Использование системы GAL4-UAS для функциональной генетики в Anopheles gambiae

Краткое содержание

Двусторонняя система GAL4-UAS является универсальным инструментом для модификации экспрессии генов контролируемым пространственно-временным способом, который позволяет проводить функциональный генетический анализ в Anopheles gambiae. Процедуры, описанные для использования этой системы, представляют собой полустандартизированную стратегию клонирования, сексинг и скрининг куколок на флуоресцентные белковые маркеры и фиксацию эмбрионов.

Аннотация

Двусторонняя система GAL4-UAS является универсальным и мощным инструментом для функционального генетического анализа. Суть системы заключается в пересечении трансгенных «драйверных» линий, которые экспрессируют фактор транскрипции дрожжей GAL4 тканевым специфическим образом, с трансгенными линиями «ответчика», несущими интерференционную конструкцию гена / РНК, экспрессия которой контролируется восходящими последовательностями активации (UAS), которые связывают GAL4. Таким образом, в последующем потомстве ген или глушительная конструкция экспрессируется предписанным пространственно-временным способом, что позволяет анализировать результирующие фенотипы и выводить функцию гена. Бинарная система обеспечивает гибкость в экспериментальных подходах к скринингу фенотипов, генерируемых экспрессией трансгенов в нескольких тканеспецифических паттернах, даже если вызваны серьезные затраты на приспособленность. Мы адаптировали эту систему для Anopheles gambiae, основного переносчика малярии в Африке.

В этой статье мы приводим некоторые из распространенных процедур, используемых при анализе GAL4-UAS. Мы описываем уже сгенерированные линии An. gambiae GAL4-UAS, а также клонирование новых конструкций ответчиков для повышения регуляции и нокдауна RNAi. Мы указываем пошаговое руководство по половому использованию кукол комаров для установления генетических скрещиваний, которое также включает скрининг потомства для отслеживания наследования флуоресцентных генных маркеров, которые помечают вставки водителя и ответчика. Мы также представляем протокол очистки эмбрионов An. gambiae для изучения эмбрионального развития. Наконец, мы вводим потенциальные адаптации метода для генерации линий драйверов посредством вставки CRISPR/Cas9 GAL4 после генов-мишеней.

Введение

Двусторонняя система GAL4-UAS является рабочей лошадкой функциональной характеристики генов в модельном организме насекомых Drosophila melanogaster1,2,3. Для использования системы GAL4-UAS трансгенные линии драйвера, экспрессирующие фактор транскрипции дрожжей GAL4 под контролем регуляторной последовательности, пересекаются с ответными линиями, несущими интересующий ген или конструкцию РНК-интерференции (RNAi), контролируемую последовательностью активации (UAS), распознаваемой GAL4. Потомство этого креста выражает трансген интереса к пространственно-временному паттер....

Протокол

1. Проектирование и строительство конструкций БАС

1. Проектирование и сборка векторов экспрессии генов-кандидатов
   1. Определите последовательность, которая будет использоваться для повышения регуляции генов-кандидатов.
      1. Секвенировать кДНК/гДНК с интересующим штаммом и сравнить его с опубликованной последовательностью для проверки его идентичности и выявления потенциальных SNP и рестрикционных сайтов для диагностического дайджеста.
      2. Убедитесь, что прямой праймер, используемый для амплификации генов, покрывает нативную последовательность Козака и запускает кодон, где это необходимо. Праймер со связыванием....

Результаты

Экспрессия 3xP3 eYFP, dsRed и eCFP обеспечивает надежную, легко различимую идентификацию лиц, обладающих маркерными генами, продуцирующими экспрессию в глазах и вентральных ганглиях куколок An. gambiae (рисунок 3). Дифференциальная морфология, наблюдаемая у мужских и женских наружных гениталий, используемых для секса, и пример неидентифицируемых куколок выделены на рисунке 4. Удаление всей воды из куколок увеличивает сложность сексинга, так как.......

Обсуждение

Понимание функции генов комаров имеет жизненно важное значение для разработки новых подходов к борьбе с Anopheles и воздействию на передачу малярии. Описанная система GAL4-UAS является универсальной и мощной системой для функционального анализа генов-кандидатов, и на сегодняшний день мы использовали эту систему для изучения генетических основ устойчивости к инсектицидам17 и производства кутикулярных ^{углеводородов15,23}, а также для.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
100 x 15 мм пластиковая чашка Петри	SLS	2175546	Упаковка 10
1000 шт. L Пипетка	Gilson Gilson	F144059P
20/25 мл Универсальные пробирки	Starlab	E1412-3020	Упаковка 400
3 мл Пастеровские пипетки	SLS	G612398	Greiner Pasteur пипетка 3 мл стерильные индивидуально упакованные
50 мл Falcon Tubes	Fisher Scientific	11512303
абсолютный этанол	Fisher Scientific	BP2818-500	500 мл
Уксусная кислота	SLS	45726-1L-F	1 л
Клетки	SLS	E6099	30x30x30 с портом для экрана
Кисти для тонкой краски	Amazon	UKDPB66	KOLAMOON 9 штук Набор кистей для рисования Миниатюрные кисти для акварели, акриловой живописи, масляной живописи (винно-красный)
Корм для рыб	Амазонка		Tetra Min Fish Food, полнорационный корм для всех тропических рыб для здоровья, цвета и жизненной силы, 10 л&nbл;
Раствор формальдегида	Sigma Aldrich	F8775
Аспиратор для рта	John Hock	612
Соль для пруда	Amazon		Blagdon Guardian Pond Тоник, для здоровья рыб, качества воды, общий тоник, буфер pH, 9,08 кг, обрабатывает 9,092 л
Горшки для куколок	Cater4you	SP8OZ	250 горшков с крышками
Маленькие пластиковые ведра	Amazon		2,5 л Белое пластиковое ведро в комплекте с белой крышкой (Упаковка из 10 шт.)
Гипохлорит натрия	Fisher Scientific	S25552