Этот протокол описывает способ генерации больших объемов инкапсулированных липидами микропузырьков декафторбутана с использованием ультразвуковой обработки зондовым наконечником и последующей конденсации их в нанокапли с фазовым сдвигом с использованием экструзии высокого давления и механической фильтрации.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Производство мембранно-фильтрованных фазовых декафторбутановых нанокафторбутановых из предварительно сформированных микропузырьков
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Существует множество методов, которые могут быть использованы для производства испаряемых капель фазового сдвига для визуализации и терапии. Каждый метод использует различные методы и различается по цене, материалам и назначению. Многие из этих методов изготовления приводят к полидисперсным популяциям с неоднородными порогами активации. Кроме того, контроль размеров капель обычно требует стабильных перфторуглеродных жидкостей с высокими порогами активации, которые не являются практичными in vivo. Получение однородных размеров капель с использованием газов с низкой температурой кипения было бы полезно для экспериментов по визуализации in vivo и терапии. В данной статье описан простой и экономичный способ формирования калиброванных по размеру липид-стабилизированных фазово-сдвиговых нанокаплей с низкой температурой кипения декафторбутана (DFB). Описан распространенный способ генерации липидных микропузырьков, в дополнение к новому методу их конденсации с экструзией под высоким давлением за один этап. Этот метод предназначен для экономии времени, максимизации эффективности и создания больших объемов микропузырьковых и нанокаплетных растворов для широкого спектра применений с использованием общего лабораторного оборудования, найденного во многих биологических лабораториях.
Введение
Ультразвуковые контрастные вещества (UCA) быстро растут в популярности для визуализации и терапии. Микропузырьки, оригинальные UCA, в настоящее время являются основными агентами, используемыми в клинических диагностических приложениях. Микропузырьки представляют собой газонаполненные сферы, обычно диаметром 1-10 мкм, окруженные липидными, белковыми или полимерными оболочками1. Однако их размер и стабильность in vivo могут ограничивать их функциональность во многих приложениях. Нанокапли с фазовым сдвигом, которые содержат перегретое жидкое ядро, могут преодолеть некоторые из этих ограничений из-за их меньшего размера и улучшенного срока службы ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Изготовление липидных пленок
- Подготовьте липидные пленки для генерации микропузырьков с использованием 90% DSPC и 10% DSPE-PEG2K путем смешивания липидов в правильном соотношении с использованием следующих направлений:
- Изготавливайте стандартные липиды DSPC и DSPE-PEG2K в хлороформе. Взвесьте 50 мг каждого липидного порошка в отдельных флаконах. Добавьте 1 мл хлороформа в каждый флакон, используя стеклянный шприц объемом 1 мл.
- Добавьте 287 мкл запаса DSPC и 113 мкл запаса DSPE-PEG2K (оба 50 мг/мл) в сцинтилляционный флакон объемом 20 мл с помощью стеклянного шприца.
- Высушите смешанные липиды для удаления хлороформа с использо....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Репрезентативные результаты распределения по размерам включены с использованием динамического рассеяния света (DLS) и перестраиваемого резистивного импульсного зондирования (TRSP). На рисунке 5 показано распределение по размерам конденсированных пузырьковых растворов с экструзией и без нее. Без экструзии протокол заканчивается на шаге 5.3. Охлажденные пузырьки конденсируются путем выпуска образца под атмосферное давление в холодном состоянии. Конденсированный только образец имеет гораздо бол.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Доступен обширный объем литературы, в которой обсуждается формулировка, физика и потенциальное применение микропузырьков и капель фазового сдвига для визуализации in vivo и терапии. Это обсуждение явно относится к генерации липидных микропузырьков и превращению их в субмикронные капли фазового сдвига с использованием газа DFB с низкой температурой кипения и экструзии под высоким давлением. Способ, описанный здесь, предназначен для обеспечения относительно простого способа получения большого количества липидных микропузыр.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить Доминика Джеймса из лаборатории доктора Кена Хойта за предоставление TRSP-анализа испаряемых нанокапель с фазовым сдвигом.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Центрифужные пробирки 15 мл | Falcon | 352095 | Сбор и центрифугирование капель |
| 200 нм Фильтр из поликарбоната | Whatman | 110606 | Фильтры экструдера |
| 2-метилбутан | Fisher Chemical | 03551-4 | Быстрое предварительное охлаждение раствора микропузырьков перед экструзией |
| 3-контактные зажимы X2 | Fisher | 02-217-002 | Удержание сцинтилационных флаконов на месте для ультразвуковой обработки зонда |
| 400 Вт Аналоговый ультразвуковой аппарат зонда с рогом | Branson | 101-063-198R | Используется для генерации липидных микропузырьков из липидного раствора |
| Bath Sonicator | Fisher Scientific | 15337402 | Используется для расщепления липосом на униламеллярные везикулы |
| Хлороформ | Fisher Bioreagents | C298-4 | Используется для изготовления липидной пленки для подготовки |
| микропузырьковДекафторбутан (перфторбутан) газообразный | FluoroMed L.P. | 1 кг | генерации микропузырьков с помощью ультразвуковой обработки наконечника |
| Сухой лед | - | -Быстрое | предварительное охлаждение раствора микропузырьков перед экструзией |
| DSPC Липидный порошок | NOF America | COATSOME MC-8080 | Компонент липидной пленки |
| DSPE-PEG-2K Липидный порошок | NOF America | SUNBRIGHT DSPE-020CN | Компонент липидной пленки |
| Общий термометр | - | - | Используется для измерения температуры ледяной бани и температуры 2-метилбутана (необходимо учитывать температуру -20С) |
| Стеклянные шприцы | Hamilton | 81139 | Используются для смешивания липидов в хлороформе |
| Глицерин | Биореагенты Фишера | BP229-1 | Снижает температуру замерзания раствора PBS |
| Нагревательный блок | VWR Научные продукты | Нагревание липидных пленок и испаряющихся капель | |
| Lipex 10 mL Экструдер | Evonik | Коммерческая экструзионная система высокого давления | |
| Мини вихревой смеситель | Fisher марки | 14-955-151 | Используется для удаления избытка хлороформа из липидных пленок |
| Азотный бак | - | Используется для работы экструдера | |
| Фосфатный буфер Солевой раствор | Fisher Scientific | Hydrate липидные пленки и промывные капли | |
| Полиэфирный дренажный диск | Whatman | 230600 | Обеспечивает поддержку поликарбонатного фильтра |
| Полипропиленовые колпачки | Fisher Scientific | 298417 | Используется для хранения раствора |
| Пропиленгликоль | Fisher Chemical | P355-1 | Снижает температуру замерзания раствора PBS |
| Сцинтилирующие флаконы | DWK Life Sciences Wheaton | 986532 | Используется для образования липидных пленок и микропузырьков |
| Малый молоток | - | - | используется для разрушения сухого льда для охлаждения метилбутана |
| Sonicator Microtip Attachment | Branson 101148070 | Используется для генерации микропузырьков из липидного раствора | |
| Стальной контейнер | Medegen | 79310 | Быстрое предварительное охлаждение раствора микропузырьков перед экструзией (подойдет любой контейнер с номиналом -20C) |
| Вакуумный дессикатор | Bel-Art SP Scienceware | 08-648-100 | Удаляет излишки хлороформа из липидных пленок |
| 2 мл Центрифуга Пробирка | Fisher | 02682004 | Используется для концентрации нанокапель |
Ссылки
- Sirsi, S., Borden, M. Microbubble compositions, properties and biomedical applications. Bubble Science Engineering and Technology. 1 (1-2), 3-17 (2009).
- Sheeran, P. S., Dayton, P. A. Phase-change contrast agents for imaging and therapy. Current ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
