Мы разработали обобщенный протокол для диссоциативного большого количества высококачественных одиночных клеток из эпителия и мезенхимы/соединительной ткани эмбриональных и взрослых мышей.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Диссоциация клеток из эпителия языка и мезенхимы/соединительной ткани эмбриональных мышей 12,5 и 8 недель
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Диссоциация клеток была важной процедурой для исследований на уровне отдельных клеток и/или на уровне клеточной популяции (например, секвенирование одноклеточной РНК и первичная клеточная культура). Получение жизнеспособных, здоровых клеток в больших количествах имеет решающее значение, и оптимальные условия для этого зависят от тканей. Клеточные популяции в эпителии языка и лежащей в его основе мезенхиме/ соединительной ткани являются гетерогенными, и тканевые структуры различаются в разных областях и на разных стадиях развития. Мы протестировали протоколы выделения клеток из эпителия языка мыши и мезенхимы/соединительной ткани на ранних стадиях развития [эмбриональный день 12,5 (E12,5)] и молодых взрослых (8 недель). Чистое разделение между эпителием и подлежащей мезенхимой/соединительной тканью было легко осуществить. Однако для дальнейшей обработки и изоляции клеток, дающих жизнеспособные здоровые клетки в больших количествах, и тщательный выбор ферментативного буфера пищеварения, времени инкубации и скорости и времени центрифугирования имеют решающее значение. Инкубация отделенного эпителия или подлежащей мезенхимы/соединительной ткани в 0,25% трипсина-ЭДТА в течение 30 мин при 37 °C с последующим центрифугированием при 200 х г в течение 8 мин приводила к высокому выходу клеток при высокой скорости жизнеспособности (>90%) независимо от стадий мыши и областей языка. Более того, мы обнаружили, что как диссоциированные эпителиальные, так и мезенхимальные /соединительные клетки из эмбрионального и взрослого языков могут выживать в среде на основе клеточной культуры в течение не менее 3 ч без значительного снижения жизнеспособности клеток. Протоколы будут полезны для исследований, требующих подготовки изолированных клеток из языков мыши на ранних стадиях развития (E12.5) и молодых взрослых (8-недельных) стадиях, требующих диссоциации клеток из разных тканевых компартментов.
Введение
Язык млекопитающих является сложным органом, критически важным для вкуса, речи и обработки пищи. Он состоит из нескольких типов высокоорганизованных тканей, разделенных мезенхимой / соединительной тканью и покрытых стратифицированным эпителиальным листом, содержащим вкусовые сосочки и вкусовые рецепторы. Клеточные популяции как в эпителии языка, так и в мезенхиме/соединительной ткани неоднородны. Чтобы лучше понять функции и распределение определенного типа клеток на языке, необходимы исследования с использованием диссоциированных клеток. Например, секвенирование одноклеточной РНК является мощным и высокопроизводительный методом транскриптомного профилирования в отдел....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Использование животных (мыши C57BL/6 на протяжении всего исследования) было одобрено Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Университета Джорджии и соответствовало Руководящим принципам Национального института здравоохранения по уходу и использованию животных для исследований.
1. Использование животными
ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши были выведены и содержались в животноводческом учреждении факультета животноводства и молочных наук в Университете Джорджии при 22 ° C при 12-часовых циклах дня и ночи.
- Назначают полудень дня обнаружения влагалищной пробки у мышей как эмбриональный (Е) день 0,5. И....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Отделение эпителия языка от подлежащей мезенхимы/соединительной ткани
В эмбриональном языке мыши виден разрыв в субэпителиальном пространстве после правильного переваривания ферментов. Эпителиальные листы некоторых языков отделяются без механической силы во время инкубации.
На язык взрослой мыши успешная инъекция фермента указывает на отек в вводимых областях(рисунок 1B2),что говорит о том, что фермент может удержива.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
На сегодняшний день не существует подробного протокола диссоциации клеток от эпителия языка и лежащей в его основе мезенхимы / соединительной ткани. Этот протокол диссоциации текущих клеток обеспечивает воспроизводимую процедуру для создания одноклеточной суспензии с высокой жизнеспособностью клеток (>90%) из тканей языка мыши, включая эпителиальные листы и ткани мезенхимы/соединительной ткани как на эмбриональной, так и на постнатальной стадиях, хотя изолированные клетки от E12.5 и взрослых мышей различаются по размеру........
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Конфликт интересов не заявлен.
Благодарности
Это исследование было поддержано Национальными институтами здравоохранения, номер гранта R01DC012308 и R21DC018089 для HXL. Мы благодарим Бретта Маршалла (Университет Джорджии, Афины, Джорджия) и Эгона Рангини (10X GENOMICS, Плезантон, Калифорния) за техническую помощь и консультации по поводу диссоциации клеток; Франциске Гибсон Бернли (Университет Джорджии, Афины, Джорджия) для редактирования на английском языке.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Бычий сывороточный альбумин (БСА) | Золотая биотехнология | A-420-100 | |
| C57BL/6 мышь (C57BL/6J) | Лаборатория Джексона | 000664 | |
| коллагеназа (коллагеназа А) | Сигма-Олдрич | 10103586001 | |
| чашка для культуры (35 мм в диаметре) | Чашка для культуры Genesee Scientific | 32-103G | |
| (100 мм в диаметре) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| dispase (Dispase II) | Sigma-Aldrich | 04942078001 | |
| (Student Fine Scissors) | Find Science Tool | 91460-11 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| фетальная бычья сыворотка (FBS) | Hyclone | C838U82 | |
| тонкие щипцы (щипцы Dumount #3) | Найти научный инструмент | 11293-00 | |
| Гемоцитометр | Hausser Scientific | 3520 | |
| с системой визуализации (EVOS XL Core Cell Imaging System) | Life Technologies | AMEX1000 | |
| наконечники для пипеток с низким удержанием | METTLER TOLEDO | 17014342 | |
| мини-ножницы (Evo Spring Scissors) | Fine Science Tool | 15800-01 | |
| пластиковая основа | VWR | 46610-056 | |
| шпатель (Moria Spoon) | Хирургический щипцы Fine Science Tool | 10321-08 | |
| (щипцы для ламинэктомии Dumount #2) | Fine Science Tool | 11223-20 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Tyrode' s раствор | Sigma-Aldrich | T2145-10L | изготовлен из солей Тироде |
| 0,25% типсин-ЭДТА | Gibco | 25200056 | |
| 0,1 М фосфатно-солевого буфера (PBS) | Hoefer | 33946 | изготовлен из 1 М PBS |
| 0,22-μ m шприцевой фильтр | Genesee Scientific | 25-243 | |
| 70% этанол | Koptec | 233919 | изготовлен из 100% этанола |
| 1-мл шприц | BD | 8194938 | |
| 5-мл низкосвязывающая микроцентрифужная трубка | Eppendorf | 30122348 | |
| игла 30-G | BD | 9193532 | |
| 35-μ m сетчатый фильтр | Falcon | 64750 | |
| 70-μ Сетчатый фильтр Falcon | 64752 |
Ссылки
- Grada, A., Weinbrecht, K. Next-generation sequencing: methodology and application. The Journal of investigative dermatology. 133 (8), 11(2013).
- Whitley, S. K., Horne, W. T., Kolls, J. K. Research techniques made simple....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
