Одномолекулярный анализ времени пребывания в рестрикции, опосредованном эндонуклеазой расщепления ДНК

Краткое содержание

Используя меченую квантовыми точками ДНК и флуоресцентную микроскопию с полным внутренним отражением, мы можем исследовать механизм реакции эндонуклеаз рестрикции при использовании немеченого белка. Этот метод с использованием одной молекулы позволяет массово мультиплексировать наблюдение за отдельными взаимодействиями белка и ДНК, а данные могут быть объединены для создания хорошо заполненных распределений времени пребывания.

Аннотация

Этот новый анализ, основанный на флуоресцентной микроскопии с полным внутренним отражением, позволяет одновременно измерять длину каталитического цикла для сотен отдельных молекул эндонуклеазы рестрикции (REase) в одном эксперименте. Этот анализ не требует мечения белка и может быть проведен с помощью одного канала визуализации. Кроме того, результаты нескольких отдельных экспериментов могут быть объединены для получения хорошо заполненных распределений времени пребывания. Анализ полученных распределений времени пребывания может помочь пролить свет на механизм расщепления ДНК, выявив наличие кинетических шагов, которые не могут быть непосредственно наблюдаемы. Примеры данных, собранных с помощью этого анализа с хорошо изученной REase, EcoRV - димерной эндонуклеазой рестрикции типа IIP, которая расщепляет палиндромную последовательность GAT↓ATC (где ↓ - место разреза) - согласуются с предыдущими исследованиями. Эти результаты свидетельствуют о том, что существует по крайней мере три этапа на пути к расщеплению ДНК, который инициируется введением магния после того, как EcoRV связывает ДНК в его отсутствие, со средней скоростью 0,17 ^с-1 для каждого этапа.

Введение

Эндонуклеазы рестрикции (РЕазы) — это ферменты, которые вызывают специфические для последовательности двухцепочечные разрывы в ДНК. Открытие REases в 1970-х годах привело к развитию технологии рекомбинантной ДНК, и в настоящее время эти ферменты являются незаменимыми лабораторными инструментами для генетической модификации и манипуляций^. РЕАЗЫ типа II являются наиболее широко используемыми ферментами в этом классе, поскольку они расщепляют ДНК в фиксированном месте либо внутри, либо рядом с их узнавающей последовательностью. Тем не менее, существует большая вариативность между РЕазами типа II, и они делятся на несколько подтипов на основе определенных ферментативных свойств, а не классифицируются в соответствии с их эволюционными отношениями. Среди каждого подтипа часто встречаются исключения из схемы классификации, и многие ферменты относятся к нескольким подтипам². Были идентифицированы тысячи РЕаз типа II, и сотни из них коммерчески доступны.

Однако, несмотря на разнообразие РЕаз II типа, очень немногие РЕазы были подробно изучены. Согласно REBASE, базе данных ферментов рестрикции^, созданной сэром Ричардом Робертсом в 1975 году, опубликованные данные кинетики доступны менее чем для 20 из этих ферментов. Кроме того, в то время как некоторые РЕазы непосредственно наблюдались на уровне одной молекулы во время диффундирования вдоль ДНК до встречи и связывания с их узнавающей последовательностью 4,5,6,7, существует очень мало исследований кинетики их реакции расщепления на одной молекуле. Существующие исследования либо не предоставляют адекватной статистики для проведения детального анализа вариации времен, в^{которые происходят отдельные} события расщепления8,9,10, либо не способны охватить полное распределение времен расщепления ¹¹. Этот тип анализа может выявить присутствие относительно долгоживущих кинетических промежуточных продуктов и может привести к лучшему пониманию механизмов REase-опосредованного расщепления ДНК.

На уровне отдельных молекул биохимические процессы носят стохастический характер — время ожидания выполнения одного экземпляра процесса, τ, является переменным. Тем не менее, можно ожидать, что многие измерения τ подчиняются распределению вероятностей p(τ), которое указывает на тип происходящего процесса. Например, одноступенчатый процесс, такой как высвобождение молекулы продукта из фермента, будет подчиняться статистике Пуассона, а p(τ) примет форму отрицательного экспоненциального распределения:

где β — среднее время ожидания. Обратите внимание, что скорость процесса, k, будет равна 1/β, что обратно пропорционально среднему времени ожидания. Для процессов, требующих более одного шага, p(τ) будет сверткой одноэкспоненциальных распределений для каждого из отдельных шагов. Общим решением для свертки N одноэкспоненциальных функций распада с одинаковым средним временем ожидания, β, является распределение гамма-вероятностей:

где Γ(N) — гамма-функция, описывающая интерполяцию факториала N-1 на нецелые значения N. Хотя это общее решение может быть использовано в качестве приближения, когда среднее время ожидания отдельных этапов одинаково, необходимо понимать, что наличие относительно быстрых шагов будет маскироваться шагами со значительно более длительным временем ожидания. Другими словами, значение N представляет собой нижний предел числа шагов¹². При достаточном количестве измерений времени ожидания параметры β и N могут быть оценены путем группирования событий и подгонки гамма-распределения к полученной гистограмме или с помощью метода оценки максимального правдоподобия. Таким образом, этот тип анализа может выявить наличие кинетических шагов, которые не могут быть легко устранены в ансамблевых анализах и требуют большого количества наблюдений для точной оценки параметров^12,13.

В данной статье описан метод использования меченой квантовыми точками ДНК и микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF) для наблюдения за сотнями отдельных REase-опосредованных событий расщепления ДНК параллельно. Дизайн анализа позволяет объединить результаты нескольких экспериментов и создать распределения времени пребывания, содержащие тысячи событий. Высокая фотостабильность и яркость квантовых точек позволяют получить временное разрешение 10 Гц, не жертвуя при этом возможностью наблюдать события расщепления, происходящие даже через много минут после начала эксперимента. Хорошее временное разрешение и широкий динамический диапазон в сочетании с возможностью сбора большого набора данных позволяют точно охарактеризовать распределения времени пребывания и выявить наличие множественных кинетических шагов в путях расщепления REases, которые имеют скорость оборота в диапазоне 1 ^мин-1 . В случае EcoRV можно выделить три кинетических этапа, каждый из которых был идентифицирован другими способами, подтверждая, что анализ чувствителен к присутствию таких этапов.

Дуплексные подложки ДНК, содержащие интересующую нас последовательность узнавания, получают путем отжига биотинилированного олигонуклеотида до комплементарной цепи, помеченной одной, ковалентно присоединенной полупроводниковой нанокристаллической квантовой точкой. Эти субстраты вводятся в проточный канал, построенный поверх стеклянного покровного стекла с газоном из высокомолекулярных молекул полиэтиленгликоля (ПЭГ), ковалентно прикрепленных к его поверхности. Субстраты ДНК захватываются через связь биотин-стрептавидин-биотин с помощью фракции молекул ПЭГ, которые имеют биотин на своем свободном конце. В микроскопии TIRF освещение обеспечивает затухающая волна, которая экспоненциально затухает с расстоянием от границы раздела стекло-жидкость; Глубина проникновения зависит от длины волны используемого света. В этих условиях возбуждаться будут только квантовые точки, которые привязаны к поверхности молекулой ДНК, захваченной на функционализированной стеклянной поверхности. Квантовые точки, которые находятся в свободном растворе, не будут ограничены в освещенной области и, следовательно, не будут люминецировать. Если ДНК, связывающая квантовую точку с поверхностью, расщепляется, эта квантовая точка будет свободно диффундировать прочь от поверхности и исчезнет с флуоресцентного изображения.

Хотя известно, что многие РЕазы II типа связываются с ДНК в отсутствие магния¹⁴, все они требуют магния для опосредования расщепления ДНК¹⁵. Эти РЕазы могут связывать поверхностно-иммобилизованную ДНК в отсутствие магния. Когда магнийсодержащий буфер пропускается через канал с предварительно связанной с ДНК РЕазой, немедленно начинается расщепление, о чем свидетельствует исчезновение квантовых точек. Синхронизация, достигаемая за счет предварительного связывания молекул REase, а затем инициирования расщепления ДНК путем введения магния, облегчает измерение времени задержки до завершения расщепления ДНК независимо для каждой молекулы в популяции ферментов, наблюдаемых в эксперименте. Флуоресцеин включен в качестве индикаторного красителя в магнийсодержащий буфер для указания на поступление магния в поле зрения. Поскольку в магнийсодержащий буфер не входит ни один фермент, время задержки от поступления магнийсодержащего буфера до исчезновения каждой квантовой точки указывает на время, необходимое для того, чтобы РЕаза, уже связанная с ДНК, расщепила ДНК и высвободила квантовую точку с поверхности стекла. Исчезновение квантовых точек происходит быстро и приводит к резкому снижению траектории интенсивности, что дает четкое представление о времени расщепления данной молекулы ДНК. Определение времени событий осуществляется путем математического анализа траекторий интенсивности, и типичный эксперимент приводит к сотням идентифицируемых событий расщепления. Результаты нескольких экспериментов могут быть объединены для получения адекватной статистики, позволяющей оценить параметры N и β либо с помощью нелинейного метода наименьших квадратов, либо анализа максимального правдоподобия.

Протокол

1. Общая информация

1. Олигонуклеотидный дизайн
   Примечание: Субстрат ДНК длиной 60 пар оснований (.н.) образован из пары комплементарных олигонуклеотидов с температурой плавления дуплекса 75 °C в 100 мМ NaCl.
   1. Закажите один олигонуклеотид синтезированным с одной 5'-модификацией биотина, а другой с 5'-тиоловой модификацией (с шестиуглеродным спейсером). Разместите сайт распознавания в центре области дуплекса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Олигонуклеотидные последовательности для использования с EcoRV показаны ниже (сайт распознавания выделен жирным шрифтом).
      5' биотин - AAA ACC GAC ATG TTG ATT TCC TGA AAC GGG ATA TCA TCA AAG CCA TGA ACA AAG CAG CCG - 3'
      5' тиол - CGG CTG CTT TGT TCA TGG CTT TGA TGA TAT CCC GTT TCA GGA AAT CAA CAT GTC GGT TTT - 3'
2. Используйте сверхчистую воду с удельным сопротивлением 18 МОм для всех этапов.
3. Защитите все растворы, содержащие квантовые точки, от света, чтобы предотвратить фотообесцвечивание.
4. Используйте источник сжатого воздуха для выполнения этого протокола.

2. Получение подложек ДНК, меченных квантовыми точками

Примечание: Помимо описанных выше олигонуклеотидов, см. Таблицу материалов для других материалов и Таблицу 1 для буферов, необходимых для получения субстратов ДНК, меченных квантовыми точками.

1. Восстановите 5'-тиоловые группы на олигонуклеотиде, который должен быть связан с квантовыми точками.
   1. Ресуспендируйте каждый тиолированный олигонуклеотид в воде в концентрации 100 мкМ.
   2. Пипетируйте 650 мкл воды в спиновую колонку исключения размера для каждого образца олигонуклеотида и делайте вихрь в течение ~15 с. Оставьте колонку упаковывать на 30 минут.
   3. Готовьте свежий 100 мМ раствор дитиотреитола (ДТТ) непосредственно перед каждым использованием, так как ДТТ быстро разлагается в растворе. Осторожно откройте один флакон, содержащий 7,7 мг DTT, и нанесите в флакон 500 мкл буфера фосфата натрия; Вортекс тщательно перемешать.
   4. Для каждого ресуспендированного олигонуклеотида приготовьте свежую пробирку и добавьте в пробирку 50 мкл олигонуклеотида и 50 мкл раствора DTT. Пипетируйте вверх и вниз, чтобы перемешать. Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре, чтобы уменьшить дисульфидные связи между окисленными тиоловыми группами на 5'-конце олигонуклеотидов.
   5. Снимите крышки спиновых колонок и поместите каждую колонку в сборную трубку. Центрифугируйте спиновые колонны при давлении 750 × г в течение 2 минут и выбросьте элюат.
   6. Переложите спиновые колонки в свежие центрифужные пробирки. Аккуратно нанесите весь объем (100 мкл) одного образца смеси ДНК/ДТТ на каждую подготовленную колонку. Центрифугируйте при 750 × г в течение 2 мин и измерьте поглощение элюата при длине волны 260 нм, чтобы подтвердить, что концентрация составляет примерно 40 мкМ.
   7. Все образцы, которые не будут использоваться немедленно, храните при температуре -20 °C, чтобы предотвратить окисление тиоловых групп и образование дисульфидных связей.
2. Сопряжение ДНК с квантовыми точками
   1. Пипетируйте одну аликвоту из 50 мкл квантовых точек в диализном устройстве для каждого изготовленного конструкта, следя за тем, чтобы не касаться мембраны наконечником пипетки. Диализ относительно объема буфера N-циклогексил-2-аминоэтансульфоновой кислоты (CHES), который по меньшей мере в 1000 раз превышает объем образца, при перемешивании со скоростью ~100 об/мин в течение 15 минут.
   2. Готовьте свежий 6 мМ раствор сульфосукцинимидил-4-(N-малеимидометил) циклогексан-1-карбоксилата (сульфо-SMCC) в буфере CHES непосредственно перед каждым применением. Осторожно откройте один флакон, содержащий 2 мг сульфо-SMCC, и нанесите в флакон 800 мкл буфера CHES. Вихрь тщательно перемешать.
   3. С помощью пипеттора осторожно извлечь взвешенные квантовые точки из диализного аппарата и перенести их в свежую пробирку, содержащую равный объем раствора сульфо-SMCC; Пипет вверх и вниз для перемешивания. Инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре с встряхиванием при 1000 об/мин, чтобы сульфо-SMCC вступил в реакцию с первичными аминами на квантовых точках.
   4. С помощью пипеток осторожно перенесите каждый образец в свежий аппарат для диализа. Для удаления избытка сульфо-SMCC проводят диализ в объеме буфера CHES, который по меньшей мере в 1000 раз превышает объем, содержащийся в диализном устройстве (устройствах), при перемешивании, в течение 15 минут. Замените буфер 2 раза и проведите диализ со свежим буфером CHES в общей сложности 3 раза, позволяя диализу продолжаться в течение 15 минут после каждой замены буфера.
   5. Чтобы заменить буфер при подготовке ко второй реакции, перенесите устройства для диализа в стакан, содержащий объем фосфатно-солевого буфера (PBS), который по меньшей мере в 1000 раз превышает объем, содержащийся в устройстве (устройствах). Диализируйте с помешиванием в течение 15 минут, замените буфер 2 раза и проведите диализ со свежим PBS в общей сложности 3 раза, позволяя диализу продолжаться в течение 15 минут после каждой замены буфера.
   6. С помощью пипеток осторожно извлеките раствор, содержащий квантовые точки, из диализного устройства (устройств) и перенесите каждый образец в свежую пробирку, содержащую эквимолярное количество тиолированного олигонуклеотида, разведенного в PBS. Соедините равный объем PBS и 1/10 объема восстановленного и очищенного образца олигонуклеотида (концентрация приблизительно 40 мкМ), поскольку концентрация квантовых точек в этой точке составляет ~4 мкм. Инкубируйте в течение 2 ч при комнатной температуре, встряхивая при 1000 об/мин.
   7. Добавьте бычий сывороточный альбумин (БСА, 10 мг/мл) в каждый образец для получения конечной концентрации 0,5 мг/мл БСА. С помощью пипеток осторожно перенесите каждый образец в новое устройство для диализа и проводите диализ в буфере для хранения, который по крайней мере в 1000 раз превышает объем, содержащийся в устройстве (устройствах) для диализа. Замените буфер 2 раза и проведите диализ со свежим буфером для хранения в общей сложности 3 раза, позволяя диализу продолжаться в течение 15 минут после каждой замены буфера.
   8. С помощью пипетора тщательно извлеките каждый образец, поместите его в новую пробирку и храните при температуре 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не храните при температуре -20 °C, так как квантовые точки повреждаются при замораживании.
3. Отжиг меченного квантовыми точками олигонуклеотида в биотинилированный олигонуклеотид
   1. Ресуспендируйте каждый биотинилированный олигонуклеотид в буфере для хранения в концентрации 100 мкМ. Храните неиспользованные образцы при температуре -20 °C.
   2. Объедините образец олигонуклеотида, меченного квантовыми точками, с 10-кратным молярным избытком биотинилированного олигонуклеотида. Поскольку расчетная концентрация ДНК в образце, меченном квантовыми точками, составляет 2 мкМ, добавьте 0,2 мкл биотинилированного олигонуклеотида на каждые 10 мкл этого образца.
   3. Нагрейте смесь в термоблоке до 75 °C (температура плавления для дополнительной области). Подержите при этой температуре 5 минут. Выключите нагревательный блок и дайте ему медленно остыть. Хранить готовый конструктив при температуре 4 °C; Не замораживайте.

3. Функционализация поверхности покровных листов

Примечание: Этот процесс был ранее описан в других видеопротоколах JoVE^16,17. Этот протокол описывает адаптированный вариант процедуры с незначительными изменениями для размещения стеклянного предметного стекла меньшего размера. Смотрите Таблицу материалов для других материалов, необходимых для функционализации поверхности покровных стекол.

1. Поместите по 5 покровных колпачков в каждый держатель покровных колпачков. Обязательно пропустите один пробел между каждой парой покровных стекол, чтобы они не прилипали друг к другу. Поместите покровные стекла в держатель в банку с крышкой, добавьте этанол в банку, пока покровные стекла не будут покрыты, и надежно закрутите крышку. Поместите всю банку в воду в ванну с ультразвуковой обработкой, не погружая ее полностью, и обработайте ультразвуком в течение 30 минут.
2. Наполните чистый стакан или банку сверхчистой водой. С помощью металлического пинцета удалите покровные стекла в держателе от этанола и погрузите их в воду для промывки. Затем переложите крышки и держатель в банку, содержащую 1 М раствор гидроксида калия (KOH). Надежно закрутите крышку, поставьте банку в ванну с ультразвуковой обработкой и обрабатывайте ультразвуком в течение 30 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны при работе с раствором KOH, так как он вызывает коррозию и раздражает.
3. Повторяйте обработку ультразвуком в этаноле и растворе KOH, промывая покровные стекла в воде, как описано выше, между каждым шагом.
4. Переложите покровные стекла в держателе в чистую банку, наполненную чистым ацетоном. Завершите очистку, просив банку ультразвуком, как описано выше, в течение 30 минут. После этого шага не смывайте водой.
5. С помощью металлического пинцета переложите покровные стекла в держателе в чистую стакан объемом 100 мл, содержащую 80 мл свежего ацетона и микрошкалу для перемешивания. Поместите стакан на магнитную пластину для перемешивания, установленную на частоту не менее 1 000 оборотов в минуту. Во время интенсивного перемешивания ацетона нанесите 1,6 мл 3-аминопропилтриэтоксисилана (APTES) в стакан, чтобы получить 2% v/v раствор.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны при пипетировании APTES, так как он вызывает коррозию.
6. Дайте покровным стеклам поинкубироваться в растворе в течение 2 минут, затем с помощью металлического пинцета переложите покровные стекла в держателе в стакан с водой, чтобы погасить реакцию. Промойте покровные стекла еще два раза, заменив воду в стакане.
7. Отверждите силанизированное стекло в духовке при температуре 120 °C в течение 75 минут. Если вы не можете сразу перейти к следующему шагу, храните покровные стекла под вакуумом не более нескольких дней.
8. Растворите N-гидроксисукцинимид (NHS) эфир-производные полиэтиленгликоли (ПЭГ) в 100 мМ бикарбонате натрия (pH 8,2). Используйте соотношение метоксиконцевого ПЭГ к биотин-концевому ПЭГ в соотношении 10:1 с ~100 мг/мл метоксиконцевого ПЭГ.
9. Нанесите 100 мкл раствора ПЭГ на половину сухих силанизированных покровных стекол и накройте каждую из них вторым покровным стеклом. Используйте небольшие кусочки парапленки, расположенные в каждом углу, в качестве распорок, чтобы покровные стекла не прилипали друг к другу.
10. Инкубируйте покровные стекла во влажной среде в течение 3,5 часов. Отделите бутерброды с чехлом. Используйте бутылку с распылением, чтобы промыть каждую покровную крышку обильным количеством воды и высушить сжатым воздухом.
11. Храните функциональные покровные стекла под вакуумом. Обязательно держите обработанную ПЭГ стороной вверх, потому что другая сторона не захватит субстрат ДНК.

4. Конструкция микрофлюидных устройств

ПРИМЕЧАНИЕ: Ознакомьтесь с Таблицей материалов для получения информации о других материалах, необходимых для изготовления микрофлюидного устройства.

1. С помощью ручного роторного мультитула, оснащенного коническим алмазным наконечником, просверлите два отверстия в противоположных углах кварцевого предметного стекла, которые будут служить входом и выходом. Обязательно закрепите суппорт на месте, смажьте сверло и постоянно скользите с водой во время бурения. После каждого эксперимента восстанавливайте подготовленное кварцевое предметное стекло для повторного использования, замачивая использованное устройство в ацетоне для растворения клея и эпоксидной смолы; Выбросьте оставшиеся компоненты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сверление может быть выполнено вручную, но использование держателя в виде пресса для мультитула облегчает процесс.
2. Смешайте 25 мкл раствора стрептавидина с 80 мкл PBS и 20 мкл блокирующего буфера. Покройте этой смесью покрытие, обработанное ПЭГ, и выдерживайте во влажной среде в течение 30 минут.
3. Во время инкубации покровного стекла подготовьте прокладку для формирования проточного канала. Отрежьте квадратный кусок размером 1 дюйм из материала распорки для визуализации, затем отметьте канал шириной 2 мм, выровненный по концам отверстий, просверленных в кварцевом предметном стекле (Рисунок 2). Вырежьте канал из материала распорки с помощью скальпеля.
4. Снимите одну сторону подложки с распорки изображения и осторожно поместите ее на кварцевый предметный стекол, стараясь не закрывать входные и выходные отверстия. Обязательно тщательно очистите кварцевое предметное стекло ацетоном, чтобы удалить остатки клея от предыдущих экспериментов.
5. Промойте покровное стекло водой, а просушите сжатым воздухом. Снимите другую сторону подложки с прокладки для визуализации и поместите ее между кварцевым предметным стеклом и функционализированным покровным стеклом, покрытым стрептавидином, используя пластиковый пинцет, чтобы прижать сборку друг к другу и удалить пузырьки воздуха из клея.
6. Вставьте по одной полиэтиленовой трубке длиной 30 см в каждое отверстие в кварцевом предметном стекле. Обязательно срезайте концы трубки под углом, чтобы обеспечить свободное поступление раствора. Используйте штатив для труб или другую опору, чтобы удерживать трубки на месте, и запечатайте трубки на месте и края собранного устройства эпоксидной смолой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошо подходит для сборки устройства на куске парапленки, который можно легко снять со дна, когда эпоксидная смола застынет.
7. После того, как эпоксидная смола застынет, вставьте тупую иглу на пустом шприце в выпускную трубку устройства и погрузите конец входной трубки в емкость, заполненную блокирующим буфером. Потяните поршень шприца назад, чтобы заполнить устройство блокирующим буфером. Перед использованием оставьте устройство для инкубации не менее чем на 30 минут.

5. Поверхностный связывание ДНК-субстрата, меченного квантовыми точками

Примечание: Помимо описанного выше микрофлюидного устройства, субстрата ДНК и блокирующего буфера, см. Таблицу материалов для других материалов и Таблицу 1 для буферов, необходимых для поверхностного связывания субстратов ДНК, меченных квантовыми точками.

1. Прикрепите микрофлюидное устройство к столику микроскопа с помощью ленты, приложите объектив к нижней части устройства и расположите объектив так, чтобы поле зрения находилось в микрофлюидном канале.
2. Промойте микрофлюидный канал свежим блокирующим буфером, оттянув поршень шприца назад после подключения выпускной трубки к шприцевому насосу. Убедитесь, что в трубке или в канале нет пузырьков.
   ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента убедитесь, что впускная трубка находится в жидкости, чтобы в устройство не попадали пузырьки воздуха.
3. Разведите 1 мкл приготовленного субстрата ДНК в 1 мл блокирующего буфера. Поместите входную трубку в разбавленный субстрат ДНК и пропустите через канал 800 мкл раствора субстрата со скоростью 200 мкл/мин. Дайте раствору ДНК спокойно инкубироваться в канале в течение 15 минут после остановки потока.
4. Пропустите не менее 800 мкл блокирующего буфера через канал со скоростью 200 мкл/мин, чтобы вымыть несвязанную ДНК из канала.
5. Отрегулируйте мощность лазера, фокусировку микроскопа и угол TIRF так, чтобы квантовые точки, привязанные к поверхности, были четко видны.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя квантовые точки не обесцвечиваются быстро, лучше поддерживать мощность как можно ниже, чтобы свести к минимуму мигание.

6. REase-опосредованное расщепление ДНК

Примечание: Материалы см. в Таблице материалов , а в Таблице 1 — буферы, необходимые для REase-опосредованного расщепления ДНК.

1. Убедитесь, что камера охлаждена до оптимальной рабочей температуры и настроена на высокоскоростную потоковую передачу с временем экспозиции 0,10 с. Будьте готовы собирать данные в течение ~4 мин.
2. Промойте микрофлюидное устройство 800 мкл экспериментального буфера без магния со скоростью потока 200 мкл/мин.
3. Добавьте REase в аликвоту (1 мл) экспериментального буфера без магния и аккуратно перемешайте с помощью пипетирования. Используйте 4 мкл из 100 000 единиц/мл запаса, что соответствует 400 единицам/мл EcoRV. Пропустите 800 мкл разведенного фермента через канал со скоростью потока 200 мкл/мин.
4. Начните эксперимент с подачи экспериментального буфера, содержащего магний и флуоресцеин, со скоростью потока 200 мкл/мин. Начните сбор данных сразу после запуска шприцевого насоса. После протекания 800 мкл буфера остановите сбор данных.

7. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите Таблицу материалов для программного обеспечения для анализа данных, используемого для этого протокола, и внесите коррективы, если используете другую платформу анализа.

1. Определение нулевой временной точки
   1. Вычтите фоновую флуоресценцию из каждого кадра экспериментального фильма с помощью функции imtophat , встроенной функции морфологической фильтрации цилиндров в наборе инструментов обработки изображений. В качестве структурирующего элемента выберите диск с радиусом три пикселя . Получите интенсивность фона путем вычитания отфильтрованного изображения из исходного изображения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтр сохраняет только те элементы изображения, которые ярче фона и меньше структурирующего элемента.
   2. Усредняйте вычитаемый фон по каждому кадру фильма. Используйте траекторию этого значения, чтобы определить нулевую временную точку для эксперимента (рис. 3A). Определите начальное время, найдя первый кадр, при котором скорость увеличения превышает стандартное отклонение скорости изменения во время потока мертвого объема.
      Примечание: Резкое увеличение скорости изменения среднего значения вычитаемого фона для каждого кадра фильма указывает на время, в которое окончательный экспериментальный буфер, содержащий индикаторный краситель, попал в проточную ячейку (рис. 3В).
2. Расчет и анализ траектории интенсивности квантовых точек
   1. Расчет проекции максимальной интенсивности для набора кадров фильма с коррекцией фона, записанных до поступления трассирующего красителя. Определите расположение квантовых точек с точностью до одного пикселя на этом проекционном изображении с помощью функции поиска пиков, такой как pkfnd.
   2. Генерируйте траектории интенсивности для отдельных квантовых точек, вычисляя среднюю интенсивность в каждом кадре фильма квадратной области с тремя пикселями на сторону, окружающей местоположение, возвращаемое функцией поиска пиков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Описанная выше коррекция фона удаляет артефакты, внесенные трассирующим красителем. Результирующие траектории интенсивности должны быть относительно плоскими, но все же включать естественные колебания интенсивности (рис. 4).
   3. Идентификация событий исчезновения квантовых точек путем статистического анализа траекторий интенсивности. Для каждой траектории интенсивности квантовых точек вычислите пороговую интенсивность, которая превышает минимальное значение на соответствующую долю разницы между максимальным и минимальным значениями для этой траектории, в зависимости от шума, наблюдаемого на траекториях.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Флуктуация интенсивности квантовой точки обычно намного больше, чем фоновая флуктуация. Подходящее значение можно определить путем сравнения этих значений: выбранный порог должен быть выше наибольшего фонового значения, но в идеале должен быть ниже наименьшего значения для флуоресценции квантовых точек. Для представленных данных используемый порог был рассчитан таким образом, чтобы он был выше минимального значения для каждой траектории плюс одна треть разницы между максимальными и минимальными значениями для этой траектории. Квантовую точку можно считать исчезнувшей в последний момент времени, когда наблюдаемая интенсивность в ее месте была выше этого порога.
   4. Подтвердите предполагаемые случаи исчезновения. Включайте события в окончательный анализ только в том случае, если наблюдаемая интенсивность находится выше средней точки между минимальным и максимальным значениями интенсивности для траектории более чем в половине кадров фильма до момента исчезновения, а стандартное отклонение траектории интенсивности уменьшилось после события.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Другие статистические тесты могут быть использованы для того, чтобы убедиться, что регистрируются только действительные события исчезновения.

Результаты

Проточная ячейка напрямую соединена с масляно-иммерсионным объективом с высокой числовой апертурой и 60-кратным увеличением на инвертированном микроскопе, оснащенном лазерной подсветкой для визуализации TIRF через объектив (рис. 5A). После введения субстрата ДНК и вымывания избытка ДНК и квантовых точек, в поле зрения, как правило, находятся тысячи отдельных квантовых точек (рис. Эти квантовые точки устойчиво прикреплены к поверхности стекла и не подвергаются за...

Обсуждение

Субстрат ДНК для этого анализа помечен квантовой точкой с помощью двухступенчатой схемы реакции с использованием сульфо-SMCC. Этот бифункциональный сшивающий агент состоит из эфирной группы NHS, которая может реагировать с первичным амином, и малеимидной группы, которая может реагировать с сульфгидрильной группой²⁰. Тиолированные олигонуклеотиды, используемые для приготовления субстрата, отгружаются в окисленной форме. Важно уменьшить и очистить их, как описано, прежде чем приступать к процедуре с...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
3-аминопропилтриэтоксисилан (APTS)	Sigma Aldrich	440140-100ML	Хранить в коробке для экссикатора
5 минут Эпоксидная смола	Devcon	20845	использование для герметизации микрофлюидного устройства
ацетон	Pharmco	329000ACS	использование для чистки покровных стекол
ванны ультразвуковой аппарат	Fisher Scientific	CPXH Модель 2800	номер по каталогу 15-337-410
Стакан, стекло, 100 мл
Настольная центрифуга
Biotin-PEG-SuccinimidylValerate (MW 5,000)	Laysan Bio	BIO-SVA-5K	Сукцинимидилвалерат имеет более длительный период полураспада, чем сукцинимидилкарбонат
биотинилированный олигонуклеотид	Integrated DNA Technologies	custom - см. протокол для соображений по проектированию	Запрос 5' Модификация биотина и Очиститель ВЭЖХ
Бычья сыворотка Альбумин (БСА)	VWR	0903-5G	приготовьте раствор 10 мг/мл (aq) и нагрейте до 95°С; C перед использованием
Centri-Spin-10 Размер Исключения Спиновых колонок	Princeton Separations	CS-100 или CS-101	используется для очистки тиолированных олигонуклеотидов после восстановления дисульфидной связи
Центрифужные пробирки 1,5. мл
Покровные стекла, 1 дюйм квадратный стеклянный
покровный колпак держатели
алмазного колеса	Dremel	7134	использование для сверления отверстий в кварцевой проточной ячейке
топпер дитиотреитол (DTT)	Thermo Scientific	A39255	No-Weigh Формат, 7,7 мг / флакон
сверлильный станок вращающийся рабочий инструмент	стенд Dremel	220-01	облегчает бурение кварца
EcoRV (REase используется для генерации примеров данных)	New England Biolabs	R0195T или R0195M	Используйте запас 100 000 единиц/мл, чтобы избежать добавления избытка глицерина, проверьте REBASE для поставщиков других REases
этанол	различный	CAS 64-17-5	денатурированный или 95% допустимы, используйте для чистки покровных стекол
этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)	Sigma Aldrich	EDS	BioUltra, безводный, храните в коробке для влагопоглотителя
Flea Micro Spinbar	Fisherbrand	14-513-65	Размер 3 мм х 10 мм для установки под покровной стеллаж
флуоресцеин	Acros Organics	17324	используется для изготовления экспериментальных буферов
гравитационной конвекционной печи	Binder	9010-0131
ручной вращающийся мультитул	Dremel	8220	используется для сверления отверстий в кварцевой проточной ячейке топпер
ImagEM X2 EM-CCD Camera	Hamamatsu	C9100-23B	Воздушное охлаждение достаточно для этого эксперимента, используйте программное обеспечение HCImage или аналогичное для управления
Проставка для визуализации, двусторонняя, клейкая
банка, стекло с завинчивающейся крышкой, (примерно 50 мм в диаметре на 50 мм в высоту)
хлорид магния гексагидрат	Fisher Bioreagents	BP214-500	используйте для создания экспериментального буфера с помощью магния
программного обеспечения		MATLAB	Анализ данных
металлический пинцет	Fisher Brand	16-100-110
метокси-ПЭГ-сукцинимидилвалерата (MW 5,000)	Laysan Bio	M-SVA-5K	Оба ПЭГ должны иметь одинаковый эфир NHS, чтобы скорость реакции была постоянной
микроцентрифуга	Eppendorf	5424
многопозиционная магнитная мешалка	VWR	12621-022
N-циклогексил-2-аминоэтансульфоновая кислота (CHES)	Acros Organics	AC20818	CAS 103-47-9, используется для изготовления
буферного орбитального шейкера и нагревателя CHES для микроцентрифужных пробирок	Q Instruments	1808-0506	с адаптером 1808-1061 для 24 x 2,0 мл или 15 x 0,5 мл пробирок
Parafilm
PE60 Полиэтиленовая трубка (внутренний диаметр 0,76 мм, внешний диаметр 1,22 мм)	Intramedic	6258917	Тупые иглы 22 G хорошо подходят для трубок этого размера
Фосфатно-солевой буфер (PBS) 10x	Sigma Aldrich	P7059	Используйте в 1x концентрацию
гидроксида калия	VWR Химикаты BDH	BDH9262	используйте раствор 1 М для очистки покровных стекол
Qdot 655 ITK Amino (PEG) Quantum Dots	Invitrogen	Q21521MP
Quartz Slide, 1 квадратный дюйм, толщина 1 мм	Электронная микроскопия Sciences	72250-10	необходимо просверлить отверстия в углах для вставки входной и выходной трубки
армированный пластиковый пинцет	Rubis	K35a	использовать для работы с покровными стеклами и создания микрофлюидного устройства
SecureSeal Adhesive Sheets	Grace Biolabs	SA-S-1L	вырезать для формирования прокладки для микрофлюидного устройства
Одноканальный шприцевой насос для микрофлюидики	New Era Pump Systems	NE-1002X-US	оснащен шприцем объемом 50 мл и тупой иглой 22 г
Slide-a-Lyzer MINI Dialysis Devices, 10 кДа MWCO, 0,1 мл	Thermo Scientific	69570 или 69572	используется для буферного обмена во время соединения квантовых точек с
бикарбонатом натрия	EMD Millipore	SX0320	используется для создания буфера для функционализации поверхности; 100 мМ, pH 8
хлорид натрия	Macron	7581-12	использовать для изготовления экспериментальных буферов
Двухосновной раствор фосфата натрия (BioUltra, 0,5 М в воде)	Sigma Aldrich	94046	использовать для приготовления 100 мМ буфера фосфата натрия
одноосновного раствора (BioUltra, 5М в воде)	Sigma Aldrich	74092	использовать для регулировки pH 100 мМ буфер фосфата
натрия Streptavidin из Streptomyces avidinii	Sigma Aldrich	S4762	растворить при 1 мг/мл и хранить 25 мл алкоголя при -20 ?
Сульфосукцинимидил-4-(N-малеимидометил) циклогексан-1-карбоксилат-(сульфо-SMCC)	Thermo Scientific	A39268	No-Weigh Format, 2 мг/флакон
Шприц оснащен тупой иглой
Шприцевой насос
тиолированный олигонуклеотид	Integrated DNA Technologies	custom - см. протокол для соображений	по проектированиюЗапрос 5' тиоловый модификатор C6 S-S и система визуализации ВЭЖХ TIRF
с лазерным освещением 488 нм	различные		специально построенные
Tris -HCl	Research Products International	T60050	использовать для создания экспериментальных буферов
Tris base	JT Baker	4101	использовать для создания экспериментальных буферов
Tween-20	Sigma	P7949	использовать для создания блокировки
буфер Сверхчистая вода
вихревой смеситель	VWR	10153-842
Wash-N-Dry Coverslip Rack	Электронная микроскопия Sciences	70366-16	используется для функционализации поверхности покровных покрытий