Методическая статья

Крупномасштабное получение мезенхимальных экзосом, полученных из мезенхимальных стволовых клеток синовиальной жидкости, с помощью 3D-культуры биореактора

DOI:

10.3791/62221

⸱

26 июля 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, The First affiliated hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital, 2Guangdong Provincial Research Center for Artificial Intelligence and Digital Orthopedic Technology, Shenzhen Second People's Hospital, 3Department of Child and Adolescent Psychiatry, Shenzhen Kangning Hospital, Shenzhen Mental Health Center, Shenzhen Key Laboratory for Psychological Healthcare & Shenzhen Institute of Mental Health

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол для получения большого количества экзосом GMP-класса из мезенхимальных стволовых клеток синовиальной жидкости с использованием 3D-биореактора.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экзосомы, секретируемые мезенхимальными стволовыми клетками (МСК), были предложены в качестве перспективных кандидатов для травм хряща и лечения остеоартрита. Экзосомы для клинического применения требуют крупномасштабного производства. С этой целью МСК синовиальной жидкости человека (hSF-МСК) выращивали на бусинах микроносителей, а затем культивировали в динамической трехмерной (3D) системе культивирования. Используя 3D-динамическую культуру, этот протокол успешно получил крупномасштабные экзосомы из супернатантов культуры SF-MSC. Экзосомы были собраны методом ультрацентрифугирования и проверены просвечивающим электронным микроскопом, анализом передачи наночастиц и западным блоттингом. Также выявлена микробиологическая безопасность экзосом. Результаты обнаружения экзосом свидетельствуют о том, что этот подход может привести к образованию большого количества экзосом надлежащей производственной практики (GMP). Эти экзосомы могут быть использованы в исследованиях биологии экзосом и клинического лечения остеоартрита.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Остеоартрит (ОА), возникающий в результате разрушения суставного хряща и лежащей в его основе кости, остается серьезной проблемой, приводящей к инвалидности 1,2. Без крово- и нервного снабжения способность хряща к самовосстановлению минимальна после травмирования 3,4. В последние десятилетия методы лечения, основанные на аутологичной имплантации хондроцитов (ACI), достигли некоторого прогресса в лечении ОА5. Для выделения и расширения хондроцитов необходим сбор небольшого хряща из ненесущей области сустава ОА, что приводит к травмам хряща. Также процедура потребует повторной операции по имплантации расширенных хондроцитов6. Таким образом, одноэтапная терапия для лечения ОА без повреждений хряща находится в стадии обширного изучения.

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) были предложены в качестве перспективных альтернатив для лечения ОА 7,8. Происходящие из нескольких тканей, МСК могут дифференцироваться в хондроциты со специфической стимуляцией. Важно отметить, что МСК могут модулировать иммунные реакции с помощью противовоспалительногосредства 9. Таким образом, МСК обладают значительными преимуществами в лечении ОА, восстанавливая дефекты хряща и модулируя иммунный ответ, особенно в среде воспаления. Для лечения ОА МСК из синовиальной жидкости (SF-МСК) в последнее время привлекли большое внимание из-за их более сильной способности дифференцировки хондроцитов, чем другие источники МСК10,11. Примечательно, что в ортопедической клинике удаление воспалительной СФ из полости сустава является рутинной терапией для облегчения болевого симптома пациентов с ОА. Экстрагированная воспалительная НФ обычно утилизируется как медицинские отходы. Как пациенты, так и врачи готовы рассматривать аутологичные МСК, выделенные из воспалительной СФ, как лечение ОА с очень небольшим количеством этических конфликтов. Тем не менее, терапия SF-MSC скомпрометирована из-за опухолевых рисков, длительного хранения и отдаленных барьеров транспортировки.

Экзосомы, секретируемые многими типами клеток, включая МСК, несут большую часть биоинформации родительских клеток. Он был подробно исследован как бесклеточная терапия12,13. Согласно обновленным ресурсам, доступным на веб-сайте правительства по клиническим испытаниям (ClinicalTrials.gov), начинаются и проводятся более обширные клинические исследования экзосом в областях исследований рака, гипертонии и нейродегенеративных заболеваний. Лечение экзосом SF-MSC может быть захватывающим и сложным испытанием, чтобы справиться с ОА. Надлежащая производственная практика (GMP) и крупномасштабное производство экзосом имеют важное значение для клинического перевода. Мелкомасштабная изоляция экзосом была широко выполнена на основе двумерной (2D) клеточной культуры. Однако крупномасштабные стратегии производства экзосом нуждаются в оптимизации. В этом исследовании был разработан крупномасштабный метод производства экзосом, основанный на массивной культуре SF-MSC в условиях, свободных от ксено. После ультрацентрифугирования из супернатантов клеточной культуры была подтверждена безопасность и функция экзосом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было одобрено Комитетом по этике человека Второй народной больницы Шэньчжэня. Принципиальная схема экзосом, выделенных из протокола hSF-MSC in vitro , показана на рисунке 1.

1. Культура и идентификация человека SF-MSC

  1. Соберите 20 мл SF с помощью шприца и иглы у клинических пациентов с ОА.
    1. Продезинфицируйте коленный сустав пациента с ОА. Пункция из сухожилия четырехглавой мышцы femoris вне надколенника в суставную полость с помощью иглы 7#.
    2. Экстракт 10 мл суставной жидкости. Накройте место прокола трансфузионной палочкой и надавите в течение 5 мин.
  2. Выбрасывайте супернатант SF после центрифугирования при 1 500 х г в течение 10 мин при 4 °C.
  3. Повторно суспендировать ячейку гранулы 10 мл 1x фосфатного буферного физиологического раствора (PBS), центрифугу при 1,500 x g в течение 10 мин при 4 °C и выбросить PBS.
  4. Повторно суспендируют гранулу 10 мл питательной среды MSC человека при плотности клеток 5 х 104 клеток/мл (см. Таблицу материалов), а затем нанесите суспензию в тарелку диаметром 100 мм.
  5. Инкубировать блюдо при 37 °C в атмосфере, содержащей 5% CO2.
  6. Через 48 ч удалите неадгезивные клетки, изменив среду, и промыть 1x PBS. Заменяйте среду каждые 3 дня в течение 2 недель.
  7. Соберите супернатанты клеточной культуры.
  8. Идентификация SF-MSC с помощью проточной цитометрии.
    1. Переваривайте третье поколение (P3) SF-МСК, центрифугу при 1000 х г в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте супернатант и соберите гранулу ячейки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пассаж распознается как субкультура клеток к другому культуральному блюду. Первичные клетки, выделенные из SF и посеянные на посуде, помечены как нулевой пассаж (P0). При слиянии примерно на 75% клетки перевариваются и отделяются от блюд, высеваются на другие блюда и маркируются как P1.
    2. Добавьте 400 мкл блокирующего буфера (1% BSA в 1x PBS) в гранулу ячейки (5 x 104) и дайте ей постоять в течение 15 минут при комнатной температуре (RT).
    3. Центрифугу при 1000 х г в течение 5 мин при 4 °C, выбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулу в 100 мкл 1x PBS.
    4. Добавьте 1 мкл моноклонального флуоресцентного антитела CD105, CD73, CD90, CD45, CD34, HLA-DR (коэффициент разведения 1:100) (см. Таблицу материалов) и инкубируйте на RT в течение 30 мин.
    5. Дважды вымойте 1x PBS и выбросьте супернатант. Соберите гранулу ячейки и повторно суспендируйте в 100 мкл 1x PBS.
    6. Обнаружение на проточном цитометре до 10 000 клеток с помощью фильтров 525/50 и 585/40 для обнаружения флуорофоров.

2.3D культура клеток биореактора

  1. Подготовка микронесущих
    1. Набухают сухими 0,75 г микроносителей (см. Таблицу материалов) и увлажняют в 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (50 мл/г микроносителей) в течение не менее 3 ч при RT.
    2. Декантируйте супернатант и мойте микроносители в течение 5 мин в свежем DPBS (50 мл/г микроносителей). Выбросьте PBS и замените его свежим 1x DPBS (50 мл / г микроносителей).
    3. Стерилизуйте микроносители автоклавированием (121 °C, 15 мин, 15 фунтов на кв. дюйм). Дайте стерилизованным микроносителям осесть, декантируйте супернатант.
    4. Кратко смойте микроносители в питательной среде (50 мл/г микроносителей) на RT. Дайте микроносителям осесть, выбросьте супернатант.
  2. Перфузионный биореактор
    1. Стерилизуют биореактор автоклавированием (121 °C, 15 мин, 15 psi).
    2. Подсчитайте количество SF-МСК и выделите 2,5 х 107 SF-МСК и микроносителей в биореактор, перфузированный питательной средой MSC класса GMP (250 мл).
    3. Поместите биореактор в инкубатор с 5% CO2 при 37 °C. Вращайте биореактор со скоростью 15 об/мин. Меняйте культуральную среду каждые 6 дней.
    4. Собирают в культуре клеток супернатанты и микроносители для дальнейшего анализа после культивирования в течение 14 дней.

3. Идентификация экзосом и обнаружение безопасности

  1. Ультрацентрифугирование
    1. Центрифугируют супернатант клеточной культуры при 300 х г в течение 10 мин при 4°С и собирают супернатант; выбросьте клеточный мусор.
    2. Центрифугировать супернатанты при 2 000 х г в течение 10 мин при 4 °C и собирать супернатант; отбросить более крупные везикулы (апоптотические тела и некоторые более крупные микровезикулы).
    3. Центрифугировать супернатант снова при 10 000 х г в течение 30 мин при 4 °C для удаления более крупных везикул; собрать гранулы и повторно суспендировать в 40 мл 1x PBS.
    4. Центрифугируют повторно суспендированные гранулы при 120 000 х г в течение 70 мин при 4 °C, выбрасывают супернатант и повторно суспендируют гранулы, содержащие экзосомы, в 500 мкл 1x PBS.
  2. Анализ отслеживания наночастиц (NTA)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого прогона 500 мкл образца вводили в камеру со скоростью потока 30 мкл/мин. Выполните анализ при температуре 24,4 °C -24,5 °C.
    1. Разбавляют свежеизолированные образцы экзосом стерильными 1x PBS на 1 мл, содержащими 107-10 9 /мл частиц, и вводят их в систему анализа отслеживания наночастиц (см. Таблицу материалов).
    2. Вручную настройте систему захвата и анализа в соответствии с протоколом производителя. Визуализируйте частицы с помощью лазерного рассеяния света и захватите их броуновское движение на цифровом видео.
    3. Анализируйте записанные видеокассеты с помощью программного обеспечения (см. Таблицу материалов) на основе отслеживания не менее 200 отдельных частиц за прогон.
  3. Просвечивающая электронная микроскопия
    1. Зафиксируйте экзосомы в 4% параформальдегиде (в холодном 1x DPBS) в течение 5 мин.
    2. Установите 5 мкл экзосом на медные решетки. В этом эксперименте концентрация экзосом составляет 1 мг/мл, количественно определяемая набором для анализа белка (см. Таблицу материалов).
    3. Вставить экзосомы в 3% фосфовольфрамовую кислоту в течение 10 мин на льду. Удалите избыток кислоты и высушите образцы на RT.
    4. Изображение образцов экзосом с помощью ТЭМ при напряжении ускорения 100 кВ.
  4. Вестерн блоттинг
    1. Добавьте к экзосомам 300 мкл лизисного буфера (1% тритона X-100, 0,1% SDS, 0,1 M Tris HCl, рН 7) и коктейль ингибиторов протеазы (см. Таблицу материалов).
    2. Смешайте экзосомы в буфере лизиса путем пипетки вверх и вниз и дайте ему постоять на льду в течение 20 минут.
    3. Центрифугируют смесь при 9,391 х г в течение 10 мин при 4 °C и собирают надосадочное вещество. Измерьте концентрацию белка с помощью набора для анализа белка (см. Таблицу материалов).
    4. Добавьте 100 мкл 4x буфера белковой нагрузки и нагрейте при 100 °C в течение 10 мин.
    5. Загружают 15 мкл белков в концентрации 10 мг/мл и запускают гелевым электрофорезом (120 В, 70 мин) и электроблоттингом при 100 В, 60 мин при 4 °С.
    6. Обнаружение неэкзосом-специфических маркеров (кальнексин) и экзосомальных биомаркеров (CD9, CD63 и CD81) путем флуоресцентного западного блоттинга (см. Таблицу материалов).
  5. Испытание на безопасность
    1. Для обнаружения бактерий, грибков и микобактерий туберкулеза выполните шаги 3.5.2-3.5.5.
    2. Посейте 100 мкл раствора экзосомы (1 мг/мл) на культуральную пластину агара крови (см. Таблицу материалов) и инкубируйте культуральную пластину при 37 °C в течение 24 ч.
    3. Посеять 100 мкл раствора экзосомы (1 мг/мл) на средней пластине агара сабуро (см. Таблицу материалов) и инкубировать при 35 °С в течение 48 ч.
    4. Посейте 100 мкл раствора экзосомы (1 мг/мл) на пластине культуральной среды Лоуэнсштейна-Йенсена (см. Таблицу материалов) и инкубируйте при 37 °C в течение 3 недель.
    5. Обнаружение появления бактерий, грибков и колоний микобактерий туберкулеза путем макроскопического наблюдения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Критериями оценки безопасности экзосом являются отсутствие микроорганизмов на культуральной пластине.
    6. Для обнаружения микоплазмы выполните действия 3.5.7-3.5.9.
    7. Повторно суспендируют экзосомы в 50 мкл буферного раствора, входящего в комплект, и нагревают при 95 °C в течение 3 мин.
    8. Амплифицируйте микоплазму в экзосомном растворе с помощью набора для детектирования микоплазмы ПЦР (см. Таблицу материалов).
    9. Обнаруживают препараты ПЦР на 1,5% агарозном гелевом электрофорезе (30 мин, 120 В).

4. Обнаружение функции экзосом in vitro

  1. Маркировка экзосом
    1. Этикетка 100 мкл экзосом (1 мг/мл) с 1 мМ Dil (1000x) (см. Таблицу материалов) и инкубация на RT в течение 30 мин.
    2. Восстанавливают экзосомы ультрацентрифугированием при 100 000 х г в течение 70 мин. Повторно суспендировать гранулу в 500 мкл 1x PBS.
  2. Загрузка Cy3-miR-140 имитирует в экзосомы
    1. Смешайте 1 мкг/мкл экзосомального белка и 5 мкмоль/мл Cy3-miR-140 в конечном объеме 400 мкл электропорационного буфера (1,15 мМ фосфата калия (рН 7,2), 25 мМ хлорида калия и 21% (v/v) (см. Таблицу материалов).
    2. Переведите смесь в холодные электропорационные кюветы 0,4 см и электропорат с емкостью 300 В/100 мкФ с помощью системы трансфекции генов (см. Таблицу материалов).
    3. Сразу после электропорации выдерживайте смесь при РТ в течение 30 мин, чтобы обеспечить полное восстановление экзосомной мембраны.
    4. Обрабатывайте смеси одной единицей РНКазы А (см. Таблицу материалов) в течение 20 мин для устранения имитации миРНК вне экзосом.
    5. Ультрацентрифугируйте экзосомную смесь при 120 000 х г в течение 90 мин, отбросьте надосадочную и повторно суспендируйте экзосомы в 500 мкл 1x PBS.
  3. Анализ поглощения экзосом
    1. Засейте хондроциты (1 х 107) в 35 мм конфокальные блюда 1 мл DMEM/F12, содержащий 10% FBS.
    2. Через 24 ч обрабатывают хондроциты диI-мечеными экзосомами (100 нг/мл) или экзосомами, нагруженными cy3-miR-140 (100 нг/мл) в течение 1 ч.
    3. Трижды вымойте 1x PBS, а затем нанесите этикетку с помощью DAPI (10 нг/мл) в течение 10 минут при RT.
    4. Запись флуоресцентного сигнала в конфокальной лазерной сканирующей флуоресцентной микроскопии (CLSM) с использованием соответствующих фильтров (см. Таблицу материалов).

5. Статистический анализ

  1. Выполнять статистический анализ с использованием соответствующего статистического программного обеспечения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативные данные на каждом рисунке были выражены как среднее ± УР. T-тест студента использовался для сравнения двух групп с использованием статистического программного обеспечения. Односторонняя ANOVA с последующим мультипликатором Туки была выполнена в случае сравнения между несколькими группами. Значения P <0,05 (*), <0,01 (**) или <0,001 (***).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Проточная цитометрия использовалась для идентификации поверхностных маркеров SF-МСК в соответствии с минимальными критериями для определения МСК человека, рекомендованными Международным обществом клеточной терапии14,15. Анализ проточной цитометрии показал, что SF-MSC, культивируемые в этом исследовании, соответствовали критериям идентификации МСК. Они были отрицательными для CD34, CD45 и HLA-DR (ниже 3%) и положительными для CD73, CD90 и CD105 (выше 95%) (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мезенхимальные стволовые клетки широко используются в регенеративной медицине благодаря их самообновлению, дифференцированному в тканевые клетки со специализированными функциями и паракринным эффектам16,17. Примечательно, что паракринные эффекты, оказываемые экзосомами, привлекли большое внимание18. Экзосомы несут биоинформацию МСК и выполняют свою биологическую функцию и преодолевают недостатки МСК, такие как проблемное хранение и транспо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Национальный фонд естественных наук Китая (No 81972116, No 81972085, No 81772394); Ключевая программа Фонда естественных наук провинции Гуандун (No2018B0303110003); Гуандунский проект международного сотрудничества (No 2021A0505030011); Шэньчжэньские научно-технические проекты (No. GJHZ20200731095606019, No. JCYJ20170817172023838, No. JCYJ20170306092215436, No. JCYJ20170413161649437); Китайский постдокторский научный фонд (No 2020M682907); Гуандунский фонд фундаментальных и прикладных фундаментальных исследований (No 2021A1515010985); Санминский медицинский проект в Шэньчжэне (SZSM201612079); Специальные фонды для строительства больниц высокого уровня в провинции Гуандун.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Набор для анализа BCAThermoFisher23227Анализ концентрации белка
Тарелка для кровяного агараNanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.P0903Бактериальная культура
антитела CD105ElabscienceE-AB-F1243CПроточная цитометрия
CD34 антителоElabscienceE-AB-F1143CПроточная цитометрия
CD45 антителоBD Bioscience555483Проточная цитометрия
CD63 антителаAbclonal  A5271Западный блоттинг
CD73 антителоElabscienceE-AB-F1242CПроточная цитометрия
CD81 антителоABclonal  A5270Антитело к CD9 вестерн-блоттинга
Абклональный  A1703Western blotting
CD90 антителоElabscienceE-AB-F1167CЦентрифуга для проточной цитометрии
EppendorfCentrifuge 5810R
CO2инкубатор ThermoCell Culture
Конфокальная лазерная сканирующая флуоресцентная микроскопияZEISSLSM 800
CytodexGE HealthcareMicrocarrier
DilThermoFisherD1556Экзосомная метка
EZ-PCR Набор для обнаружения микоплазмыBI20-700-20Обнаружение микоплазмы
ФлоуцитометрияBeckmanMSC идентификация
Gene Pulser II SystemBio-Rad Laboratories1652660Трансфекция гена
GraphPad Prism 8.0.2GraphPad Software, Inc.Версия 8.0.2
HLA-DR антителоElabscienceE-AB-F1111CПроточная цитометрия
Культуральная среда Lowenstein-JensenNanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.T0573Культура микобактерий туберкулеза
MesenGroStemRDMGro-500MSC культура
Nanosight NS300MalvernNanosight NS300Анализ отслеживания наночастиц
NTA 2.3 программное обеспечениеMalvernАнализ данных
Odyssey FCGene Company LimitedФлуоресцентный вестерн-блоттинг
OptiPrep Буфер для электропорацииSigmaD3911Ген трансфекции
Ингибиторы протеазы коктейльSigmaP8340Ингибитор протеиназы
РНКаза АQiagen158924Удаление РНК
Агаровая пластина SabouraudNanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.P0919Культура грибов
TEMJEM-1200EX
Ротационная система культивирования клеток (RCCS)Ultracentrifuge SyntheconRCCS-4HD3D культура
ЦентрифугаBeckmanOptima XPN-100Экзосомная центрифуга

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cross, M., et al. The global burden of hip and knee osteoarthritis: estimates from the global burden of disease 2010 study. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1323-1330 (2014).
  2. Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis & Rheumatology. 64 (6), 1697-1707 (2012).
  3. Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. Unlike bone, cartilage regeneration remains elusive. Science. 338 (6109), 917-921 (2012).
  4. Lu, J., et al. Increased recruitment of endogenous stem cells and chondrogenic differentiation by a composite scaffold containing bone marrow homing peptide for cartilage regeneration. Theranostics. 8 (18), 5039-5058 (2018).
  5. Ogura, T., Bryant, T., Merkely, G., Mosier, B. A., Minas, T. Survival analysis of revision autologous chondrocyte implantation for failed ACI. American Journal of Sports Medicine. 47 (13), 3212-3220 (2019).
  6. Welch, T., Mandelbaum, B., Tom, M. Autologous chondrocyte implantation: past, present, and future. Sports Medicine and Arthroscopy Review. 24 (2), 85-91 (2016).
  7. McGonagle, D., Baboolal, T. G., Jones, E. Native joint-resident mesenchymal stem cells for cartilage repair in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 13 (12), 719-730 (2017).
  8. Jo, C. H., et al. Intra-articular injection of mesenchymal stem cells for the treatment of osteoarthritis of the knee: a proof-of-concept clinical trial. Stem Cells. 32 (5), 1254-1266 (2014).
  9. Pers, Y. M., Ruiz, M., Noël, D., Jorgensen, C. Mesenchymal stem cells for the management of inflammation in osteoarthritis: state of the art and perspectives. Osteoarthritis Cartilage. 23 (11), 2027-2035 (2015).
  10. Neybecker, P., et al. In vitro and in vivo potentialities for cartilage repair from human advanced knee osteoarthritis synovial fluid-derived mesenchymal stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 329(2018).
  11. Jia, Z., et al. Magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and purify synovial fluid-derived mesenchymal stem cells from a rabbit model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).
  12. Phinney, D. G., Pittenger, M. F. Concise review: MSC-derived exosomes for cell-free therapy. Stem Cells. 35 (4), 851-858 (2017).
  13. Phan, J., et al. Engineering mesenchymal stem cells to improve their exosome efficacy and yield for cell-free therapy. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1522236(2018).
  14. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  15. Lv, F. -J., et al. Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32 (6), 1408-1419 (2014).
  16. Samsonraj, R. M., et al. Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine. Stem Cells Translational Medicine. 6 (12), 2173-2185 (2017).
  17. Han, Y., et al. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine. Cells. 8 (8), (2019).
  18. Zhang, G., et al. Exosomes derived from human neural stem cells stimulated by interferon gamma improve therapeutic ability in ischemic stroke model. Journal of Advanced Research. 24, 435-445 (2020).
  19. Zhou, P., et al. Migration ability and Toll-like receptor expression of human mesenchymal stem cells improves significantly after three-dimensional culture. Biochemical and Biophysical Research Communications. 491 (2), 323-328 (2017).
  20. Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
  21. Guo, L., Zhou, Y., Wang, S., Wu, Y. Epigenetic changes of mesenchymal stem cells in three-dimensional (3D) spheroids. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (10), 2009-2019 (2014).
  22. Zhang, Y., et al. Systemic administration of cell-free exosomes generated by human bone marrow derived mesenchymal stem cells cultured under 2D and 3D conditions improves functional recovery in rats after traumatic brain injury. Neurochemistry International. 111, 69-81 (2017).
  23. Cao, J., et al. Three-dimensional culture of MSCs produces exosomes with improved yield and enhanced therapeutic efficacy for cisplatin-induced acute kidney injury. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 206(2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи