Этот протокол представляет собой быстрый и полезный инструмент для оценки роли белка с неохарактерной функцией в альтернативной регуляции сплайсинга после химиотерапевтического лечения.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Использование инструмента E1A Minigene для изучения изменений сплайсинга мРНК
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Обработка мРНК включает в себя несколько одновременных этапов подготовки мРНК к трансляции, таких как 5'capping, поли-A сложение и сплайсинг. Помимо конститутивного сплайсинга, альтернативное сплайсинг мРНК позволяет экспрессифицирование многофункциональных белков из одного гена. Поскольку исследования интерактома, как правило, являются первым анализом новых или неизвестных белков, ассоциация белка приманки с факторами сплайсинга является признаком того, что он может участвовать в процессе сплайсинга мРНК, но определение того, в каком контексте или какие гены регулируются, является эмпирическим процессом. Хорошей отправной точкой для оценки этой функции является использование классического инструмента минигена. Здесь мы представляем использование минигена аденовирусного E1A для оценки альтернативных изменений сплайсинга после различных клеточных стрессовых стимулов. Мы оценили сращивание минигена E1A в HEK293, стабильно сверхэкспрессирующего белок Nek4 после различных стрессовых процедур. Протокол включает в себя трансфекцию минигена E1A, обработку клеток, экстракцию РНК и синтез кДНК, за которыми следует ПЦР и гель-анализ и количественная оценка сращиваемых вариантов E1A. Использование этого простого и хорошо заявидского метода в сочетании со специфическими методами лечения является надежной отправной точкой для того, чтобы пролить свет на клеточные процессы или на то, какие гены могут регулироваться сращиванием мРНК.
Введение
Сплайсинг является одним из наиболее важных этапов в обработке эукариотической мРНК, которая происходит одновременно с укупорки 5'мРНК и полиаденилированием 3'мРНК, включая удаление интрона с последующим переходом экзона. Для сплайсинга необходимо распознавание сайтов сплайсинга (SS) сплайсеосомой, рибонуклеопротеинового комплекса, содержащего мелкие рибонуклеопротеины (snRNP U1, U2, U4 и U6), малые РНК (snRNAs) и несколько регуляторных белков1.
Помимо удаления интронов (конститутивного сплайсинга), у эукариот интроны могут быть сохранены, а экзоны могут быть исключены, конфигурируя процесс, называемый альтернативным....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Покрывающие ячейки
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом описанном протоколе были использованы стабильные клеточные линии HEK293, ранее сгенерированные для стабильной индуцируемой экспрессии Nek421,однако этот же протокол подходит для многих других клеточных линий, таких как HEK29322,HeLa23, 24,25,26,U-2 OS27,COS728,SH-SY5Y29. Картина экспрессии минигенных изоформ Е1А в базальных условиях варьируется между этими к....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Был проведен 5-й анализ участков сращивания с использованием минигена E1A для оценки изменений профиля сплайсинга в клетках после экспозиции химиотерапии. Оценивалась роль Nek4 -изоформы 1 в регуляции АС в стабильных клетках HEK293 после лечения паклитакселом или цисплатином.
Аденовирусная область E1A отвечает за выработку трех основных мРНК из одного предшественника РНК из-за использования различных доноров сращивания. Они имею.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Минигены являются важными инструментами для определения эффектов в глобальном альтернативном сплайсинге in vivo. Аденовирусный миниген E1A успешно используется в течение десятилетий для оценки роли белков путем увеличения их количества в клетке13,14. Здесь мы предлагаем использование минигена E1A для оценки альтернативного сплайсинга после химиотерапевтического воздействия. Использовали стабильную клеточную линию, экспрессирующую изоформу Nek4 1, избегая артефакт.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Мы благодарим Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, через грант Temático 2017/03489-1 для JK и стипендию FLB 2018/05350-3) и Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) за финансирование этого исследования. Мы хотели бы поблагодарить д-ра Адриана Крайнера за предоставление плазмиды pMTE1A и Церлера и его коллег за их работу по клонированию E1A. Мы также благодарим профессора д-ра Патрисию Мориэль, профессора д-ра Ванду Перейру Алмейду, профессора д-ра Марсело Ланчелотти и профессора д-ра Карину Кого Кого Мюллер за то, что они позволили нам использовать их лабораторные помещения и оборудование.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 100 пб Лестница ДНК | Invitrogen | 15628-050 | |
| 6 лунок пластина | Sarstedt | 833920 | |
| Агароза | Sigma | A9539-250G | |
| Цисплатин | Sigma | P4394 | |
| DEPC вода | ThermoFisher | AM9920 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965118 | |
| смесь dNTP | ThermoFisher | 10297-018 | |
| Фетальная бычья сыворотка - FBS | ThermoFisher | 12657029 | |
| Флуоресцентный микроскоп | Leica | DMIL LED FLUO | |
| Gel Система визуализации - ChemiDoc Gel Imagin System | Bio-Rad | ||
| GFP - pEGFPC3 | Clontech | ||
| HEK293 стабильные клетки - HEK293 Flp-In | Сгенерировано из Flp-In™ T-REx™ 293 - Invitrogen и описан в ref 21 | ||
| Гигромицин B | ThermoFisher | 10687010 | используется для Flp-In клеток Программное обеспечение для |
| обработки и анализа изображений - программное обеспечение | ref. 32 | ||
| Реагент для трансфекции на основе липидов - jetOPTIMUS Polyplus Reagent | Polyplus | 117-07 | |
| Oligo DT | ThermoFisher | 18418020 | |
| Планшетный ридер Paclitxel | Invitrogen | P3456 | |
| поглощение ультрафиолета | Biotech | Epoch Biotek / адаптер Take3 | |
| pMTE1A плазмида | предоставлен доктором Адрианом Крайнером | ||
| pMTE1A F | Invitrogen | 5' -ATTATCTGCCACGGAGGT-3 | |
| pMTE1A R | Invitrogen | 5' -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3' | |
| Охлаждаемая центрифуга | Eppendorf | F5810R | |
| Обратная транскриптаза - M-MLV | ThermoFisher | 28025013 | |
| обратная транскриптаза - Superscript IV | ThermoFisher | 18090050 | |
| ингибитор рибунуклеазы РНКаза OUT | ThermoFisher | 10777-019 | |
| РНК экстракция на основе фенол-хлороформа - Тризол | ThermoFisher | 15596018 | |
| SybrSafe Гелевая краска для ДНК | ThermoFisher | S33102 | |
| Taq | Platinum Thermo | 10966026 | |
| Тетрациклин | Sigma | T3383 | Используется для Флаг пустой или Nek4- Индукция экспрессии флага |
| Термоамплификатор Bio-Rad | Bio-Rad | T100 | |
| Трипсин | Sigma | T4799 |
Ссылки
- Ule, J., Blencowe, B. J. Alternative Splicing Regulatory Networks: Functions, Mechanisms, and Evolution. Molecular Cell. 76 (2), 329-345 (2019).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
