Методическая статья

Двойная маркировка иммунофлуоресценции с использованием антител одного и того же вида для изучения взаимодействий хозяина и патогена

DOI:

10.3791/62219

⸱

10 июля 2021 г.

 ,  , 
1Laboratory of Cell and Molecular Biology of Trypanosomatids, Department of Cellular and Molecular Biology and Pathogenic Bioagents, Ribeirao Preto Medical School, University of Sao Paulo, Ribeirao Preto, SP, Brazil

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь протокол описывает, как выполнить двойную маркировку иммунофлуоресценции с использованием первичных антител, выращенных у одного и того же вида, для изучения взаимодействий хозяина и патогена. Кроме того, он может включать третье антитело от другого хозяина в этот протокол. Такой подход может быть выполнен в любом типе клеток и патогенов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящее время можно найти широкий спектр молекулярных инструментов, доступных для изучения взаимодействия паразитов и клеток-хозяев. Однако существуют некоторые ограничения для получения коммерческих моноклональных или поликлональных антител, которые распознают специфические клеточные структуры и белки у паразитов. Кроме того, существует мало коммерческих антител, доступных для маркировки трипаносоматидов. Обычно поликлональные антитела против паразитов готовятся собственными силами и могут быть более сложными для использования в сочетании с другими антителами, продуцируемыми у того же вида. Здесь протокол демонстрирует, как использовать поликлональные и моноклональные антитела, выращенные у одного и того же вида, для выполнения двойной маркировки иммунофлуоресценции для изучения взаимодействия клеток хозяина и патогенов. Для достижения двойной маркировки иммунофлуоресценции крайне важно инкубировать сначала поликлональное антитело мыши, а затем следовать за инкубацией с вторичным мышиным антителом IgG, конъюгированным с любым фторхромом. После этого необходим дополнительный блокирующий этап, чтобы предотвратить распознавание любого следа первичного антитела следующим вторичным антителом. Затем к образцу добавляют моноклональное антитело мыши и его специфическое вторичное антитело подкласса IgG, конъюгированное с другим фторхромом. Кроме того, можно выполнить тройную маркировку иммунофлуоресценции с использованием третьего антитела, выращенного у другого вида. Кроме того, такие структуры, как ядра и актин, могут быть окрашены впоследствии их специфическими соединениями или метками. Таким образом, представленные здесь подходы могут быть скорректированы для любой клетки, источники первичных антител которой ограничены.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изучение взаимодействия патогена с клеткой-хозяином на клеточном уровне предоставляет важную информацию об основных причинах заболевания, поскольку различные группы, такие как вирусы, бактерии и простейшие, могут заражать большинство типов клеток-хозяев 1,2,3,4. Это также может помочь разработать и идентифицировать потенциальные терапевтические цели, которые могут замедлить или ингибировать рост патогена. В живых условиях вырабатываемые антитела отвечают за распознавание самокомпонентов, антигенов из вирусов, бактериальных компонентов или продуктов, грибков, паразитов и др.5.

Для этой цели антитела широко используются инструментами, в основном для понимания расположения и функции клеточных структур и белков. Несколько исследований с использованием множественной маркировки антител показывают, что дополнительные блокирующие этапы способствуют специфичности иммунолокализации. Кроме того, в большинстве описанных протоколов используются специфические коммерческие моноклональные антитела, включая антитела от одного и того же вида хозяина6,7,8,9,10,11,12,13,14.

Обычно двойная маркировка иммунофлуоресценции использует два антитела, выращенных у разных видов, чтобы окрашивать интересующие клеточные структуры или патогены и клетки-хозяева, чтобы увидеть взаимодействие между ними. Однако это может быть проблемой, когда коммерческие моноклональные или поликлональные антитела, специфичные для некоторых патогенов, недоступны для выполнения двойной маркировки. Кроме того, существуют коммерчески доступные наборы конъюгации антител, и можно конъюгировать первичные антитела непосредственно к флуорофору с помощью реакции сукцинимидилового эфира15. Проблема в том, что эти наборы часто дорогие, и необходимо иметь достаточно антител, чтобы маркировать их. Зная это, мы успешно разработали метод двойной иммунофлуоресценции с использованием двух разных антител, выращенных у одного и того же вида, для изучения локализации белка в Trypanosoma brucei16. Однако для внутриклеточных паразитов, включая Trypanosoma cruzi, такой подход не был продемонстрирован. Здесь мы покажем, как выполнить двойную маркировку иммунофлуоресценции для изучения внутриклеточных паразитов T. cruzi и клетки-хозяина с использованием первичных антител, выращенных у одного и того же вида без перекрестных реакций. Кроме этого метода установлена тройная иммунофлуоресцентная маркировка с добавлением третьего антитела от другого вида. Эти подходы помогают, когда источник антител ограничен и может быть использован в любом типе клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Культуры клеток и паразитов

  1. Выращивайте клетки LLC-MK2 (Rhesus Monkey Kidney Epithelial) из Американской коллекции культур типа (CCL-7) в колбе для клеточной культуры объемом 25 см2, содержащейся в среде RPMI, дополненной 10% термоинактивированным FBS (фетальная бычья сыворотка) и антибиотиками (100 ЕД / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина) при 37 ° C в 5% CO2 17.
  2. Инфицировать клетки LLC-MK2 Trypanosoma cruzi (штамм Y) в соответствии с предыдущим протоколом 18.
  3. Соберите супернатант инфицированных LLC-MK2 клеток (5 мл) в 15 мл клеточной культуры конической центрифужной трубки и центрифугу при 500 х г в течение 10 минут и 22 °C для снижения клеточного мусора. Держите трубку в течение 10 минут при температуре 37 °C, чтобы трипомастиготы доплыли до надосадочного вещества.
  4. Соберите супернатант в новую коническую трубку и центрифугу при 2500 х г в течение 15 минут при 22 °C. Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулу, содержащую паразитов, в полной среде RPMI, чтобы определить плотность клеток путем подсчета клеток в камере Нойбауэра.

2. Контрольный протокол иммунофлуоресценции

ПРИМЕЧАНИЕ: После фиксации можно хранить пластины, содержащие крышки при 4 °C в 1x PBS (pH 7,2) в течение одной недели. Для хранения важно, чтобы клетки не прошли стадию пермеабилизации.

  1. Размещать ячейки ООО-МК2 (2 х 104) в 24 пластинах скважины, содержащих УФ-стерилизованные округлые покровы, в средах RPMI в течение 16 часов.
  2. Для инфицированных клеток добавьте супернатант, содержащий T. cruzi (пункт 1.4), к каждой лунке в пропорции (MOI 10: 1) и оставьте на 6 ч инфекции. Промыть крышки, содержащие инфицированные и неинфицированные клетки, пять раз раствором PBS и зафиксировать 2% параформальдегидом в 1x PBS (pH 7,2) в течение 10 мин при комнатной температуре (RT).
  3. Промывайте крышки три раза в течение 5 минут каждый с 1 pBS (pH 7,2).
  4. Пермеабилизируйте обшивки 0,2% IGEPAL CA-630 в 1x PBS (PH 7.2) в течение 10 мин при RT.
  5. Вымойте крышки три раза в течение 5 минут каждый с 1x PBS.
  6. Инкубировать крышки в течение 30 мин на RT блокирующим раствором (2% BSA в 1x PBS, рН 7,2).
  7. Инкубировать покровы в течение 30 мин на RT либо с мышиными моноклональными анти-hnRNPA1 (разведение 1:200), либо с мышиными поликлональными анти-TcFAZ (разведение 1:100) антителами, разведенными в блокирующем растворе.
  8. Вымойте крышки три раза в течение 5 минут каждый с 1x PBS.
  9. Инкубируют покровы в течение 30 мин при RT с козьим антимышевым IgG F (ab')2 (H+L), конъюгированным с Alexa Fluor 488 (1:600) вместе с фаллоидином, конъюгированным с Alexa 594 (1:300) для окрашивания актиновых нитей (F-актина) в клетке-хозяине, разведенной в блокирующем растворе.
  10. Промыть три раза с 1x PBS (pH 7,2) в течение 5 минут каждый.
  11. Нанесите небольшое количество антизатухающего монтажного реагента ProLong Gold со средой DAPI на поверхность слайда.
  12. С помощью щипцов осторожно наклоните крышку в монтажной среде, чтобы предотвратить образование пузырьков. После высыхания при желании запечатайте крышку.

3. Протокол двойной маркировки иммунофлуоресценции с использованием моноклональных и поликлональных антител, выращенных у одного и того же хозяина

  1. Повторите шаги с 2.1 по 2.6, описанные выше.
  2. Инкубировать покровные листы, содержащие инфицированные и неинфицированные клетки, с собственным мышиным поликлональным анти-TcFAZ антителом (1:100), разбавленным в блокирующем растворе в течение 30 мин при РТ.
  3. Вымойте крышки три раза в течение 5 минут каждый с 1x PBS.
  4. Инкубировать крышки в течение 30 мин при RT с козьим антимышевым IgG F (ab')2 (H+L), конъюгированным с Alexa Fluor 647 (1:600), разведенным в блокирующем растворе.
  5. Вымойте крышки три раза в течение 5 минут каждый с 1x PBS.
  6. Выполните второй блокирующий этап с помощью антимышечного антимышечного препарата AffiniPure (H+L), разбавленного (0,12 мг/мл) в блокирующем растворе в течение 30 мин при РТ.
  7. Трижды вымойте крышки с 1 pBS (pH 7,2) в течение 5 минут каждая. Затем инкубируют с мышиным моноклональным анти-hnRNP A1 IgG2b антителом (1:200) в течение 30 мин при RT.
  8. Вымойте крышки три раза в течение 5 минут каждый с 1x PBS.
  9. Инкубируют покровы в течение 30 мин с козьим антимышиным антителом IgG2b, конъюгированным с Alexa Fluor 488 (1:600) и с фаллоидином, конъюгированным с Alexa 594 (1:300), разбавленным в блокирующем растворе.
  10. Вымойте крышки три раза в течение 5 минут каждый с 1x PBS.
  11. Повторите шаги с 2.8 по 2.10, описанные выше.

4. Протокол тройной маркировки иммунофлуоресценции с добавлением третьего поликлонального антитела от разных видов хозяев

ПРИМЕЧАНИЕ: Для дополнительной маркировки обратите внимание на подклассы IgG, изотипы антител и следуйте порядку антител: 1. мышиный поликлональный, 2. кроличий поликлональный, 3. второй блок и 4. мышиный моноклональный. Рассмотрим тип лазеров, доступных в конфокальном микроскопе, чтобы выбрать правильное флуорофорно-конъюгированное вторичное антитело.

  1. Повторите шаги с 2.1 по 2.6, описанные выше.
  2. После шагов с 3,2 по 3,5 (этап промывки) начинают новую инкубацию с кроличьим поликлональным антителом в блокирующем растворе в течение 30 минут при РТ.
  3. Вымойте крышки три раза с 1 pBS (pH 7,2) в течение 5 минут каждый.
  4. Инкубируют покровы с козьим анти-кроликовым антителом IgG, конъюгированным с Alexa 647 (1:600) в блокирующем растворе в течение 30 минут.
  5. Вымойте крышки три раза в течение 5 минут каждый с 1x PBS.
  6. Выполните блокирующий этап с помощью антимышечного антимышечного препарата AffiniPure (H+L), разбавленного (0,12 мг/мл) в блокирующем растворе в течение 30 мин при РТ.
  7. Промыть крышки три раза с 1x PBS (рН 7,2) в течение 5 минут каждый и инкубировать с любым мышиным моноклональным антителом подкласса IgG, разведенным в блокирующем растворе в течение 30 минут.
  8. Вымойте крышки три раза в течение 5 минут каждый с 1x PBS.
  9. Инкубируйте крышки в течение 30 минут со специфической парой антимышьих антител против мыши IgG, конъюгированных с Alexa 594 (1:600) в блокирующем растворе в течение 30 минут.
  10. Вымойте крышки три раза в течение 5 минут каждый с 1x PBS.

5. Получение конфокальных изображений

  1. Проанализируйте образцы иммунофлуоресценции с помощью конфокального микроскопа с масляным погружным объективом 63X и обнаружите флуоресценцию с помощью фотоумножителя (PMT) и гибридного детектора (HyD).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали установку из Многопользовательской лаборатории конфокальной микроскопии - LMMC, Медицинская школа Рибейрао Прету, Университет Сан-Паулу.
  2. Получайте все конфокальные изображения с помощью отдельных каналов. Выполняйте обработку изображений с помощью Adobe Photoshop.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы покажем, как изучать взаимодействия хозяин-паразит путем иммунофлуоресценции, когда источник антител ограничен из-за отсутствия коммерческих антител, которые распознают специфические структуры и белки в трипаносоматидах.

Среди трипаносоматидов T. cruzi имеет один из самых сложных жизненных циклов, включающих различные стадии развития между позвоночными и беспозвоночными хозяевами 19. Во время жизненного цикла T. cruzi, на ранней стадии инфекци...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол для выполнения двойной иммуномаркировки инфицированных Trypanosoma cruzi клеток с использованием двух разных антител от одного и того же вида-хозяина. Чтобы изучить более подробно последствия инфекции, структуры в клетке-хозяине, такие как ядро или цитозольные органеллы, могут быть помечены с использованием этого протокола. Также его можно использовать в методе маркировки тонкого сечения иммунозолотого. Такой подход помогает преодолеть препятствие, связанное с небольшим количеством...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих или финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Фондом Ампаро в Пескизе сан-Паулу (FAPESP 2010/19547-1; 2018/03677-5) для MMAB, Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência- FAEPA для MMAB и Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior- Brasil (CAPES) - финансовый код 001. CG-C получил магистерскую и докторскую стипендию от CAPES, а LAMT-S получил докторскую стипендию от CNPq. Мы благодарим Элизабет Р. Милани за помощь в конфокальной микроскопии и доктора Дарио Замбони за предоставление клеток LLC-MK2 (Медицинская школа Рибейрао Прету, USP).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Alexa Fluor 488 - антитело IgG2bLife technologies, СШАA21141Козье антитело против мыши
AffiniPure Rabbit против мыши IgG (H+L)Jackson Immunoresearch, США315-005-003Антитело против мыши
Alexa Fluor 488 - антитело IgG F (ab')2 (H+L)Life technologies, СШАA11017Козье антитело
Alexa Fluor 594 IgG1 антителоLife technologies, СШАA21125Козье антитело против мыши
Alexa Fluor 647 - IgG F (ab')2 (H+L)антитело Life technologies, СШАA21237Козье антитело против мыши
Anti-hnRNPA1 IgG2bSigma-Aldrich, СШАR4528Мышиное антитело
против TcFAZ (белок T. cruzi FAZ) антителоНаша лабораторияСобственноемышиное антитело
Бычий сывороточный альбумин (BSA)Sigma-Aldrich, СШАA2153-10GПротеин Альбумин
Моющее средство Igepal CA-630Sigma-Aldrich, СШАI3021Неионогенное моющее средство
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Gibco, Thermo fisher scientific, США12657-029Сыворотка
пенициллин стрептомицинGibco, Thermo fisher scientific, США15140-122Антибиотик
фаллоидин Alexa Fluor 594Life technologies, СШАA12381Актиновый маркер
ProLong Gold antifade с технологиями DAPILife, СШАP36935Реагент для монтажных сред
RPMI 1640 1X с L-глутаминомCorning, США10-040-CVСреды для клеточных культур
Раствор трипсин-ЭДТА Sigma-Aldrich, СШАT4049-100MLБиореагент

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lloyd, R. E. Nuclear proteins hijacked by mammalian cytoplasmic plus strand RNA viruses. Virology. 479-480, 457-474 (2015).
  2. Casadevall, A., Pirofski, L. A. Host-pathogen interactions: basic concepts of microbial commensalism, colonization, infection, and disease. Infection and Immunity. 68 (12), 6511-6518 (2000).
  3. Sidik, S. M., Salsman, J., Dellaire, G., Rohde, J. R. Shigella infection interferes with SUMOylation and increases PML-NB number. PLoS One. 10 (4), 0122585(2015).
  4. Robert McMaster, W., Morrison, C. J., Kobor, M. S. Epigenetics: A New Model for Intracellular Parasite-Host Cell Regulation. Trends in Parasitology. 32 (7), 515-521 (2016).
  5. Casali, P., Schettino, E. W. Structure and function of natural antibodies. Current Topics in Microbiology and Immunology. 210, 167-179 (1996).
  6. Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohisto-chemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), e52551(2015).
  7. Tóth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multi-ple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545(2007).
  8. Ma, B., Winkelbach, S., Lindenmaier, W., Dittmar, K. E. Six-colour fluorescent imaging of lymphoid tissue based on colour addition theory. Acta Histochemica. 108 (4), 243(2006).
  9. Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting. Acta Histochemica. 107 (2), 143(2005).
  10. Nakamura, A., Uchihara, T. Dual enhancement of triple immunofluorescence using two antibodies from the same species. Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 67(2004).
  11. McCormick, J., Lim, I., Nichols, R. Neuropeptide precursor pro-cessing detected by triple immunolabeling. Cell and Tissue Research. 297 (2), 197(1999).
  12. Shindler, K. S., Roth, K. A. Double immunofluorescent staining using two unconjugated primary antisera raised in the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44 (11), 1331(1996).
  13. Wang, B. L., Larsson, L. I. Simultaneous demonstration of multiple anti-gens by indirect immunofluorescence or immunogold staining. Novel light and electron microscopical double and triple staining method employing primary antibodies from the same species. Histochemistry. 83 (1), 47(1985).
  14. Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).
  15. Pranchevicius, M. C., et al. Myosin Va phosphorylated on Ser1650 is found in nuclear speckles and redistributes to nucleoli upon inhibition of transcription. Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 441-456 (2008).
  16. Moreira, B. P., de Castro, C. G., Prado, L. C. dS., da Fonseca, C. K., Baqui, M. M. A. Use of antibodies from the same host species in double labeling immunofluorescence on trypanosome cytoskeleton. Microscopy and Imaging Science: Practical Approaches to Applied Research and Education. Méndez-Vilas, A. 7, 374-378 (2016).
  17. Hull, R. N., Cherry, W. R., Tritch, O. J. Growth characteristics of monkey kidney cell strains LLC-MK1, LLC-MK2, and LLC-MK2 (NCTC-3196) and their utility in virus research. Journal of Experimental Medicine. 115, 903-918 (1962).
  18. Stecconi-Silva, R. B., Andreoli, W. K., Mortara, R. A. Parameters affecting cellular invasion and escape from the parasitophorous vacuole by different infective forms of Trypanosoma cruzi. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 98 (7), 953-958 (2003).
  19. de Souza, W., de Carvalho, T. M., Barrias, E. S. Review on Trypanosoma cruzi: Host Cell Interaction. International Journal of Cell Biology. 2010, 295394(2010).
  20. Burleigh, B. A., Woolsey, A. M. Cell signalling and Trypanosoma cruzi invasion. Cellular Microbiology. 4 (11), 701-711 (2002).
  21. Baqui, M. M. A., Takata, C. S., Milder, R. V., Pudles, J. A giant protein associated with the anterior pole of a trypanosomatid cell body skeleton. European Journal of Cell Biology. 70, 243-249 (1996).
  22. Baqui, M. M., Milder, R., Mortara, R. A., Pudles, J. In vivo and in vitro phosphorylation and subcellular localization of trypanosomatid cytoskeletal giant proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 47 (1), 25-37 (2000).
  23. Baqui, M. M., De Moraes, N., Milder, R. V., Pudles, J. A giant phosphoprotein localized at the spongiome region of Crithidia luciliae thermophila. Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (6), 532-537 (2000).
  24. Jean-Philippe, J., Paz, S., Caputi, M. hnRNP A1: the Swiss army knife of gene expression. International Journal of Molecular Sciences. 14 (9), 18999-19024 (2013).
  25. Vidarsson, G., Dekkers, G., Rispens, T. IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions. Frontiers in Immunology. 5, 520(2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Trypanosoma cruziDAPI

Похожие статьи