование образца на границе раздела жидкость-воздух.
  8. Инкубировать при 37 °C и 5%CO2 на воздухе в течение 120 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань должна быть визуализирована на микродиссекционном микроскопе с тем же увеличением, что и на шаге 1.6, в конце инкубации. При необходимости снимки также могут быть сделаны каждые 24 часа.

2. Фиксация тканей и криосекция

  1. Snap заморозьте ткань в жидком азоте. Поместите небольшое количество совместимого с криостатом режущего материала на патрон криостата и вставьте в него ткань. Ориентируйте ткань перпендикулярно лопаточной части так, чтобы режущая поверхность прорезала все слои кожи, включая раненый участок. Хранить при температуре -80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь.
  2. Очистите криостат при комнатной температуре с помощью 70% этанола и спрея для обеззараживания РНКазы. Установите температуру криостата на -28 °C.
  3. Убедитесь, что ориентация патрона и лезвия криостата позволяет создавать участки, охватывающие всю толщину ткани, включая поврежденную ткань и нижележащую дерму.
  4. С помощью криостата разрежьте до десяти срезов размером 7 мкм из каждой раны и поместите на предметные стекла для микродиссекции, не содержащие РНК.
  5. Храните предметные стекла в оригинальной коробке, в которой были предоставлены предметные стекла для микродиссекций, при температуре -80 °C, чтобы обеспечить среду без РНКазы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь, но имейте в виду, что деградация РНК будет увеличиваться по мере увеличения времени хранения.

3. Микродиссекция лазерного захвата

  1. Поместите предметные стекла с тканевым срезом в сухой лед и перейдите в комнату микродиссекционного микроскопа лазерного захвата.
  2. Высушите1-е предметное стекло на воздухе и быстро приступайте к окрашиванию срезов гематоксилином с использованием набора для окрашивания гематоксилином и эозином без РНКазы непосредственно перед выполнением микродиссекции лазерного захвата.
  3. Визуализируйте раненую ткань с помощью микродиссекционного микроскопа с лазерным захватом при 10-кратном увеличении и сделайте снимок области интереса, которая будет захвачена лазером.
  4. Проведите контур вокруг этой области (например, эпителиальный язык, грануляционная ткань, микрососуды) и соберите в микродиссекцию изолирующие колпачки диффузора объемом 0,5 мл, используя инструкции программного обеспечения для конкретного используемого микроскопа.
  5. Повторно визуализируйте и визуализируйте область, захваченную лазером, с помощью микродиссекционного микроскопа с лазерным захватом при 10-кратном увеличении, чтобы продемонстрировать местоположение и полное иссечение рассекаемой ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте лазерный захват для каждого образца (до 10 срезов) в течение максимум 1 часа, чтобы свести к минимуму деградацию РНК.
  6. Добавьте буфер для хранения РНК в пробирку, содержащую микрорассеченную ткань, в соответствии с инструкциями производителя и храните в сухом льду до тех пор, пока его нельзя будет перенести в морозильную камеру при температуре -80°C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть временно приостановлен здесь.

4. Количественная оценка дифференциальной экспрессии генов

  1. Центрифугируйте пробирки с образцами на полной скорости в течение 1 мин.
  2. Изолируйте РНК из микродиссекированной ткани, следуя инструкциям производителя.
  3. Разбавьте РНК в конечном объеме 12 мкл воды, свободной от РНКазы, и амплифицируйте РНК с помощью набора для амплификации РНК и термоамплификатора в соответствии с инструкциями производителя. Рекомендуется провести два раунда амплификации, чтобы обеспечить достаточное количество РНК для дальнейшего анализа. Используйте условия усиления, приведенные в таблице 1.
Первый раунд усиленияВторой раунд ампликации
Синтез первой цепиСинтез первой цепи
ШагТемператураВремяШагТемператураВремя
165 °C5 мин165 °C5 мин
24 °Cдержать24 °Cдержать
342 °C45 мин325 °С10 мин
44 °Cдержать437 °C45 мин
537 °C20 мин54 °Cдержать
695 °C5 мин
74 °CдержатьСинтез второй нити
ШагТемператураВремя
Синтез второй нити195 °C2 мин
ШагТемператураВремя24 °Cдержать
195 °C2 мин337 °C15
24 °Cдержать470 °C5 мин
325 °С5 мин54 °Cдержать
437 °C10 мин
570 °C5 минТранскрипция in vitro
64 °CдержатьШагТемператураВремя
142 °C6 ч
Транскрипция in vitro24 °Cдержать
ШагТемператураВремя337 °C15 мин
142 °C3 ч44 °Cдержать
24 °Cдержать
337 °C15 мин
44 °Cдержать

Таблица 1: Условия усиления.

  1. Количественно оцените концентрацию и чистоту амплифицированной РНК. Коэффициенты поглощения А260/230 (чистота) и А260/280 (загрязнения) > 1,8 подходят для дальнейшего анализа.
    Примечание: Очищенная амплифицированная РНК может быть использована для целенаправленных исследований экспрессии генов (шаги 4.5-4.6) или может быть отправлена для анализа микрочипов.
  2. Синтезируйте кДНК с помощью высокопроизводительного набора для обратной транскрипции кДНК в соответствии с инструкциями производителя. Репрезентативные условия следующие:
    • 25 °C в течение 10 мин
    • 37 °C в течение 2 ч
    • 85 °C в течение 5 мин
    • Выдержка 4 °C
  3. Количественную ПЦР проводят с использованием 0,5 мкл кДНК и 1 мкМ праймеров (интересующего гена) в соответствии с инструкциями производителя. Репрезентативные условия и последовательности праймеров выглядят следующим образом.
    1. Используйте следующие условия для количественных условий ПЦР: 95 °C в течение 10 минут; 40 циклов при температуре 95°C в течение 15 с и при 62°C в течение 1 мин; 95 °C в течение 5 мин; и держится при температуре 4°C.
    2. Используйте следующие последовательности праймеров:
      ГАПДХ
      Форвард 5'-TATAAATTGAGCCCGCAGCC-3'
      Реверс 5'-CGACCAAATCCGTTGACTCC-3'

      КРТ17
      Форвард 5'-AGGGAGAGGATGCCCACCTG-3'
      Реверс 5'-GCGGGAGGAGATGACCTTGC-3'

5. Интерпретация данных

  1. Рассчитайте скорость заживления ран с помощью изображений ткани ex vivo, полученных на шагах 1.6-1.8 с помощью ImageJ. В последнее время существует множество публикаций, в которых освещаются различные варианты автоматического анализа раневых участков в ImageJ 12,13,14.
  2. Количественно оцените экспрессию генов с помощью метода ΔCT , сравнивая пороговые циклы для интересующего гена с циклами домохозяйки (например, глицеральдегид-3-фосфат; GAPDH). Для этого обратите внимание на значение CT для домохозяйки и для интересующего гена.
    1. Рассчитайте разницу между двумя значениями CT , чтобы нормализовать количество присутствующей мРНК и контролировать различия в концентрациях экстракции РНК между различными изоляциями:
      ΔCT = CT (ген, представляющий интерес) - CT (домохозяйка)
    2. Рассчитайте величину разницы между значениями CT , чтобы получить относительную количественную оценку интересующего гена, выраженную в процентах от домохозяйки:
      Относительная количественная оценка = (2-ΔCT) x 100
    3. Изучите различия между различными донорами пациентов/состояниями заболеваний, сравнивая относительные количественные оценки генов, представляющих интерес для каждого образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Схему всей методики можно найти на рисунке 1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В соответствии с протоколом для получения репрезентативных результатов была выбрана временная точка продолжительностью 48 часов. Создание начальной раны в избыточной ткани в результате плановой косметической хирургии можно увидеть на рисунке 2A , где хорошо видна иссеченная рана. Окрашивание гематоксилином и эозином подтверждает, что при этом образовалась рана на всю толщину (Рисунок 2B). Через 48 ч под световым микроскопом видно частичное закрытие раны (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

По мере того, как заболеваемость хроническими заболеваниями, такими как диабет 2 типа, растет во всем мире, потребность в методах, которые могут облегчить патофизиологически значимые исследования, становится все более актуальной. Описанный выше протокол представляет собой стандартизированный метод изучения транскриптомных данных из ex vivo заживающих ран с использованием тканей человека.

Этот протокол зависит от предоставления излишков клинической тка...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ICP был поддержан 7-й Рамочной программой Европейской Комиссии по исследованиям и техническому развитию - Инновационные учебные сети Марии Кюри (ITN), Грантовое соглашение No: 607886. RW был поддержан компанией Aveda, Hair Innovation & Technology, США. RB, SS были поддержаны Центром кожных наук Университета Брэдфорда.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Arcturus RiboAmp PLUS наборThermoFisher ScientificKIT0521набор для амплификации РНК
Диффузорные колпачки 0,5 млMMIK10028161Лазерный захват микродиссекционных колпачков; 50 упаковок
Dulbecco' s Модифицированная среда Eagle (DMEM)Sigma-AldrichD6046с глюкозой 1000 мг/л, L-глутамином и бикарбонатом натрия, жидкая, стерильно отфильтрованная, подходит для клеточной культуры
Фетальная бычья сывороткаThermo Fisher Scientific10270106Добавка для клеточных культур
H& Набор для окрашивания E Staining Kit PlusMMIK10028305Набор для окрашивания гематоксилина и эозина без РНАЗы Набор
окрашивания кДНК высокой емкости Набор для обратной транскрипцииApplied Biosystems4368814Набор для обратной транскрипции
L-глютаминThermo Fisher Scientific25030149Добавка для клеточных культур
MembraneSlidesMMIK10028153Laer capture микродиссекционные стекла; 5 штук в коробке
Сетчатая вставкаNetwell Corning3479Вставка для клеточных культур
Пенициллин-Стрептомицин-ФунгизонThermo Fisher Scientific15070-063Добавка для клеточной культуры
15290-026
OCTTissue-Tek Sakura4583Криостат-совместимая режущая среда
PBSThermo Fisher Scientific10209252Пять таблеток на 100 мл стерильной воды, а затем автоклавирование для культивирования клеток используют
RNeasy Micro KitQiagen74004Набор для экстракции РНК
RNase AwaySigma-Aldrich83931РНКазный спрей
Стерильные лезвияНаучные лабораторные принадлежностиINS4974Инструменты для диссекции тканей
Поддержка SlideMMIK10028159Лазерный захват микродиссекции поддерживающая горка, хирургические ножницы без РНКазы
Научные лабораторные принадлежностиINS4860Инструменты для рассечения тканей
Хирургические щипцыНаучные лабораторные принадлежностиINS2026Инструменты для рассечения тканей
SYBR Green SupermixПрикладные биосистемы4344463Количественная ПЦР мастермикс
для

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gianino, E., Miller, C., Gilmore, J. Smart Wound Dressings for Diabetic Chronic Wounds. Bioengineering. 5 (3), Basel. (2018).
  2. Song, M., et al. Cryptotanshinone enhances wound healing in type 2 diabetes with modulatory effects on inflammation, angiogenesis and extracellular matrix remodelling. Pharmaceutical Biology. 58 (1), 845-853 (2020).
  3. Liu, J., et al. Involvement of miRNA203 in the proliferation of epidermal stem cells during the process of DM chronic wound healing through Wnt signal pathways. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 348(2020).
  4. Pastar, I., Wong, L. L., Egger, A. N., Tomic-Canic, M. Descriptive vs mechanistic scientific approach to study wound healing and its inhibition: Is there a value of translational research involving human subjects. Experimental Dermatology. 27 (5), 551-562 (2018).
  5. Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. Journal of Dermatological Science. 90 (1), 3-12 (2018).
  6. Mirza, R. E., Fang, M. M., Weinheimer-Haus, E. M., Ennis, W. J., Koh, T. J. Sustained inflammasome activity in macrophages impairs wound healing in type 2 diabetic humans and mice. Diabetes. 63 (3), 1103-1114 (2014).
  7. Ataç, B., et al. Skin and hair on-a-chip: in vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion. Lab Chip. 13 (18), 3555-3561 (2013).
  8. Yun, Y., Jung, Y. J., Choi, Y. J., Choi, J. S., Cho, Y. W. Artificial skin models for animal-free testing. Journal of Pharmaceutical Investigation. 48, 215-223 (2018).
  9. Stojadinovic, O., Tomic-Canic, M. Human ex vivo wound healing model. Methods in Molecular Biology. 1037, 255-264 (2013).
  10. Castellano-Pellicena, I., et al. Does blue light restore human epidermal barrier function via activation of Opsin during cutaneous wound healing. Lasers in Surgery and Medicine. 51 (4), 370-382 (2019).
  11. Rizzo, A. E., Beckett, L. A., Baier, B. S., Isseroff, R. R. The linear excisional wound: an improved model for human ex vivo wound epithelialization studies. Skin Research and Technology. 18 (1), 125-132 (2012).
  12. Castellano-Pellicena, I., Thornton, M. J. Isolation of epidermal keratinocytes from human skin: The scratch-wound assay for assessment of epidermal keratinocyte migration. Methods in Molecular Biology. 2154, 1-12 (2020).
  13. Suarez-Arnedo, A., et al. An imaje J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS ONE. 15 (7), 0232565(2020).
  14. Venter, C., Niesler, C. U. Rapid quantification of cellular proliferation and migration using ImageJ. Biotechniques. 66 (2), (2019).
  15. Al-Rikabi, A. H. A., Riches-Suman, K., Tobin, D. J., Thornton, M. J. A proinflammatory environment induces changes in the diabetic phenotype of human dermal fibroblasts derived from diabetic and nondiabetic donors: Implications for wound healing. Scientific Reports. , (2020).
  16. Chen, A., et al. Towards single-cell ionomics: a novel micro-scaled method for multi-element analysis of nanogram-sized biological samples. Plant Methods. 16, 31(2020).
  17. Lutz, B. M., Peng, J. Deep profiling of the aggregated proteome in Alzheimer's Disease: from pathology to disease mechanisms. Proteomes. 6 (4), 46(2018).
  18. Rinschen, M. M. Single glomerular proteomics: A novel tool for translational glomerular cell biology. Methods in Cell Biology. 154, 1-14 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

ex vivo
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи