Широкоугольная визуализация в реальном времени локальных и системных сигналов раны при арабидопсисе

Растения не могут избежать биотических стрессов, например, насекомые, питающиеся ими, поэтому они разработали сложные системы восприятия стресса и передачи сигналов, чтобы обнаружить, а затем защитить себя от таких проблем, как травоядные^1. При ранении или травоядной атаке растения инициируют быстрые защитные реакции, включая накопление фитогормонной жасмоновой кислоты (JA) не только в раненом месте, но и в неповрежденные дистальные органы^2. Затем эта JA вызывает защитные реакции в непосредственно поврежденных тканях и упреждающе индуцирует защиту в неповрежденных частях растения. У Arabidopsisнакопление JA, вызванное ранением, было обнаружено в дистальных, неповрежденных листьях всего за несколько минут после повреждения в другом месте растения, что говорит о том, что от раненого листа³передается быстрый и дальний сигнал. Несколько кандидатов, таких как Ca^2+,активные формы кислорода (АФК) и электрические сигналы, были предложены для того, чтобы служить в качестве этих сигналов на большие расстояния в растениях^4,5.

Ca²⁺ является одним из самых универсальных и вездесущих вторых мессенджеров в эукариотических организмах. У растений жевание гусениц и механическое ранение вызывают резкое повышение концентрации цитозоля Ca²⁺ ([Ca^2+]_cyt)как в раненом листе, так и в нераненых отдаленных листьях^6,7. Этот системный сигнал Ca²⁺ принимается внутриклеточными Ca²⁺-чувствительными белками, которые приводят к активации нисходящих защитных сигнальных путей, включая биосинтез JA^8,9. Несмотря на многочисленные такие сообщения, подтверждающие важность сигналов Ca²⁺ в реакциях на раны растений, информация о пространственных и временных характеристиках сигналов Ca^2+, вызванных ранением, ограничена.

Визуализация в режиме реального времени с использованием генетически закодированных индикаторов Ca²⁺ является мощным инструментом для мониторинга и количественной оценки пространственной и временной динамики сигналов Ca^2+. На сегодняшний день разработаны версии таких датчиков, позволяющие визуализировать сигналы Ca²⁺ на уровне одной клетки, к тканям, органам и даже целым растениям^10. Первым генетически закодированным биосенсором для Ca^2+, используемым в растениях, был биолюминесцентный белок экворин, полученный из медузы Aequorea victoria^11. Хотя этот хемилюминесцентный белок использовался для обнаружения изменений Ca²⁺ в ответ на различные стрессы в растениях^{12,13,14,15,16,17,18,}он не очень хорошо подходит для визуализации в режиме реального времени из-за чрезвычайно низкого люминесцентного сигнала, который он производит. Индикаторы Ca^2+, основанные на резонансном переносе энергии Фёрстера (FRET), такие как желтые камелоны, также успешно используются для исследования динамики диапазона сигнальных событий Ca²⁺ в растениях^{19,20,21,22,23,24.} Эти датчики совместимы с подходами к визуализации и чаще всего состоят из Ca^2+, связывающего белка кальмодулина (CaM) и CaM-связывающего пептида (M13) из миозиновой киназы легкой цепи, все они слиты между двумя флуорофорными белками, как правило, синим флуоресцентным белком (CFP) и вариантом желтого флуоресцентного белка (YFP)^10. Связывание Ca²⁺ с CaM способствует взаимодействию между CaM и M13, что приводит к конформационному изменению датчика. Это изменение способствует передаче энергии между CFP и YFP, что увеличивает интенсивность флуоресценции YFP при одновременном уменьшении флуоресцентного излучения от CFP. Мониторинг этого перехода от флуоресценции CFP к флуоресценции YFP затем обеспечивает измерение увеличения уровня Ca^2+. В дополнение к этим датчикам FRET, биосенсоры Ca²⁺ на основе одного флуоресцентного белка (FP), такие как GCaMP и R-GECO, также совместимы с подходами к визуализации растений и широко используются для изучения изменений_цит [Ca^2+]из-за их высокой чувствительности и простоты использования^{25,26,27,28,29,30.} GCaMP содержат один циркулярно перестановленный (cp) GFP, снова сплавленный с CaM и пептидом M13. Ca²⁺-зависимое взаимодействие между CaM и M13 вызывает конформационное изменение датчика, которое способствует сдвигу в протонационном состоянии cpGFP, усиливая его флуоресцентный сигнал. Таким образом, по мере повышения уровня Ca²⁺ сигнал cpGFP увеличивается.

Чтобы исследовать динамику сигналов Ca^2+, генерируемых в ответ на механическое ранение или кормление травоядных, мы использовали трансгенные растения Arabidopsis thaliana, экспрессирующие вариант GCaMP, GCaMP3, и широкопольный флуоресцентный микроскоп^6. Этот подход позволил визуализировать быструю передачу сигнала Ca²⁺ на большие расстояния от места раны на листе ко всему растению. Таким образом, увеличение_циты [Ca^2+]было немедленно обнаружено в месте раны, но этот сигнал Ca^{2 +} затем распространялся на соседние листья через сосудистую азкулятуру в течение нескольких минут после ранения. Кроме того, мы обнаружили, что передача этого быстрого системного сигнала раны отменяется у растений Arabidopsis с мутациями в двух генах, подобных рецепторам глутамата, Glutamate Receptor Like (GLR), GLR3.3 и GLR3.6^6. GLR, по-видимому, функционируют как аминокислотные закрытые каналы Ca^2+, участвующие в различных физиологических процессах, включая раневую реакцию^3,рост пыльцевой трубки^31,развитие корней^32,холодный ответ³³и врожденный иммунитет^34. Несмотря на эту хорошо понятную, широкую физиологическую функцию GLR, информация об их функциональных свойствах, таких как их лигандная специфичность, селективность ионов и субклеточная локализация, ограничена^35. Однако недавние исследования показали, что GLR3.3 и GLR3.6 локализованы во флоэме и ксилеме соответственно. Растительные GLR имеют сходство с ионотропными глутаматными рецепторами (iGluRs)³⁶ у млекопитающих, которые активируются аминокислотами, такими как глутамат, глицин и D-серин в нервной системе млекопитающих^37. Действительно, мы продемонстрировали, что применение глутамата 100 мМ, но не других аминокислот, в месте раны индуцирует быстрый, дальний сигнал Ca²⁺ у Arabidopsis,что указывает на то, что внеклеточный глутамат, вероятно, действует как раневой сигнал у растений^6. Этот ответ отменяется у мутанта glr3.3/glr3.6, предполагая, что глутамат может действовать через один или оба из этих рецептороподобных каналов, и действительно, недавно было показано, что AtGLR3.6 ограничен этими уровнями глутамата^38.

В растениях, в дополнение к своей роли в качестве структурной аминокислоты, глутамат также был предложен в качестве ключевого регулятора развития^39; однако его пространственная и временная динамика плохо изучена. Так же, как и для Ca^2+,было разработано несколько генетически закодированных индикаторов для глутамата для мониторинга динамики этой аминокислоты в живых клетках^40,41. iGluSnFR представляет собой биосенсор глутамата на основе GFP, состоящий из cpGFP и глутаматсвязывающего белка (GltI) из Escherichia coli^42,43. Конформационное изменение iGluSnFR, которое индуцируется связыванием глутамата с GltI, приводит к усиленному флуоресцентному излучению GFP. Чтобы исследовать, действует ли внеклеточный глутамат как сигнальная молекула в реакции раны растений, мы связали последовательность iGluSnFR с основной последовательностью секреции сигнального пептида хитиназы (CHIB-iGluSnFR) для локализации этого биосенсора в апопластическом пространстве^6. Этот подход позволил визуализировать любые изменения концентрации апопластического глутамата ([Glu]_apo)с использованием трансгенных растений Arabidopsis, экспрессирующих этот датчик. Мы обнаружили быстрое увеличение сигнала iGluSnFR в месте ранения. Эти данные подтверждают идею о том, что глутамат просачивается из поврежденных клеток / тканей в апопласт при ранении и действует как сигнал повреждения, активирующий GLR и приводящий к сигналу Ca^{2 +} на большом расстоянии у растений^6.

Здесь мы описываем общезаводской метод визуализации в режиме реального времени с использованием генетически закодированных биосенсоров для мониторинга и анализа динамики сигналов Ca²⁺ и внеклеточных сигналов глутамата на большие расстояния в ответ на ранение^6. Наличие широкоугольной флуоресцентной микроскопии и трансгенных растений, экспрессирующих генетически закодированные биосенсоры, обеспечивает мощный, но легко реализуемый подход к обнаружению быстро передаваемых сигналов на большие расстояния, таких как волны Ca^2+.

1. Подготовка растительного сырья

1. В микротрубке 1,5 мл поверхностно стерилизуют семена растения Arabidopsis thaliana (присоединение Col-0), экспрессируя либо GCaMP3, либо CHIB-iGluSnFR путем встряхивания с 20% (v/v) NaClO в течение 3 мин, а затем промыть 5 раз стерильной дистиллированной водой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Трансгенные линии Арабидопсиса, экспрессирующие GCaMP3 или CHIB-iGluSnFR, были описаны^{ранее 6.}
2. В стерильной вытяжке посейте 13 поверхностно-стерилизованных семян на пластиковую чашку Петри площадью 10 см, наполненную 30 мл стерильной (автоклавной) средой Мурашиге и Скуг (MS) [1x соли MS, 1% (мас./об.) сахарозы, 0,01% (мас./об.) миоинозитола, 0,05% (мас./об.) MES и 0,5% (мас./об.) геллановой камеди; рН 5,7, скорректированный с помощью 1N KOH]. Замените крышку и оберните хирургической лентой.
3. После инкубации в темноте при 4 °C в течение 2 дней поместите пластины горизонтально при 22 °C в камеру роста при непрерывном свете (90-100 мкмоль^{м-2 с-1)}в течение примерно 2 недель перед использованием. Через 2 недели подсчитайте количество листьев арабидопсиса от самых старых до самых молодых⁴⁴ (рисунок 1). Раневые реакции преимущественно перемещаются от поврежденного листа (n) к листьям, пронумерованным n ± 3 и n ± 5^6.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе чашка Петри будет открыта для визуализации воздействия раны и глутамата под флуоресцентным микроскопом. Поэтому последующие этапы этого эксперимента должны проводиться в комнатных условиях с контролируемой температурой и влажностью. Это связано с тем, что сигналы Ca²⁺ также вызваны изменениями в этих условиях окружающей среды. Также известно, что синий свет, излучаемый микроскопом во время записи для возбуждения флуоресценции биосенсорного белка, может вызвать увеличение цитозольной концентрации Ca^{2+ 45} и поэтому растение должно быть акклиматизироваться к облучению синим светом в течение нескольких минут до начала эксперимента.

2. Химическая подготовка

1. Растворите L-глутамат в жидкой среде для роста [1/2x солей MS, 1% (мас./об.) сахарозы и 0,05% (мас./об.) MES; рН 5,1, скорректированный с помощью 1N KOH], чтобы получить рабочий раствор 100 мМ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте использования солей глутамата, таких как глутамат натрия, для предотвращения потенциального катионного воздействия на динамику Ca^2+.

3. Настройка микроскопа и проведение визуализации в режиме реального времени

1. Включите моторизованный флуоресцентный стереомикроскоп, оснащенный объективом 1x (NA = 0,156) и камерой sCMOS(рисунок 2),и настройте параметры устройства для облучения светом возбуждения 470/40 нм и получения излучения света, проходящего через фильтр 535/50 нм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Любой GFP-чувствительный флуоресцентный микроскоп может быть использован для обнаружения сигналов GCaMP3 и iGluSnFR в режиме реального времени, но для получения сигналов от всей установки рекомендуется объектив с низким энергопотреблением и высокочувствительная камера с широким чипом sCMOS. Маломощная цель позволяет визуалировать реакцию всей установки Arabidopsis, а использование высокочувствительной камеры позволяет быстро собирать данные, необходимые для захвата быстрого временного хода вызванной раной волны Ca^2+. Для флуоресцентного микроскопа, используемого в этом исследовании, максимальные значения поля зрения и временного разрешения составляют 3 см х 3 см и 30 кадров в секунду (fps) соответственно.
2. Снимите крышку и поместите блюдо под объектив.
3. Проверьте сигнал флуоресценции от растения, а затем подождите примерно 30 минут в темноте, пока растения не адаптируются к новым условиям окружающей среды. Этот этап адаптации необходим, потому что изменения влажности вызывают [Ca²⁺] повышение_цисты в растениях, которые могут мешать любым событиям, связанным с ранами.
4. Отрегулируйте фокус и увеличение, чтобы увидеть все растение в поле зрения. В текущем протоколе использовалось увеличение в 0,63 раза.
5. Перед началом визуализации в режиме реального времени настройте параметры сбора для обнаружения флуоресцентных сигналов с помощью программного обеспечения для визуализации микроскопа. Настройки для визуализации в текущем протоколе: экспозиция и интервал времени установлены на 1,8 с и 2 с (т.е. 0,5 кадра в секунду) соответственно. Установите время записи на 11 мин.
6. Изображение за 5 минут до начала эксперимента, чтобы акклиматизировать растение к облучению синим светом из микроскопа, затем начать запись, нажав на Run Nowили эквивалентную команду в используемом программном обеспечении микроскопа. Чтобы определить среднюю базовую флуоресценцию, запишите не менее 10 кадров (т.е. не менее 20 с в текущем протоколе) перед нанесением ран или применением глутамата (см. Раздел 4).
   1. Для визуализации в реальном времени раневой индуцированной [Ca^2+]_циты и [Glu]_апо изменяется, ножницами разрезайте черешек или среднюю область листа L1(рисунок 3 и рисунок 4).
   2. Для визуализации изменений_кисты, вызванных глутаматом [Ca^2+],в режиме реального времени, ножницами отрежьте край (примерно в 1 мм от кончика) листа 1 поперек основной вены. По истечении не менее 20 мин восстановительного периода нанесите 10 мкл глутамата 100 мМ на поверхность среза листа(рисунок 5).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта предварительная резка была необходима для обеспечения доступа глутамата к листовой апопласту, чтобы вызвать реакцию. Кроме того, было обнаружено, что нанесение капли дистиллированной воды на поверхность среза листа L1 имеет решающее значение для предотвращения высыхания образцов во время восстановления перед нанесением глутамата.
7. После завершения 11-минутной записи сохраните данные.

4. Анализ данных

1. Для анализа интенсивности флуоресценции с течением времени определите интересующей область (ROI) в месте, где должна быть проанализирована интенсивность флуоресценции(рисунок 6 и рисунок 7). Для расчета скорости волны Ca²⁺ определите 2 ROI (ROI1 и ROI2) для анализа. В программном обеспечении для обработки изображений щелкните Измерение времени | Определение | Круг. Измерьте расстояние между ROI1 и ROI2, щелкнув Аннотации и измерение | Длина | Простая линия (рисунок 6).
2. Измерьте необработанные значения флуоресценции (F) в каждом ROI с течением времени, щелкнув Измерить. Экспортируйте необработанные данные в программное обеспечение для работы с электронными таблицами, чтобы преобразовать флуоресцентный сигнал в цифры в каждой точке времени, щелкнув Все в Excel | Экспорт.
3. Определите базовое значение флуоресценции, которое определяется как F_0,путем вычисления среднего значения F за первые 10 кадров (т.е. до обработки) в записанных данных.
4. Нормализуйте данные F (путем вычисления ΔF/F) с помощью уравнения ΔF/F = (F−F_0)/F0, где ΔF — зависящее от времени изменение флуоресценции.
5. Для анализа волны скорости волны Ca²⁺ определите значимую точку подъема сигнала выше предварительно стимулированных значений как представляющую обнаружение увеличения Ca²⁺ в каждом ROI(t₁ и t_2),используя критерий повышения до 2× стандартного отклонения (2x SD), которое вычисляется из данных F₀ с использованием статистического программного обеспечения. 95% данных F₀ попадает в пределах 2x SD от среднего значения, что указывает на то, что повышение сигнала выше этого уровня случайно составляет ≤5%. Рассчитайте разницу во времени увеличения Ca²⁺ между ROI1 и ROI2 [t₂- t₁ time-lag(Δt)] и измерьте расстояние между ROI1 и ROI2, затем определите скорости любой волны Ca^2+.

Распространение сигнала [Ca2+]cyt и [Glu]apo в ответ на ранение представлено на рисунке 3, рисунке 4, фильме S1и фильме S2. Обрезание черешка листа 1 у растений, экспрессировающих GCaMP3 (при 0 с), привело к значительному увеличению [Ca2+]циты, которая была быстро индуцирована локально через сосудистую (через 40 с)(Рисунок 3 и Фильм S1). Впоследствии сигнал быстро распространялся на соседние листья (листы 3 и 6) в течение нескольких минут (при 80 с)(рисунок 3 и ролик S1).

При срезке листа 1 у растений, экспрессирующих CHIB-iGluSnFR, вокруг области среза наблюдалось быстрое увеличение [Glu]апо (через 2 с). Этот сигнал распространялся через сосудистую систему локально в течение нескольких минут (при 160 с), но не наблюдался в системных листьях(рисунок 4 и фильм S2).

Для визуализации в реальном времени распространения сигнала Ca2+, вызванного применением глутамата, край (примерно 1 мм от кончика) листа 1 у растений, экспрессирующих GCaMP3, был разрезан, как показано на рисунке 5A и movie S3. Обрезание края листа 1 вызвало локальное [Ca2+]увеличениециты (на 40 с), но этот сигнал исчез в течение нескольких минут (при 124 с). После ожидания примерно 10 мин восстановления растения, 10 мкл 10 мМ глутамата наносили на поверхность среза листа 1, что вызывало быстрое, значительное увеличение [Ca2+]циты локально (при 56 с) и распространение сигнала на дистальные листья (при 104 с)(рисунок 5B и фильм S4).

Для измерения изменений в [Ca2+]ците, вызванной ранением в системном листе, два ROI (ROI1 и ROI2) были установлены в области основания и кончике листа 6 у растений, экспрессирующих GCaMP3, как показано на рисунке 6A. Измерено временное изменение интенсивности сигнала GCaMP3 в ROI1 и ROI2 при разрезании черешка листа 1(рисунок 6B). Значительное увеличение [Ca2+]cyt при ROI1 было обнаружено раньше, чем у ROI2(рисунок 6B). [Около2+] цит достиг пика примерно через 100 с после ранения, длился более 10 мин и проявлял две фазы(рисунок 6B).

Для определения скоростей волны Ca2+ при механическом ранении определяли временную точку подъема значительного сигнала выше предварительно стимулированных значений в ROI1 и ROI2 (time-lag; см. Раздел 4)(Рисунок 6C). Поскольку расстояние между ROI1 и ROI2 в данном случае составляло 2,7 мм(рисунок 6A),скорость сигнала Ca2+ в листе 6 была рассчитана как 0,15 мм/с. Для измерения изменений [Glu]apo в ответ на механическое повреждение ROI1 был установлен в непосредственной близости от места разреза листа, помеченного как L1, как показано на рисунке 7A. [Клей] Сигнатура apo при ROI1 продемонстрировала один пик примерно через 100 с после ранения(рисунок 7B).

Рисунок 1:Нумеровка розетчатых листьев арабидопсиса. Листья арабидопсиса пронумерованы от самого старого до самого молодого (левая панель). Принципиальная схема положения листьев указана на правой панели. L: лист, C: семяледоны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2:Флуоресцентный микроскоп, используемый в этом исследовании. [Ca2+] динамикацита и [Glu]апо были визуалированы с помощью широкопольного флуоресцентного стереомикроскопа. R: Пульт дистанционного управления, O: объектив 1x, C: камера sCMOS, T: Тринокулярная наклонная трубка, S: Сцена, P: Растительный материал. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3:Раневая передача сигнала ca2+ на большие расстояния. Обрезание черешка (белая стрелка, 0 с) листа 1 (L1) в растении, экспрессирующее GCaMP3, вызвало локальное [Ca2+] увеличениециты (красная стрелка, 40 с), которое передавалось на системные листья [лист 3 (L3) и лист 6 (L6)] (оранжевые стрелки, 80 с). Шкала, 5 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4:Раневое [Glu]повышение апо. Разрезание листа 1 (L1) (белая стрелка, 0 с) у растений, экспрессирующих CHIB-iGluSnFR, вызвало быстрое возвышение [Glu]апо (красная стрелка, 80 с), которое распространялось через сосудистую азкулятуру (оранжевая стрелка, 160 с). Шкала, 2 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5:Глутамат-триггерная передача сигнала ca2+ на большие расстояния. (A) Обрезание края (приблизительно 1 мм от кончика) листа 1 (L1) у растений, экспрессирующих GCaMP3 (белая стрелка, 0 с), вызвало увеличениециты [Ca2+](красная стрелка, 40 с). (B)Нанесение 100 мМ глутамата на поверхность разреза L1 (белая стрелка, 0 с) вызвало локальное [Ca2+] увеличениециты (красная стрелка, 56 с), которая быстро распространилась на дистальные листья [например, лист 3 (L3), лист 4 (L4) и лист 6 (L6)] (оранжевые стрелки, 104 с). Шкала, 5 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6:[Ca2+] сигнатурациты в системных листьях в ответ на механическое ранение. (A) Расширенное изображение листа 6 (L6) у растений, экспрессивных GCaMP3, показано на рисунке 3. ROI1 (синий круг) и ROI2 (розовый круг) были установлены в области основания и наконечника соответственно. Белая стрелка указывает на место разреза черешка листа 1 (L1). В этом случае расстояние между ROI1 и ROI2 составило 2,7 мм. (B) Количественная оценка сигнатур [Ca2+]cyt в ROI1 и ROI2. Изменения интенсивности флуоресценции были проанализированы с использованием программного обеспечения для визуализации. (C)Расширенный след данных в (B) между 0 с и 80 с. Точки обнаружения увеличения ROI1 и ROI2 ca2+ были определены как t1 и t2соответственно, используя в качестве критерия повышение до 2x стандартного отклонения значений престимуляции (2x SD, пунктирная линия). Значение t2 - t1 было определено как time-lag(Δt)в текущем протоколе. Черная стрелка указывает время среза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7:[Glu]апо сигнатура в ответ на механическое ранение. (A) Расширенное изображение листа 1 (L1) у растений, экспрессирующих CHIB-iGluSnFR, показано на рисунке 4. ROI1 был установлен в непосредственной близости от места разреза. Белая стрелка указывает на область разреза. (B) Количественное забвениеапосигии [Glu] в ROI1 контролируется с помощью программного обеспечения для обработки изображений. Черная стрелка указывает время среза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Фильм S1: Передача Ca2+ на дальние расстояния после механического ранения. Механическое ранение на черешку листа 1 (L1) вызвало увеличениециты [Ca2+],передаваемое на дистальные листья [например, лист 3 (L3) и лист 6 (L6)]. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.

Фильм S2: Повышение уровня апопластического глутамата в ответ на резку. Механическое ранение листа 1 (L1) вызвало немедленное увеличение [Glu]апо. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.

Фильм S3: Повышениеуровняцита [Ca2+] в ответ на разрезание. Механическое ранение на краю листа 1 (L1) вызвало немедленное локальное [Ca2+] повышениециты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.

Фильм S4: Применение глутамата вызывает системное [Ca2+]увеличениекеты. Применение глутамата 100 мМ вызывало передачу Ca2+ на системные листья [например, лист 3 (L3), лист 4 (L4) и лист 6 (L6)]. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.

У авторов нет конфликта интересов.