Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Анализ церебрального спазма сосудов в мышиной модели субарахноидального кровоизлияния с помощью высокочастотного транскраниального дуплексного ультразвука

3.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62186

⸱

3 июня 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, University Medical Center of the Johannes Gutenberg-University of Mainz, 2Center for Cardiology - Cardiology I, University Medical Center of the Johannes Gutenberg-University of Mainz, 3Center for Thrombosis and Hemostasis (CTH), University Medical Center of the Johannes Gutenberg-University of Mainz, 4German Center for Cardiovascular Research (DZHK) - Partner site Rhine-Main, 5Department of Anesthesiology, University Medical Center of the Johannes Gutenberg-University of Mainz

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Целью этой рукописи является представление метода на основе сонографии, который позволяет in vivo визуалировать кровоток в мозговых артериях у мышей. Показано его применение для определения изменений скоростей кровотока, связанных с спазмом сосудов в мышиных моделях субарахноидального кровоизлияния (САГ).

Аннотация

Церебральный спазм сосудов, возникающий через недели после субарахноидального кровоизлияния, разновидность геморрагического инсульта, способствует задержке ишемии головного мозга. Проблема, встречаемая в экспериментальных исследованиях с использованием мышиных моделей SAH, заключается в том, что отсутствуют методы мониторинга in vivo церебрального спазма сосудов у мышей. Здесь мы демонстрируем применение высокочастотного ультразвука для выполнения транскраниальных дуплексных сонографических исследований на мышах. С помощью метода можно было идентифицировать внутренние сонные артерии (ICA). Скорости кровотока в внутричерепных ICO значительно ускорялись после индукции SAH, в то время как скорости кровотока в экстракраниальных ICO оставались низкими, что указывает на церебральный спазм сосудов. В заключение, метод, продемонстрированный здесь, позволяет осуществлять функциональный, неинвазивный in vivo мониторинг церебрального вазоспазма в мышиной модели SAH.

Введение

Спонтанное субарахноидальное кровоизлияние (САГ) является формой геморрагического инсульта, в основном вызванного разрывом внутричерепной аневризмы1. На неврологический исход в основном влияют два фактора: ранняя черепно-мозговая травма (ЭБР), которая вызвана последствиями кровотечения и связанной с ним транзиторной глобальной ишемии головного мозга, и отсроченная ишемия головного мозга (ДКИ), которая возникает в течение недель после кровотечения2,3. Сообщалось, что DCI затрагивает до 30% пациентов с САГ2. Патофизиология DCI включает ангиографический церебральный спазм сосудов, нарушенную микроциркуляцию, вызванную микровасоспазмами и микротромбозом, кортикальные распространяющиеся депрессии и эффекты, вызванные воспалением4. К сожалению, точная патофизиология остается неясной, и нет доступного лечения, которое эффективно предотвращает DCI3. Поэтому DCI исследуется во многих клинических и экспериментальных исследованиях.

В настоящее время большинство экспериментальных исследований SAH используют модели мелких животных, особенно у мышей5,6,7,8,9,10,11,12,13. В таких исследованиях церебральный спазм сосудов часто исследуется как конечная точка. Принято определять степень спазма сосудов ex vivo. Это связано с тем, что отсутствуют неинвазивные методы исследования in vivo церебрального спазма сосудов, требующие короткого времени анестезии и наносящие лишь небольшой дистресс животным. Тем не менее, обследование церебрального спазма вазоса in vivo будет выгодным. Это связано с тем, что это позволило бы проводить продольные исследования in vivo по спазму сосудов у мышей (т. Е. Визуализация церебрального спазма сосудов в разные моменты времени в течение нескольких дней после индукции SAH). Это повысило бы сопоставимость данных, полученных в разные моменты времени. Кроме того, использование продольного дизайна исследования является стратегией сокращения численности животных.

Здесь мы демонстрируем использование высокочастотного транскраниального ультразвука для определения кровотока в мозговых артериях у мышей. Показано, что, подобно транскраниальной допплерографии (ТХД) или транскраниальной цветной дуплексной сонографии (ТКХД) в клинической практике14,15,16,17,18,этот метод может быть использован для мониторинга церебрального спазма сосудов путем измерения скоростей кровотока внутричерепных артерий после индукции САУ в мышиной модели.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Эксперименты на животных были одобрены ответственным комитетом по уходу за животными (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz) и проведены в соответствии с Немецким законом о благополучии животных (TierSchG). Были соблюдена все применимые международные, национальные и институциональные руководящие принципы по уходу за животными и их использованию. В этом исследовании мы провели измерения скоростей кровотока внутричерепных и экстракраниальных артерий у самок мышей C57BL/6N в возрасте 11-12 недель с массой тела 19-21 г. Мышей подвергали либо индукционной САХ, либо фиктивной хирургии, которая была подробно описана в другом месте10,12,13.

1. Подготовка материалов

  1. Включите ультразвуковой аппарат и введите идентификатор животного.
  2. Нагреть нагревательную пластину ультразвуковой системы до 37 °C. Убедитесь, что ректальный датчик температуры готов к использованию.
  3. Используйте водяную баню, чтобы нагреть ультразвуковой гель до 37 °C. Приготовьте крем для удаления волос, контактный крем для электродов и глазную мазь.

2. Анестезия

  1. Индуцируют анестезию, помещая мышь в камеру, промытую 4% изофлураном и 40% O2 в течение 1 мин. Защитите глаза глаз глазной мазью. Продолжают только после того, как будет достигнута достаточно глубокая анестезия (отсутствие реакций на болевые раздражители).
  2. Поддерживайте анестезию с 1,5% изофлураном и 40% O2 с помощью анестезии маски на протяжении всей процедуры.

3. Определение скоростей кровотока внутричерепных внутренних сонных артерий с помощью транскраниальной высокочастотной дуплексной сонографии

  1. Поместите мышь в положение лежа на нагревательной пластине ультразвуковой системы для поддержания температуры тела 37 °C.
  2. Покрывайте четыре конечности животного проводящей пастой и закрепляйте их скотчем на электродах ЭКГ, встроенных в доску. Проверьте, правильно ли отображаются физиологические параметры (ЭКГ, сигнал дыхания) на экране системы визуализации (например, Vevo3100). При необходимости корректируют уровень анестезии для получения целевой частоты сердечных сокращений 400-500 ударов в минуту (уд/мин).
  3. Поместите смазку на ректальный температурный зонд и осторожно вставьте его, чтобы контролировать температуру тела. При необходимости используйте дополнительную нагревательную лампу.
  4. Перед первым обследованием удалите мех на затылочном затылочном химическом методе с помощью крема для удаления волос. Используйте ватный тампон для намазыва и растирайте крем в течение 2 минут, пока волоски не начнут выпадать.
    1. Через дополнительные 2 мин удалите крем и волоски шпателем и продезинфицируйте кожу спиртовым антисептиком для кожи. Покрыть ультразвуковым гелем, подогретым до 37 °C.
  5. Используйте линейный преобразователь с частотой 38 МГц и частоту кадров выше 200 кадров/с для получения ультразвуковых изображений и фиксации зонда в механическом рычаге. Поместите преобразователь на затылку, наклоненный назад на 30°.
  6. Используйте режим яркости (B) и доплеровский режим цветной волны (CW) для визуализации правой внутричерепной внутренней сонной артерии и перемещения датчика с блоком управления назад и вперед, пока не будет найден максимальный поток артерий.
  7. Для сбора анатомической информации используйте традиционный B-mode и CW-doppler-режим и начните сбор, нажав на кнопку Acquire.
    1. Для записи информации о характеристиках потока внутричерепных сосудов нажмите кнопку Pulse-Wave (PW) Doppler, поместите объем образца в центр сосуда и приобретите кинопетлю длиной более 3 с.
  8. Действуйте аналогично с левой стороны.
  9. Продолжают проводить экстракраниальные сонные артерии.

4. Определение скоростей кровотока экстракраниальных внутренних сонных артерий с помощью высокочастотной дуплексной сонографии

  1. Поместите мышь в положение лежа на спине на нагревательной пластине ультразвуковой системы для поддержания температуры тела 37 °C.
  2. Покрывайте четыре конечности животного проводящей пастой и закрепляйте их скотчем на электродах ЭКГ, встроенных в доску. Проверьте еще раз правильность отображения физиологических параметров на экране.
  3. Перед первым обследованием удалите волосы на передней шее химическим путем, используя крем для удаления волос, как описано выше. Обработать переднюю шею ультразвуковым гелем, нагретым до 37 °C.
  4. Используйте линейный преобразователь массива 38 МГц и частоту кадров выше 200 кадров/с для получения ультразвуковых изображений. Поместите преобразователь параллельно животному и отрегулируйте положение, чтобы получить продольные изображения правой сонной артерии.
  5. Используйте режим яркости (B) и доплеровский режим цветной волны (CW) для визуализации правой сонной артерии. Изображение должно содержать правую общую сонную артерию (RCC), правую внутреннюю сонную артерию (RICA) и правую наружную сонную артерию (RECA).
  6. Для сбора анатомической информации используйте традиционный B-mode и CW-doppler-режим и начните сбор, нажав на кнопку Acquire.
    1. Для записи информации о характеристиках потока экстракраниальной сонной артерии нажмите кнопку Pulse-Wave (PW) Doppler, поместите объем образца в центр середины общей сонной артерии, внутренней сонной артерии и наружной сонной артерии и приобретите кинопетлю длиной более 3 с.
  7. Действуйте аналогично с левой стороны.
  8. Прекратите анестезию и выньте животное из согревающей пластины. Верните животное в клетку, помещенную в инкубатор, нагретый до 37 °C, в течение 1 часа, чтобы предотвратить переохлаждение и проверить полное выздоровление.

5. Обработка данных УЗИ

  1. Используйте внешнюю рабочую станцию для постобработки высокочастотных ультразвуковых данных. Экспортируйте изображения b-режимов, CW-доплеровских и PW-доплеровских режимов и киноциклов.
  2. Откройте экспортируемый ультразвуковой кабинет. Выберите одно животное и вскройте ПВ-допплеровскую кинопетку внутричерепной сонной артерии. В этом протоколе обычно регистрируется от 7 до 8 сердечных сокращений и соответствующих кривых скорости потока.
  3. Приостановите цикл кино и нажмите кнопку Измерение. Выберите сосудистый пакет и нажмите на RICA PSV, чтобы измерить пиковое систолическое давление (PSV). Теперь нажмите влево на пик кривой скорости и потяните прямую линию к нулевой линии. Определите измерение одним щелчком правой кнопки мыши.
  4. Теперь выберите RICA EDV для измерения конечной скорости (EDV). Нажмите влево на минимальную сыпь кривой скорости в конце диастолы. Потяните линию прямо к нулевой линии и определите измерение щелчком правой кнопкой мыши.
  5. Выберите RICA VTI для измерения интеграла времени скорости (VTI). Щелкните влево в начале кривой скорости и следуйте по кривой мышью до конца диастолического плато. Затем нажмите правую кнопку еще раз, чтобы определить измерение.
  6. Экспортируйте данные внутримозговых внутренних сонных артерий с помощью кнопки отчета. Нажмите экспорт и сохраните данные в виде файла отчета VSI.
  7. Используйте тот же подход для измерения ПСВ, ЭДВ и ВТИ правых экстракраниальных внутренних сонных артерий и экспортируйте данные соответствующим образом.
  8. Действуйте аналогично с левой стороны.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

У 6 мышей, у 3 из которых SAH индуцировали с использованием модели перфорации эндоваскулярной нити, в то время как у 3 была получена фиктивная операция, скорости кровотока внутричерепной внутренней сонной артерии (ICA) и экстракраниальной ICA были определены за день до операции и через 1, 3 и 7 дней после операции. Измерения проводились в рамках эхокардиографических исследований другого исследования под наркозом изофлураном при сохранении температуры тела на уровне 37 °C19.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Насколько нам известно, это исследование является первым, в котором представлен протокол мониторинга церебрального спазма сосудов в мышиной модели SAH с высокочастотным транскраниальным цветным дуплексным ультразвуком. Показано, что этот метод может измерять увеличение скоростей внутричерепного кровотока после индукции SAH у мышей. В медицине человека это явление хорошо известно3,15. Несколько клинических исследований показали, что повышенные скорости кровотока к...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Стефана Кинделя за подготовку иллюстраций в видео. PW, MM и SHK были поддержаны Федеральным министерством образования и исследований Германии (BMBF 01EO1503). Работа была поддержана Крупным инструментационным грантом Немецкого исследовательского фонда (DFG INST 371/47-1 FUGG). ММ был поддержан грантом От Эльзы Крёнер-Фрезениус-Stiftung (2020_EKEA.144).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
крем для эпиляции Balea Balea; ГерманияASIN B0759XM39Vкрем для эпиляции
C57BL/6N мышиJanvier; Saint-Berthevin Cedex, Францияn.a.mice
CorneregelBausch& Ломб; Рочестер, штат Нью-Йорк, СШАREF 81552983глазная мазь, смазочные
ватные палочкиHecht Assistent; Sondenheim vor der Rö hn, ГерманияREF 44302010ватные палочки
Ecco-XS бритваTondeo; Солиген, ГерманияDE 28693396бритва
Электрод кремGE; Бостон, Массачусетс, СШАREF 21708318проводящая паста
Нагревательная пластинаMedax; Киль, Германия2005-205-01
ИзофлуранАбви; Висбаден, Германияn.a.летучий анестетик
LeukofixBSN медицинский; Гамбург, ГерманияREF 02137-00лента
Механическая рука + микроманипуляторVisualSonics; FujiFilm, Торонто, КалифорнияP/N 11277
Салфетки Microbac PaulHartmann AG; Гамбург, ГерманияREF 981387антимикробные ткани
MZ400, линейный преобразователь 38 МГцVisualSonics; FujiFilm, Торонто, CAREF 51068-30ультразвуковой преобразователь
SonosidASID Bonz GmbH; Херренберг, ГерманияREF 782010гель для ультрасонографии
Ультразвуковая платформа с нагревательной пластиной и записью ЭКГVisualSonics; FujiFilm, Торонто, КалифорнияP/N 11179
UniVet-PortaGroppler; Оберперасберг, ГерманияСерийный BKGM0437изофлурановый испаритель
Vevo3100VisualSonics; FujiFilm, Торонто, КалифорнияREF 51073-45ультразвуковой аппарат
VevoLab программное обеспечениеVisualSonics; FujiFilm, Торонто, Калифорнияn.a.evaluationsoftware

Ссылки

  1. Macdonald, R. L., Schweizer, T. A. Spontaneous subarachnoid haemorrhage. Lancet. 389 (10069), 655-666 (2017).
  2. Macdonald, R. L. Delayed neurological deterioration after subarachnoid haemorrhage. Nature Reviews Neurology. 10 (1), 44-58 (2014).
  3. Francoeur, C. L., Mayer, S. A. Management of delayed cerebral ischemia after subarachnoid hemorrhage. Critical Care. 20 (1), 277(2016).
  4. van Lieshout, J. H., et al. An introduction to the pathophysiology of aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Neurosurgical Review. , (2017).
  5. Altay, T., et al. A novel method for subarachnoid hemorrhage to induce vasospasm in mice. J Neurosci Methods. 183 (2), 136-140 (2009).
  6. Momin, E. N., et al. Controlled delivery of nitric oxide inhibits leukocyte migration and prevents vasospasm in haptoglobin 2-2 mice after subarachnoid hemorrhage. Neurosurgery. 65 (5), 937-945 (2009).
  7. Froehler, M. T., et al. Vasospasm after subarachnoid hemorrhage in haptoglobin 2-2 mice can be prevented with a glutathione peroxidase mimetic. Journal of Clinical Neuroscience. 17 (9), 1169-1172 (2010).
  8. Provencio, J. J., Altay, T., Smithason, S., Moore, S. K., Ransohoff, R. M. Depletion of Ly6G/C(+) cells ameliorates delayed cerebral vasospasm in subarachnoid hemorrhage. Journal of Neuroimmunology. 232 (1-2), 94-100 (2011).
  9. Kamp, M. A., et al. Evaluation of a murine single-blood-injection SAH model. PLoS One. 9 (12), 114946(2014).
  10. Luh, C., et al. The Contractile Apparatus Is Essential for the Integrity of the Blood-Brain Barrier After Experimental Subarachnoid Hemorrhage. Translational Stroke Research. , (2018).
  11. Neulen, A., et al. A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
  12. Neulen, A., et al. Large Vessel Vasospasm Is Not Associated with Cerebral Cortical Hypoperfusion in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage. Translational Stroke Research. , (2018).
  13. Neulen, A., et al. Neutrophils mediate early cerebral cortical hypoperfusion in a murine model of subarachnoid haemorrhage. Scientific Reports. 9 (1), 8460(2019).
  14. Neulen, A., et al. Volumetric analysis of intracranial vessels: a novel tool for evaluation of cerebral vasospasm. Int J Comput Assist Radiol Surg. 14 (1), 157-167 (2019).
  15. Washington, C. W., Zipfel, G. J. Participants in the International Multi-disciplinary Consensus Conference on the Critical Care Management of Subarachnoid, H. Detection and monitoring of vasospasm and delayed cerebral ischemia: a review and assessment of the literature. NeuroCritical Care. 15 (2), 312-317 (2011).
  16. Greke, C., et al. Image-guided transcranial Doppler sonography for monitoring of defined segments of intracranial arteries. Journal of Neurosurgical Anesthesiology. 25 (1), 55-61 (2013).
  17. Neulen, A., Prokesch, E., Stein, M., Konig, J., Giese, A. Image-guided transcranial Doppler sonography for monitoring of vasospasm after subarachnoid hemorrhage. Clinical Neurology and Neurosurgery. 145, 14-18 (2016).
  18. Neulen, A., et al. Image-Guided Transcranial Doppler Ultrasound for Monitoring Posthemorrhagic Vasospasms of Infratentorial Arteries: A Feasibility Study. World Neurosurgery. 134, 284-291 (2020).
  19. Neulen, A., et al. Correlation of cardiac function and cerebral perfusion in a murine model of subarachnoid hemorrhage. Scientific Reports. 11 (1), 3317(2021).
  20. Neulen, A., et al. A segmentation-based volumetric approach to localize and quantify cerebral vasospasm based on tomographic imaging data. PLoS One. 12 (2), 0172010(2017).
  21. Marbacher, S., et al. Systematic Review of In Vivo Animal Models of Subarachnoid Hemorrhage: Species, Standard Parameters, and Outcomes. Translational Stroke Research. , (2018).
  22. Figueiredo, G., et al. Comparison of digital subtraction angiography, micro-computed tomography angiography and magnetic resonance angiography in the assessment of the cerebrovascular system in live mice. Clinical Neuroradiology. 22 (1), 21-28 (2012).
  23. Lindegaard, K. F., Nornes, H., Bakke, S. J., Sorteberg, W., Nakstad, P. Cerebral vasospasm diagnosis by means of angiography and blood velocity measurements. Acta Neurochirurgica. 100 (1-2), 12-24 (1989).
  24. Cassia, G. S., Faingold, R., Bernard, C., Sant'Anna, G. M. Neonatal hypoxic-ischemic injury: sonography and dynamic color Doppler sonography perfusion of the brain and abdomen with pathologic correlation. American Journal of Roentgenology. 199 (6), 743-752 (2012).
  25. Shen, Q., Stuart, J., Venkatesh, B., Wallace, J., Lipman, J. Inter observer variability of the transcranial Doppler ultrasound technique: impact of lack of practice on the accuracy of measurement. Journal of Clinical Monitoring and Computing. 15 (3-4), 179-184 (1999).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

in vivo
Анализ церебрального спазма сосудов в мышиной модели субарахноидального кровоизлияния с помощью высокочастотного транскраниального дуплексного ультразвука
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.