Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Химические белковые конденсаты, индуцированные димеризацией, на теломерах

2.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62173

⸱

12 апреля 2021 г.

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Mellon College of Science, Carnegie Mellon University, 2Department of Chemistry, School of Arts and Sciences, University of Pennsylvania

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол иллюстрирует химически индуцированную систему димеризации белка для создания конденсатов на хроматине.  Показано образование ядерного тела промиелоцитарного лейкоза (ПМЛ) на теломерах с химическими димеризаторами. Рост, растворение, локализацию и состав капель контролируются с помощью визуализации живых клеток, иммунофлуоресценции (IF) и флуоресцентной гибридизации in situ (FISH).

Аннотация

Хроматин-ассоциированные конденсаты участвуют во многих ядерных процессах, но лежащие в их основе механизмы остаются неуловимыми. Этот протокол описывает химически индуцированную систему димеризации белка для создания конденсатов на теломерах. Химический димеризатор состоит из двух связанных лигандов, каждый из которых может связываться с белком: галолиганд с гало-ферментом и триметоприм (TMP) с дигидрофолатредуктазой E. coli (eDHFR), соответственно. Слияние фермента Halo с теломерным белком прикрепляет димеризаторы к теломерам посредством ковалентного связывания Halo лиганд-фермент. Связывание TMP с eDHFR рекрутирует eDHFR-плавленую фазу, разделяющую белки на теломеры, и индуцирует образование конденсата. Поскольку взаимодействие TMP-eDHFR является нековалентным, конденсацию можно обратить вспять, используя избыточный свободный TMP, чтобы конкурировать с димеризатором за связывание eDHFR. Приведен пример индуцирования образования ядерного тела промиелоцитарного лейкоза (ПМЛ) на теломерах и определения роста, растворения, локализации и состава конденсата. Этот метод может быть легко адаптирован для индуцирования конденсатов в других геномных местах путем слияния Halo с белком, который непосредственно связывается с местным хроматином или с dCas9, который нацелен на геномный локус с направляющей РНК. Предлагая временное разрешение, необходимое для визуализации одиночных клеток в реальном времени, сохраняя при этом разделение фаз в популяции клеток для биохимических анализов, этот метод подходит для исследования как образования, так и функции конденсатов, связанных с хроматином.

Введение

Многие белки и нуклеиновые кислоты подвергаются разделению жидкой фазы (LLPS) и самособираются в биомолекулярные конденсаты для организации биохимии в клетках1,2. LLPS хроматинсвязывающих белков приводит к образованию конденсатов, которые связаны со специфическими геномными локусами и участвуют в различных функциях местного хроматина3. Например, ТОО белка HP1 лежит в основе формирования гетерохроматиновых доменов для организации генома4,5,ТООО факторов транскрипции формирует транскрипционные центры для регулирования транскрипции6,ТОО из зарождающихся мРНК и белков многополых генерирует гистоновые локусные тела для регулирования транскрипции и обработки гистоновых мРНК7.  Однако, несмотря на то, что было обнаружено много примеров хроматин-ассоциированных конденсатов, основные механизмы образования, регуляции и функции конденсата остаются плохо изученными. В частности, не все хроматин-ассоциированные конденсаты образуются через LLPS и тщательные оценки образования конденсата в живых клетках все еще необходимы8,9. Например, показано, что белок HP1 у мышей обладает лишь слабой способностью образовывать жидкие капли в живых клетках, а гетерохроматиновые очаги ведут себя как коллапсировавших полимерныхшариков 10. Поэтому желательны инструменты для индуцирования конденсатов de novo на хроматине в живых клетках, особенно те, которые позволяют использовать живую визуализацию и биохимические анализы для мониторинга кинетики образования конденсата, физических и химических свойств образующихся конденсатов и клеточных последствий образования конденсата.

Этот протокол сообщает о системе химической димеризации для индуцирования белковых конденсатов на хроматине11 (рисунок 1A). Димеризатор состоит из двух связанных белково-взаимодействующих лигандов: триметоприма (TMP) и лиганда Halo и может димеризовать белки, слитые с родственными рецепторами: Escherichia coli дигидрофолатредуктаза (eDHFR) и бактериальный фермент алкилдегалогеназа (фермент Halo), соответственно12. Взаимодействие между лигандом Halo и ферментом Halo является ковалентным, что позволяет использовать фермент Halo в качестве якоря путем слияния его с хроматин-связывающим белком для набора фазоразделяющего белка, слитого с eDHFR с хроматином. После первоначального набора повышенная локальная концентрация белка, разделяющего фазы, проходит критическую концентрацию, необходимую для разделения фаз, и, таким образом, зародывает конденсат на якоре(рисунок 1В). Путем слияния флуоресцентных белков (например, mCherry и eGFP) с eDHFR и Halo, нуклеация и рост конденсатов могут быть визуализированы в режиме реального времени с помощью флуоресцентной микроскопии. Поскольку взаимодействие между eDHFR и TMP является нековалентным, избыток свободного TMP может быть добавлен, чтобы конкурировать с димеризатором за связывание eDHFR. Затем это высвобождает белок разделения фаз из якоря и растворяет конденсат, связанный с хроматином.

Мы использовали этот инструмент для индуцирования образования ядерного тела de novo промиелоцитарного лейкоза (ПМЛ) на теломерах в теломераз-отрицательных раковых клетках, которые используют альтернативное удлинение пути теломер (АЛТ) для поддержания теломер13,14.  Ядерные тела ПМЛ представляют собой безмембранные компартменты, участвующие во многих ядерных процессах15,16 и уникально локализованные в теломерах АЛТ с образованием АПП, для АЛТ теломер-ассоциированных тел ПМЛ17,18. Теломеры группируются в APB, по-видимому, для предоставления шаблонов восстановления для синтеза ДНК теломер, направленных на гомологию, в ALT19. Действительно, синтез ТЕЛОМЕРНОЙ ДНК был обнаружен в APB, и APB играют важную роль в обогащении факторов репарации ДНК на теломерах20,21. Однако механизмы, лежащие в основе сборки APB и кластеризации теломер в APB, были неизвестны. Поскольку белки теломер в АЛТ-клетках уникально модифицированы небольшим убиквитиноподобным модификатором (SUMO)22,многие компоненты APB содержат участки сумоилирования 22,23,24,25 и/или SUMO-взаимодействующие мотивы (SIM)26,27 и взаимодействия SUMO-SIM управляют разделением фаз28,мы предположили, что сумоилирование на теломерах приводит к обогащению SUMO/SIM-содержащих белков и Взаимодействия SUMO-SIM между этими белками приводят к разделению фаз.  Белок PML, который имеет три участка сумоилирования и один сайт SIM, может быть рекрутирован в сумоилированные теломеры для образования APB, а слияние жидких APB приводит к кластеризации теломер. Чтобы проверить эту гипотезу, мы использовали систему химической димеризации для имитации образования APB, вызванного сумоилированием, путем набора SIM в теломеры(рисунок 2A)11. GFP сплавляется с Haloenzyme для визуализации и с теломер-связывающим белком TRF1 для закрепления димеризатора на теломерах. SIM-карта слита с eDHFR и mCherry. Кинетика образования конденсата и кластеризация теломер, вызванная слиянием капель, сопровождается визуализацией живых клеток.  Разделение фаз обменяется путем добавления избыточного свободного TMP, чтобы конкурировать с связыванием eDHFR. Иммунофлуоресценция (IF) и флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) используются для определения состава конденсата и теломерной ассоциации. Рекрутинговая SIM обогащает SUMO на теломерах, а индуцированные конденсаты содержат PML и, следовательно, являются APB. Вербовка SIM-мутанта, который не может взаимодействовать с SUMO, не обогащает SUMO на теломерах и не индуцирует разделение фаз, что указывает на то, что фундаментальной движущей силой конденсации APB является взаимодействие SUMO-SIM. Соглашаясь с этим наблюдением, полимеры polySUMO-polySIM, которые сплавились с фактором связывания TRF2 RAP1, также могут индуцировать образование APB29. По сравнению с системой синтеза polySUMO-polySIM, где разделение фаз происходит до тех пор, пока производится достаточное количество белков, подход химической димеризации, представленный здесь, индуцирует разделение фаз по требованию и, таким образом, предлагает лучшее временное разрешение для мониторинга кинетики разделения фаз и процесса кластеризации теломер. Кроме того, эта система химической димеризации позволяет рекрутировать другие белки для оценки их способности индуцировать разделение фаз и кластеризацию теломер. Например, неупорядоженный белок, рекрутированный в теломеры, также может образовывать капли и кластерные теломеры, не вызывая образования APB, предполагая, что кластеризация теломер не зависит от химии APB и полагается только на жидкое свойство APB11.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Производство переходных клеточных линий

  1. Культивируемые акцепторные клетки U2OS на стеклянные крышки диаметром 22 х 22 мм (для живой визуализации) или круглые покровные пластинки диаметром 12 мм (для ПЧ или FISH), покрытые поли-D-листином в 6-й колодце со средой роста (10% фетальная бычья сыворотка и 1% раствор пенициллин-стрептомицин в ДМЭМ) до тех пор, пока они не достигнут 60-70% конфюлюзии.
  2. Перед трансфекцией заменить питательную среду трансфекцией 1 мл (питательную среду без раствора пенициллина-стрептомицина).
  3. Для каждой трансфекционной скважины добавляют 4 мкл трансфекционного реагента к 150 мкл восстановленной сывороточной среды, вихрь в течение 10 секунд, а затем инкубируют в течение 5 минут.
  4. Для каждой скважины добавьте плазмиду конструкции Halo (Halo-GFP-TRF1 или Halo-TRF1) и плазмиду конструкции eDHFR (mCherry-eDHFR-SIM или mCherry-eDHFR-SIM мутант) с массовым соотношением 1:1 (0,5 мкг плазмиды halo-конструкции с плазмидой конструкции eDHFR 0,5 мкг) к 150 мкл восстановленной сывороточной среды, по каплям, перемешивают путем пипетирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Метки относительно небольшие (Halo 33 kD, eDHFR 28 kD, mCherry 30 kD, eGFP 27 kD) и никакого влияния на разделение фаз не наблюдалось. Тем не менее, рекомендуется использовать мутанты, такие как SIM-мутант, используемый здесь, чтобы убедиться, что поведение фазы чувствительно к мутациям, а не к меткам. SIM-карта от PIASx28,30. Последовательность SIM - AAAGTCGATGTAATTGACTTAACGATCGAATCTAGCAGCGATGAAGAAGAAGATCCACCGGCTAAACGT. Мутант SIM генерируется путем мутации SIM аминокислот VIDL в VADA28,а последовательность AAAGTCGATGTAGCCGACGCCACGATCGAATCTAGCAGCGATGAAGAAGATCCACCGGCTAAACGT. Мы отложили наши плазмиды в аддген: #164644 3XHalo-GFP-TRF1; #164646 mCherry-eDHFR-SIM; #164649 мутант mCherry-eDHFR-SIM.
  5. Добавьте 150 мкл трансфекционного реагента - восстановленной смеси сывороточных сред до 150 мкл восстановленной сывороточной среды с ДНК, по каплям, перемешайте путем пипетирования, инкубируйте в течение 5 минут.
  6. Добавьте 300 мкл трансфекционной смеси реагента и ДНК к клеткам, по каплям, а затем поместите клетки обратно в инкубатор.
  7. Подождите 24-48 часов перед живой визуализацией, иммунофлуоресценцией (IF) или флуоресцентной гибридизацией in situ (FISH).

2. Димеризация на теломерах

  1. Димеризаторы растворяют в диметилсульфоксиде при 10 мМ и хранят в пластиковых микроцентрифужных трубках при −80 °C для длительного хранения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо использования димеризатора с TMP, напрямую связанным с Halo (TMP-Halo, TH), используется димеризатор TMP-NVOC-Halo (TNH), который имеет светочувствительный линкер, 6-нитровератрилоксикарбонил (NVOC), между TMP и Haloligand31. Это связано с тем, что для диффузии TNH (~ 5 минут) в клетку требуется меньше времени, чем для TH (~ 20 минут). Результаты, показанные здесь, также могут быть получены с помощью TH. При использовании TNH будьте осторожны, чтобы не подвергать димеризатор воздействию света, чтобы избежать расщепления NOVC. Обработайте TNH в темной комнате тусклой лампой красного света, храните димеризатор в янтарных пластиковых трубках и заверните контейнер, содержащий TNH или обработанные ячейки, алюминиевой фольгой. Визуализация TNH с помощью DIC безопасна.
  2. Взять аликвоту димеризатора 10 мМ от −80 °C и развести в среде визуализации до концентрации 10 мкМ и хранить при −20 °C.
  3. Когда они будут готовы к использованию, разбавьте димеризаторы из запасного раствора 10 мкМ до конечной рабочей концентрации 100 нМ в питательной среде (для фиксированной визуализации) или среде визуализации. Обрабатывайте клетки димеризаторами 100 нМ (конечная концентрация) на сцене для визуализации в реальном времени или инкубируем в течение 4-5 часов для иммунофлуоресценции (IF) и флуоресцентной гибридизации in situ (FISH).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация используемых димеризаторов влияет на эффективность димеризации и, следовательно, на разделение фаз. Концентрация димеризатора, обеспечивающая максимальную эффективность димеризации, зависит от типа клетки и концентрации якорного белка, поэтому ее необходимо будет определить для различных экспериментов. Одним из простых способов является инкубирование клеток, экспрессирующих якорный белок и mCherry-eDHFR (без слияния с фазой, разделяющей белок, или слияния с нефазным разделяющим мутантом) и идентификация концентрации димеризатора, при которой достигается наибольшая интенсивность mCherry на якоре. Более систематический подход заключается в инкубации клеток, экспрессирующих якорь только с различными концентрациями димеризаторов, а затем с помощью красителя, связывающего Halo, чтобы помочь определить концентрацию димеризатора, при которой интенсивность красителя Halo начинает плато (т. Е. Все гало-плавленые анкеры заняты димеризатором и больше не остаются для красителя связывания Halo)32.
  4. Для обратной димеризации инкубируют клетки с димеризаторами в течение 2-5 часов (с живой визуализацией или без нее) или до достижения желаемого размера капель и добавляют 100 мкМ свободного ТМП (конечная концентрация), разбавленная в среде визуализации к клеткам.

3. Иммунофлуоресценция (ИФ)

  1. Семена 105 ячеек на круглой крышке стекла диаметром 12 мм, покрытой поли-D-лином в 6-скважинной пластине. Затем трансфектируют две плазмиды (Halo-GFP-TRF1 с mCherry-eDHFR-SIM или мутант mCherry-eDHFR-SIM) и ждут 24-48 часов, прежде чем приступить к иммунофлуоресценции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подождите более одного дня после того, как трансфекция может получить более высокую экспрессию.
  2. Разбавляют димеризаторы питательной средой до достижения конечной концентрации 100 нМ, добавляют к клеткам разбавленные димеризаторы и инкубируют при 37 °С в течение 4-5 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разделение фаз быстро индуцируется после добавления димеризаторов (< 30 минут). Более длительная инкубация помогает каплям огрубеться в большие размеры. Последующий рост капель с живой визуализацией может быть использован для определения времени, необходимого для того, чтобы капли достигли желаемого состояния.
  3. Зафиксируйте клетки в растворе PBS, содержащем 4% формальдегид и 0,1% тритон X-100 в течение 10 мин при комнатной температуре для проницаемости клеток. Промыть ячейки 3 раза PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После этого шага его можно приостановить, и ячейки можно хранить при 4 °C до недели.
    Внимание: Формальдегид вреден при вдыхании, и при проглатывании он также раздражает глаза, дыхательную систему и кожу и является возможной опасностью для рака. Нужно носить средства индивидуальной защиты, использовать только в химическом вытяжном капюшоне. Также положите его в контейнер для отходов после использования, не утилизируйте его в раковину.
  4. Дважды промывайте крышки 50 мкл TBS-Tx и один раз буфером разбавления антител 50 мкл (AbDil). TBS-Tx производился TBS, 0,1% Triton X-100 и 0,05% Na-азидом. AbDil производился TBS-Tx, 2% BSA и 0,05% Na-азида.
  5. Инкубировать каждый покров с 50 мкл первичного анти-PML (разведение 1:50 в AbDil) / анти-SUMO1 (разведение 1:200 в AbDil) / анти-SUMO2/3 антитела (1:200 разведение в AbDil) при 4 °C в увлажненной камере в течение ночи. Антитело mCherry также может быть использовано (разведение 1:200 в AbDil), чтобы помочь обнаружить сигнал mCherry для FISH.
    ПРИМЕЧАНИЕ: FISH гашет флуоресцентный сигнал mCherry, что затрудняет дифференциацию клеток, трансфектерированных плазмидами mCherry, от тех, которые не трансфекциированы в экспериментах FISH. Рекомендуется использовать антитела mCherry. Альтернативно, можно сделать стабильную клеточную линию, экспрессирующую eDHFR, содержащий белок.
  6. Промывайте крышки 3 раза AbDil для удаления несвязанным первичным антителом.
  7. Инкубировать клетки с вторичным антителом [антимышечное IgG (H+L) вторичное антитело, конъюгированное с Alexa Fluor 647 для PML и SUMO, анти-кролик IgG (H+L) вторичное антитело, конъюгированное с Alexa Fluor 555 для mCherry, оба в разведении 1:1000 в AbDil] в течение 1 часа в темной коробке при комнатной температуре.
  8. Стирайте крышки 3 раза с помощью TBS-Tx.
  9. Этикетка слайдов, разбавляемая DAPI в монтажной среде для достижения конечной концентрации DAPI 1 мкг/мл. Затем наденьте 2 мкл разбавленного DAPI на слайд. Переверните крышки и поместите их на каплю DAPI, истрепайте дополнительную жидкость от края крышки.
  10. Запечатайте лаком для ногтей, дайте ему высохнуть и смойте сверху крышки водой. Сохранить в морозильной камере для визуализации.

4. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)

  1. Семена 105 ячеек на круглой крышке стекла диаметром 12 мм, покрытой поли-D-лином в 6-скважинной пластине. Трансфектировать клетки с помощью мутантных плазмид Halo-TRF1 и mCherry-eDHFR-SIM или mCherry-eDHFR-SIM и подождать 24-48 ч, прежде чем перейти к FISH. Шаг димеризации такой же, как описано в 3.2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь TRF1 не сливается с GFP, поэтому зеленый канал освобождается для зонда ДНК теломер.
  2. Зафиксируйте ячейки 4% формальдегидом в течение 10 минут при комнатной температуре и промыть 4 раза PBS. Для IF-FISH перейдите к протоколу IF отсюда и после смывания вторичных антител в IF (3.8) рефиксировать клетки с 4% формальдегидом в течение 10 минут при комнатной температуре и промыть три раза PBS.
  3. Обезвоживает крышки в серии этанола (70%, 80%, 90%, 2 мин каждая).
  4. Инкубировать крышки с помощью зонда PNA 488-telC (соотношение 1:2000) в 5 мкл гибридизационного раствора при 75 °C в течение 5 минут. Гибридизационный раствор содержит 70% деионизированный формамид, 10 мМ Трис (рН 7,4), 0,5% блокирующий реагент. Затем насиживают на ночь в увлажненной камере при комнатной температуре.
  5. Стирочные крышки с буфером для стирки (70% формамида, 10 мМ Tris) 2 мин в 3 раза при комнатной температуре и монтаж с 1 мкг/мл DAPI в монтажных средах для визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол FISH является опубликованным протоколом33'34.

5. Живая визуализация

  1. Когда клетки будут готовы к визуализации, установите крышки в магнитных камерах с ячейками, поддерживаемыми в среде визуализации 1 мл без фенол-красного цвета на нагретой сцене в камере окружающей среды.
  2. Настройте микроскоп и аппарат контроля окружающей среды. Изображения были получены с помощью вращающегося дискового конфокального микроскопа с объективом 100x 1,4 NA, Пьезо-Z-привода, камеры электронно-умножающего зарядово-связанного устройства (EMCCD) и модуля лазерного слияния, оснащенного лазерами 455, 488, 561, 594 и 647 нм, управляемыми программным обеспечением для визуализации. Выходная мощность для всех лазеров 20 мВт измеряется на конце волокна.
  3. Локализуйте клетки с ярким сигналом GFP на теломерах и диффузно локализованным сигналом mCherry в нуклеоплазме. Найдите около 20 ячеек, запомните каждую позицию с информацией x, y, z и настройте параметры для покадровой визуализации с интервалом 0,5 мкм в общей сложности 8 мкм в Z и 5-минутным интервалом времени в течение 2-4 часов для каналов GFP и mCherry. Используйте 30% от 594 нм и 50% от 488 нм с частотой экспозиции 200 мс и усилением камеры 300.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выходная мощность лазерных блоков составляет 20 мВт. Яркие фокусы GFP указывают на больший размер якоря, который может легче зародышить конденсаты. Найдите ячейки с широким диапазоном сигнала mCherry, потому что разделение фаз зависит от концентрации SIM в клетке. Ячейки со слишком тусклым или слишком ярким сигналом mCherry могут не разделяться по фазе. Чтобы избежать фотоотбеливания, не используйте слишком много лазерной энергии или слишком длительное время экспозиции.
  4. Запустите визуализацию и возьмите одноразовый цикл в качестве предварительной димеризации. Приостановите визуализацию, добавьте 0,5 мл среды визуализации, содержащей 15 мкл димеризатора 10 мкМ, в камеру визуализации на сцене, чтобы конечная концентрация димеризатора была 100 нМ. Визуализация резюме.
  5. Когда все будет готово к обратной димеризации, приостановите визуализацию, добавьте 0,5 мл среды визуализации, содержащей 2 мкл 100 мМ запасного TMP, в камеру визуализации на сцене, чтобы получить конечную концентрацию TMP 100 мкМ. Продолжайте визуалить клетки в течение 1-2 часов.

6. Фиксированная визуализация

  1. Тот же микроскоп, настроенный как живая визуализация, нагрев сцены не нужен. Используйте 488 нм для изображения теломер FISH, 561 нм для mCherry IF и 647 нм для PML или SUMO IF.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если не используется антитело mCherry, просто непосредственно изобразьте белок mCherry, но сигнал может быть тусклым из-за закалки в FISH.  По-прежнему используйте лазер 561 нм, а не 594 нм для изображения mCherry, чтобы избежать пропускания сигнала от Cy5 к mCherry.
  2. Найдите около 30-50 клеток с красным сигналом (mCherry или mCherry IF), чтобы выбрать трансфектированные клетки.
  3. Изображения были сделаны с интервалом 0,3 мкм в общей сложности 8 мкм в Z для сбора большего количества сигналов. Используйте 80% 647 нм, 80% 561 нм и 70% 488 нм с интенсивностью мощности, со временем экспозиции 600 мс и усилением камеры 300.

7. Обработка покадровых изображений

  1. Определение двоичного кода для теломер
    Выберите одну ячейку со всей информацией о времени и z-стеке, выберите только канал GFP и создайте двоичный слой, определив пороговое значение. Отрегулируйте нижнее и верхнее значения порога и используйте такие функции, как «Сглаживание», «Очистка» и «Заполнение отверстий», чтобы увидеть, насколько хорошо порог подбирает нужные объекты во всех временных точках.
  2. Вычесть фон
    Выберите все каналы, нарисуйте прямоугольник Интересуемая область (ROI) на фоне (кроме ячейки). Определите эту рентабельность инвестиций как фон, а затем вычтите интенсивность фона.
  3. Связывание двоичной телемеры с интенсивностью теломер
    Выберите двоичный телемер и свяжите его с каналом GFP для вычисления интенсивности GFP в двоичных объектах как интенсивности теломер.
  4. Вычисление количества теломер и интенсивности с течением времени
    Укажите, какие сведения необходимо экспортировать, такие как время, идентификатор объекта, средняя интенсивность, интенсивность суммы и данные экспорта. Используйте программное обеспечение для построения рисунков для чтения экспортированной таблицы и генерации цифр числа теломер и интенсивности теломер (суммируйте интенсивность по объему в каждом теломере, а затем усреднение по всем теломерам в клетке) с течением времени.

8. Обработка изображений с фиксированными ячейками

  1. Определение двоичного файла для APB
    Выберите трансфекированные клетки для анализа, ища сигнал в канале 561 нм. Следуя процедуре, описанной в 7.1, определите порог в канале GFP (теломерная ДНК FISH) и Cy5 (PML или SUMO IF) для генерации двоичных данных для теломер и тел PML или SUMO соответственно. Объедините двоичные слои GFP и Cy5 и создайте новый слой, содержащий частицы, которые имеют сигнал GFP и Cy5, чтобы представлять собой колокализацию тела PML на теломерах, таким образом, APB.
  2. Вычисление числа и интенсивности APB/SUMO
    Вычтите фон изображения после 7.2. Свяжите двоичный слой APB/SUMO с каналом Cy5 в соответствии с 7.3. Рассчитайте число и интенсивность APB/SUMO. Экспорт и построение данных после 7.4.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Репрезентативные изображения теломерной локализации SUMO, идентифицированные теломерной ДНК FISH и белка SUMO IF, показаны на рисунке 2. Клетки с набором SIM-карты обогащали SUMO1 и SUMO 2/3 на теломерах по сравнению с клетками с набором мутантов SIM. Это указывает на то, что вызванное димеризацией SIM обогащение SUMO на теломерах зависит от взаимодействий SUMO-SIM.

Репрезентативный покадровой ролик TRF1 и SIM-карты после димеризации показан в видео 1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол продемонстрировал образование и растворение конденсатов на теломерах с помощью системы химической димеризации. Кинетика разделения фаз и кластеризация теломер, вызванная слиянием капель, контролируются с помощью живой визуализации. Локализацию и состав конденсата определяют с помощью ДНК FISH и белка IF.

В этом протоколе есть два важных шага. Первый заключается в определении концентрации белка и димеризатора. Успех в индуцировании локального разделения фаз в геномном локусе завис...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения США (1K22CA23763201 до H.Z., GM118510 до D.M.C.) и Фондом Чарльза Э. Кауфмана для H.Z. Авторы хотели бы поблагодарить Джейсона Тонса за корректуру рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,25% трипсина, 0,1% ЭДТА в HBSS без кальция, магния и бикарбонатаCorningMT25053CI
16% формальдегида (w/v), без метанолаThermo Scientific28906Приготовить 1% в 1x PBS
6 Культуральная пластинаVWR10861-554
Алюминиевая фольгаFisher Scientific01-213-101
Антитела против mCherryAbcamAb183628
Антитело Anti-PMLSanta Cruzsc966
Антитело Anti-SUMO1AbcamAb32058
Антитело Anti-SUMO2/3ЦитоскелетAsm23
Блокирующий реагентRoche11096176001
Сыворотка крови крупного рогатого скота Альбумин (BSA)НаучныйBP9706100
BTX Tube micro 1.5ML VWR89511-258
Круглая крышкаThermo Scientific3350
Конфокальный микроскоп NikonMQS31000
DAPIFisher ScientificD1306
диметилсульфоксид Sigma-Aldrich472301
DMEM с L-глутамином, 4,5 г/л глюкозы и пирувата натрияCorningMT10017CV
камерой EMCCDiXon Life 897
ЭтанолFisher Scientific4355221
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота, сертифицированная, одобренная Министерством сельского хозяйства США регионыGibcoA4766801
формамид, деионизированныйMilliporeSigma46-101-00ML
козий антимышиный IgG (H+L), рекомбинантное вторичное антитело, Alexa Fluor 647InvitrogenA28181
Козий антикроличий IgG (H+L), рекомбинантное вторичное антитело, Alexa Fluor 647InvitrogenA32733
Высокоточный прямой конический ультратонкий пинцет/щипцыFisher Scientific12-000-122
Модуль лазерного слияния NikonNIIMHF47180
Leibovitz's L-15 MediumGibco21083027
Lipofectamine 2000 Реагент для трансфекцииInvitrogen11668027
Программное обеспечение для рисования рисунков, MATLABМикроскоп MathWorks
Слайд-боксFisher Scientific34487
Лак для ногтейFisher Scientific50-949-071
Программное обеспечение для обработки изображений, NIS-Elements Nikon
Opti-MEM Пониженная сыворотка МедиаGibco51985091
ПарапленкаBemis13-374-12
PBS 10X, pH 7,4Fisher Scientific70-011-044
Раствор пенициллина-стрептомицина, 100XGibco15140122
Piezo Z-Drive;Physik Instrumente (PI)91985
Наконечники для пипетокVWR10017
Предметные стекла для микроскопа с обрезанным угломFisher Scientific22-037-246
Раствор поли-D-лизинаSigma-AldrichA-003-E
Азид натрияFisher ScientificBP922I-500
Вращающийся дискYokogawaCSU-X1
Квадратная крышкаThermo Scientific3305
TBS 10x растворFisher ScientificBP2471500
TelC-Alexa488PNA BioF1004
TMPСинтезировано лабораториейДоступно по запросу
TNHСинтезировано лабораториейДоступно по запросу
Tris SolutionFisher Scientific92-901-00ML
Triton X-100 10% растворMilliporeSigma64-846-350MLПриготовьте 0,5% в 1x
PBS U2Os клеточной линиииз лаборатории Е.В. Макаева (Наньянский технологический университет, Сингапур)HTB-96
VECTASHIELD Antifade Mounting MediumVector LaboratoriesNC9524612
натрия Фишера Chenoweth Chenoweth

Ссылки

  1. Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
  2. Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).
  3. Sabari, B. R., Dall'Agnese, A., Young, R. A. Biomolecular condensates in the nucleus. Trends in Biochemical Sciences. , 1-17 (2020).
  4. Strom, A. R., et al. Phase separation drives heterochromatin domain formation. Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).
  5. Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1α suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).
  6. Boija, A., et al. Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains. Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).
  7. Hur, W., et al. CDK-Regulated phase separation seeded by histone genes ensures precise growth and function of histone locus bodies. Developmental Cell. 54 (3), 379-394 (2020).
  8. McSwiggen, D. T., Mir, M., Darzacq, X., Tjian, R. Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences. Genes & Development. 33 (23-24), 1619-1634 (2019).
  9. Peng, A., Weber, S. C. Evidence for and against liquid-liquid phase separation in the nucleus. Non-coding RNA. 5 (4), (2019).
  10. Erdel, F., et al. Mouse heterochromatin adopts digital compaction states without showing hallmarks of HP1-driven liquid-liquid phase separation. Molecular Cell. 78 (2), 236-249 (2020).
  11. Zhang, H., et al. Nuclear body phase separation drives telomere clustering in ALT cancer cells. Molecular Biology of the Cell. 31 (18), 2048-2056 (2020).
  12. Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer. Nature Communications. 5, 1-9 (2014).
  13. Yeager, T. R., et al. Telomerase-negative immortalized human cells contain a novel type of promyelocytic leukemia (PML) body. Cancer Research. 59 (17), 4175-4179 (1999).
  14. Zhang, J. M., Zou, L. Alternative lengthening of telomeres: From molecular mechanisms to therapeutic outlooks. Cell and Bioscience. 10 (1), 1-9 (2020).
  15. Corpet, A., et al. PML nuclear bodies and chromatin dynamics: catch me if you can. Nucleic Acids Research. , 1-23 (2020).
  16. Li, Y., Ma, X., Wu, W., Chen, Z., Meng, G. PML nuclear body biogenesis, carcinogenesis, and targeted therapy. Trends in Cancer. 6 (10), 889-906 (2020).
  17. Dilley, R. L., Greenberg, R. A. ALTernative telomere maintenance and cancer. Trends in Cancer. 1 (2), 145-156 (2015).
  18. Sobinoff, A. P., Pickett, H. A. Alternative lengthening of telomeres: DNA repair pathways converge. Trends in Genetics. 33 (12), 921-932 (2017).
  19. Draskovic, I., et al. Probing PML body function in ALT cells reveals spatiotemporal requirements for telomere recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15726(2009).
  20. Zhang, J. M., Yadav, T., Ouyang, J., Lan, L., Zou, L. Alternative lengthening of telomeres through two distinct break-induced replication pathways. Cell Reports. 26 (4), 955-968 (2019).
  21. Loe, T. K., et al. Telomere length heterogeneity in ALT cells is maintained by PML-dependent localization of the BTR complex to telomeres. Genes and Development. 34 (9-10), 650-662 (2020).
  22. Potts, P. R., Yu, H. The SMC5/6 complex maintains telomere length in ALT cancer cells through SUMOylation of telomere-binding proteins. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (7), 581-590 (2007).
  23. Chung, I., Leonhardt, H., Rippe, K. De novo assembly of a PML nuclear subcompartment occurs through multiple pathways and induces telomere elongation. Journal of Cell Science. 124 (21), 3603-3618 (2011).
  24. Shen, T. H., Lin, H. K., Scaglioni, P. P., Yung, T. M., Pandolfi, P. P. The mechanisms of PML-nuclear body formation. Molecular Cell. 24 (3), 331-339 (2006).
  25. Shima, H., et al. Activation of the SUMO modification system is required for the accumulation of RAD51 at sites of DNA damage. Journal of Cell Science. 126 (22), 5284-5292 (2013).
  26. Yalçin, Z., Selenz, C., Jacobs, J. J. L. Ubiquitination and SUMOylation in telomere maintenance and dysfunction. Frontiers in Genetics. 8, 1-15 (2017).
  27. Sarangi, P., Zhao, X. SUMO-mediated regulation of DNA damage repair and responses. Trends in Biochemical Sciences. 40 (4), 233-242 (2015).
  28. Banani, S. F., et al. Compositional control of phase-separated cellular bodies. Cell. 166 (3), 651-663 (2016).
  29. Min, J., Wright, W. E., Shay, J. W. Clustered telomeres in phase-separated nuclear condensates engage mitotic DNA synthesis through BLM and RAD52. Genes and Development. 33 (13-14), 814-827 (2019).
  30. Song, J., Durrin, L. K., Wilkinson, T. A., Krontiris, T. G., Chen, Y. Identification of a SUMO-binding motif that recognizes SUMO-modified proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14373-14378 (2004).
  31. Zhang, H., Chenoweth, D. M., Lampson, M. A. Chapter 7 - Optogenetic control of mitosis with photocaged chemical dimerizers. Mitosis and Meiosis Part A. 144, 157-164 (2018).
  32. Zhang, H., et al. Optogenetic control of kinetochore function. Nature Chemical Biology. 13 (10), 1096-1101 (2017).
  33. Cho, N. W., Dilley, R. L., Lampson, M. A., Greenberg, R. A. Interchromosomal homology searches drive directional ALT telomere movement and synapsis. Cell. 159 (1), 108-121 (2014).
  34. Dilley, R. L., et al. Break-induced telomere synthesis underlies alternative telomere maintenance. Nature. 539 (7627), 54-58 (2016).
  35. Aonbangkhen, C., Zhang, H., Wu, D. Z., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Reversible control of protein localization in living cells using a photocaged-photocleavable chemical dimerizer. Journal of the American Chemical Society. 140 (38), 11926-11930 (2018).
  36. Shin, Y., et al. Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optoDroplets. Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).
  37. Shin, Y., et al. Liquid nuclear condensates mechanically sense and restructure the genome. Cell. 175 (6), 1481-1491 (2018).
  38. Xiang, X., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene tagging: a step-by-step protocol. Methods in Molecular Biology. 1961, 255-269 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

FISHSUMO SIMPML
Химические белковые конденсаты, индуцированные димеризацией, на теломерах
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.