Методическая статья

Эффективное рассечение и культура первичной мыши сетчатки Пигмент эпителиальных клеток

DOI:

10.3791/62228

⸱

10 февраля 2021 г.

 ,  , 
1Ocular Genomics Institute of Massachusetts Eye and Ear, Harvard Medical School

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол, который был первоначально сообщил Фернандес-Годино и др. в 2016году 1, описывает метод эффективной изоляции и культуры мыши RPE клетки, которые образуют функциональные и поляризованные RPE монослой в течение одной недели на пластинах Transwell. Процедура занимает около 3 часов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нарушения глаз затрагивают миллионы людей во всем мире, но ограниченная доступность тканей человека препятствует их изучению. Мыши модели являются мощными инструментами для понимания патофизиологии глазных заболеваний из-за их сходства с анатомией человека и физиологии. Изменения в эпителии пигмента сетчатки (RPE), включая изменения в морфологии и функции, являются общими чертами, разделяемыми многими глазными расстройствами. Тем не менее, успешная изоляция и культура первичных клеток RPE мыши является очень сложной задачей. Данный документ представляет 100-ю аудиовизуальную версию протокола, ранее опубликованного Фернандесом-Годино и др. в 2016 году для эффективной изоляции и культуры первичных ячеек мыши RPE. Этот метод является весьма воспроизводимым и приводит к надежной культуры сильно поляризованных и пигментированных rpE монослой, которые могут быть сохранены в течение нескольких недель на Transwells. Эта модель открывает новые возможности для изучения молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе заболеваний глаз. Кроме того, он предоставляет платформу для тестирования терапевтических подходов, которые могут быть использованы для лечения важных глазных заболеваний с неудовлетворенными медицинскими потребностями, включая наследственные расстройства сетчатки и макулярную дегенерацию.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол, который был первоначально сообщил Фернандес-Годино и др. в 2016году 1, описывает метод эффективно изолировать и культуры мыши сетчатки пигмент эпителия (RPE) клетки, которые образуют функциональный и поляризованный RPE монослой в течение одной недели на пластинах Transwell. RPE является монослой, расположенный в глазу между нервной сетчаткой и мембраной Бруха. Этот один слой состоит из сильно поляризованных и пигментированных эпителиальных клеток, к ним присоединяются плотные соединения, проявляли шестиугольную форму, напоминающуюсоты 2. Несмотря на эту кажущуюся гистологическую простоту, RPE выполняет широкий спектр функций, критически важных для сетчатки и нормальногозрительного цикла 2,3,4. Основными функциями монослой RPE являются поглощение света, питание и обновление фоторецепторов, удаление метаболических конечных продуктов, контроль ионного гомеостаза в подретинном пространстве и поддержание гемеконефалическогобарьера 2,3. RPE также играет важную роль в локальной модуляции иммуннойсистемы в глаза 5,6,7,8,9,10,11. Дегенерация и / или дисфункции RPE являются общими чертами разделяют многие глазные расстройства, такие как пигментный ретинит, Лебер врожденный амауроз, альбинизм, диабетическая ретинопатия, имакулярной дегенерации 12,13,14,15. К сожалению, доступность тканей человека ограничена. Учитывая их высоко сохранившейся генетической гомологии с людьми, мыши модели представляют собой подходящий и полезный инструмент для изучения глазных расстройств16,17,18,19. Кроме того, использование культурных первичных клеток RPE обеспечивает такие преимущества, как генетические манипуляции и тестирование на наркотики, которые могут ускорить разработку новыхметодов лечения этих опасных для зрения расстройств 9,11.

Существующие методы, доступные для изоляции мыши RPE и культуры, не воспроизводимы и не подысовыв RPE-функции in vivo с достаточной надежностью. Клетки, как правило, теряют пигментацию, шестиугольную форму и трансепителиальное электрическое сопротивление (TER) в течение несколькихдней в культуре 13,20. Поскольку создание этих основных культур rpE клеток от мышей является сложным процессом, этот оптимизированный протокол был создан на основе других протоколов, чтобы изолировать клетки RPE открыс и человеческих глаз 21,22,23, чтобы вскрыть глаза мыши, собирать RPE и культуры мыши RPE клеток в пробирке.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Были соблюдены руководящие принципы Заявления ARVO об использовании животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения.

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод был доказан успешно с мышами различного генетического происхождения, включая C57BL/6J, B10. D2-Hco H2d H2-T18c/oSnJ и мыши-альбиносы в разном возрасте. Предпочтительно использовать от 8 до 12 недель мышей для получения RPE клеток. Клетки RPE от более старых мышей пролиферировать меньше в культуре и более молодых мышей имеют меньше и более малые клетки, которые требуют объединения глаз от по-разному животных для того чтобы иметь жизнеспособные культуры.

1. Подготовка реагентов и мембранных вставок

  1. Подготовь следующие реагенты.
    1. Подготовка HBSS-H(HBSS без кальция, без буфера магния и 10 мМ HEPES): Добавьте 1 мл 1 М HEPES до 99 мл буфера HBSS- (без Ca/Mg). Хранить при 4 градусах цельсия до 1 месяца.
    2. Подготовка HBSS-H(HBSS с кальцием, с буфером магния и 10 мМ HEPES): Добавьте 1 мл 1 М HEPES до 99 мл буфера HBSS (с буфером Ca/Mg). Хранить при 4 градусах цельсия до 1 месяца.
    3. Приготовить раствор гиалуронидазы (1 мг/мл): Добавить 10 мг гиалуронидазы до 10 мл HBSS-H и отфильтровать его с помощью фильтра стерильного шприца 0,4 мкм с помощью шприца 10 мл. Приготовьте свежие перед использованием и оставьте его при комнатной температуре (RT; 20-25 градусов по Цельсию).
    4. Подготовка решения FBS: Смешайте 20% FBS с HBSS-H. Добавьте 2 мл FBS к 8 мл HBSS-H. Приготовьте свежий перед использованием.
    5. Подготовка RPE среды: N1 Средняя добавка 1/100 (v/v), глутамин 1/100 (v/v), пенициллин-стрептомицин 1/100 (v/v) и несущественный аминокислотный раствор 1/100 (v/v гидрокортизон (20 мкг/л), таурин (250 мг/л) и трийодо-тиронин (0,013 мкг/л) в альфа-МЭМ 5% FBS или без FBS1,23,24. При желании FBS может быть активирована теплом; никаких различий не наблюдалось. Приготовьте свежий для изоляции RPE. Для обслуживания клеточной культуры, хранить при 4 КК до 1 месяца.
    6. Подготовка трипсина-ЭДТА: Подготовка небольших одноразовых алицитов (8 мл) свежего трипсина-ЭДТА (0,25%) и заморозить их при -20 oC. Оттепель их на RT перед каждым использованием. Избегайте циклов замораживания-оттепели.
  2. Подготовьте мембранные вставки (например, вставки Transwell).
    1. Equilibrate 6,5-мм мембранные вставки со средой RPE, по крайней мере 30 мин при 37 градусов по Цельсию, в 5% CO2-aerated инкубатор. Используйте одну мембранную вставку для семян клеток RPE из двух глаз мыши.
    2. После инкубации замените среду нижнего отсека на 700 МКЛ PBS.
    3. Удалите среду из верхнего отсека и покрыть мембранную вставку 100 л ламинина мыши (в PBS) в течение не менее 2 ч на RT (короткие инкубации могут привести к плохой привязанности клеток к вставке).
    4. Пальто дополнительную мембранную вставку для использования в качестве пробела для измерений TER.

2. Рассечение и enucleation глаз мыши

  1. Усытворяйте мышей путем удушья CO2, помещая их в камеру CO2 и медленно высвобождая CO2 со скоростью заполнения 30-70% объема камеры в минуту.
  2. Поместите угловые, зубчатые кончики микро-типсов с каждой стороны мышиного глаза и осторожно нажмите, чтобы опорно глазное яблоко (энуклеация).
  3. Закройте типсы, расположенные вокруг глазного яблока. Затем осторожно потяните при движении вперед и назад, чтобы отделить весь глаз зрительным нервом от глазных мышц, гарантируя, что никакая соединительная ткань не остается прикрепленной к склере.
  4. Промыть энуклеированное глазное яблоко в 70% этанола, прежде чем поместить их в один колодец из шести хорошо пластины с 3 мл HBSS-H на льду.
  5. Повторите шаги от 2,2 до 2,4, чтобы удалить второй глаз мыши. Продолжить следующие шаги в течение 30 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется инкуляции / вскрытия только два глаза в то время, пока некоторый опыт не будет приобретен.

3. Коллекция RPE

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие шаги в стерильных условиях в ламинарном капюшоне потока. Чтобы избежать расширенных инкубаций на льду, которые могут привести к смерти клеток RPE, не собирайте более двух глаз одновременно.

  1. Используйте рассечение стереомикроскопа, дюмон #5 типсы, и угловые ножницы, чтобы тщательно очистить все соединительной ткани, крови и мышц, оставшихся прилагается к глазному яблоку, не делая никаких порезов в склере. Регулярно меняйте буфер HBSS-H, чтобы сохранить глаза свежими и чистыми, и избежать загрязнения культур RPE.
  2. Используйте зрительный нерв в качестве ручки, чтобы держать глазное яблоко и сделать отверстие в центре роговицы с острым углеродно-стальным #11 лезвием.
  3. Используйте #5 ножницами, чтобы сделать три разреза в роговице через вышеупомянутое отверстие, гарантируя, что есть достаточно места для удаления объектива.
  4. Держите зрительный нерв и применить небольшое давление на ора серрата с основанием угловых ножниц, пока объектив выходит полностью. Оставьте эпителий радужной оболочки глаза на месте, чтобы предотвратить отслоение нервной сетчатки и RPE во время инкубации. Поместите глаз в HBSS-H-буфер.
  5. Повторите шаги 3.1-3.4, чтобы вскрыть второй глаз.
  6. Инкубировать глаза без линз в растворе гиалуронидазы в 12-хорошо пластины при 37 градусов по Цельсию в течение 45 мин в 5% CO2-аэрированный инкубатор (1,5 мл / хорошо), чтобы отделить нервной сетчатки от RPE.
  7. Поместите каждый глаз в новую колодец и инкубировать его на льду в течение 30 минут с 1,5 мл холодного буфера HBSS-H' на колодец, чтобы остановить активность гиалуронидазы. Не продлевать инкубацию дольше 45 мин.
  8. Вымойте, и поместите каждый глаз в 35-мм блюдо культуры со свежим буфером HBSS-H и сократить роговицу через оригинальные разрезы до достижения ора серрата с помощью 8-сантиметровых ножниц Vannas. Затем, вырезать ниже ора серрата, чтобы удалить эпителий радужной оболочки глаза и роговицы.
  9. Держите глазную чашку края / ора серрата с изогнутыми пинцетом и, используя угловые микросилы, оторвать нервной сетчатки убедившись, что слой RPE не вырезать. Затем, сократить внутреннее присоединение к зрительного нерва. Если некоторые клетки RPE остаются прикрепленными к нервной сетчатке, продлить инкубацио время, но не превышает 45 мин в общей сложности.
  10. Вырезать зрительный нерв и передать каждый глазной чашки в различных 12-хорошо пластины, содержащие 1,5 мл свежего трипсина-ЭДТА на колодец. Убедитесь, что глазные чашки остаются открытыми и полностью погружены в трипсин. Инкубировать глазные чашки при 37 градусов по Цельсию в течение 45 мин в 5% CO2 инкубатора.
  11. Соберите каждый глаз вместе с любыми листами RPE, отделенными во время инкубации трипсина, и перенесите их в пластину из 12 колодец, содержащую 1,5 мл раствора FBS на колодец. Если листы RPE остаются в растворе трипсина, используйте микропайпетт для передачи их в колодец с раствором FBS.

4. Изоляция первичных клеток RPE мыши

  1. Держите каждую глазную чашку зрительным нервом и встряхните его лицом вниз в 12-хорошо пластины, содержащей 1,5 мл 20% FBS в HBSS-H , пока полное отделение листов RPE не будет достигнуто.
  2. Соберите любые листы RPE и кластеры RPE с помощью микропипетта и поместите их в трубку 15 мл. Избегайте каких-либо белых кусочков склеры или хороида, которые могут загрязнять культуры. Бассейн два глаза от той же мыши в одной трубке.
  3. Центрифуга смеси на 340 х г в течение 2 мин на RT и отказаться от супернатанта.
  4. Аккуратно повторное производство гранул RPE в 1 мл трипсина-ЭДТА (0,25%) и инкубировать смесь в течение 1 мин в водяной бане при 37 градусов по Цельсию, чтобы дезагрегировать листы RPE в одиночные клетки. После инкубации, осторожно трубчатые вверх и вниз 10x с микропипютом, избегая образования пузырьков при пипетке.
  5. Добавить 9 мл свежеприготовленной среды RPE, чтобы разбавить и инактивировать трипсин и центрифугу смеси на 340 х г в течение 2 мин на RT.
  6. Аспирировать супернатант и тщательно повторно использовать клеточные гранулы в 150 МКЛ среды RPE с 5% FBS с помощью микропипетта, гарантируя, что клетки однородно повторно и избежать образования пузырьков при пипетке.
  7. Возьмите мембранную вставку с ламинином покрытием из шага 1.2, удалите PBS из нижней камеры и добавьте 700 МКЛ среды RPE.
  8. Удалите ламинин из верхней камеры мембранной вставки и распредельте подвеску RPE cell dropwise и равномерно к центру камеры, избегая образования пузырьков при трубе.
  9. Поместите мембранную вставку в инкубатор CO2 при 37 градусах Цельсия и оставьте без в силе, по крайней мере, 24 ч.
  10. После 24 ч, проверьте мембранную вставку под микроскопом, чтобы убедиться, что большинство клеток RPE прикреплены к вставке и слияние, по крайней мере 50%(рисунок 1A). Крайне важно не менять средства массовой информации в течение первых 72 ч.

5. Культура поляризованных монослой RPE

  1. Поддерживайте изолированные клетки RPE в культуре, по крайней мере 72 ч, прежде чем освежить RPE среды, чтобы ячейки крепления. Слияние клеток 50% и более при посеве имеет основополагающее значение для формирования подходящего поляризованного монослойного RPE.
  2. Изменение среды культуры два раза в неделю с использованием свежих и предварительно разогретых RPE среды (шаг 1.1.5) после клетки прилагаются. Сыворотка может быть удалена из среды культуры после первых 72 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После одной недели в культуре, клетки должны быть стечены, шестиугольные, двухнуклеанные, пигментированныеи поляризованные (рисунок 1B), с ожидаемым числом клеток составляет около 50000 клеток на 6,5 мм Transwell вставки. После двух недель в культуре наблюдаются монослойные RPE, состоящие из здоровых клеток. Культуры RPE отображают апические микровилли, базальные вфольки и плотные соединения(рисунок 1С).

6. Измерение TER

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните TER измерения клеток RPE после минимум 4 дней в культуре, чтобы обеспечить хорошую целостность и поляризацию монослой RPE.

  1. Очистите электроды вольтомметра 70% этанола и тщательно высушите их.
  2. Возьмите трансвеллы из инкубатора и выполнить измерение TER в течение 3 минут, чтобы избежать изменений из-за колебаний температуры. Для измерения TER, погрузите короткий электрод вольтомметра в верхней камере и длинный электрод в нижнюю камеру мембранной вставки. Избегайте контакта с монослойным RPE, чтобы предотвратить отслоение клеток.
  3. Чтобы вычислить TER, вычесть значение пустой (мембрана вставки покрыты ламинин без клеток) из образца. Затем умножьте полученное значение (в охмах) на площадь поверхности мембранной вставки (0,33см 2 в случае 6,5-мм мембранной вставки). Продукт должен быть не менее 200 х Ωх 2 после 72 ч в культуре. Значения TER должны измеряться выше 400 Ω хсм 2 через две недели. Откажитесь от культур RPE с низкими значениями TER.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол был использован для изоляции и культуры RPE клеток от генетически модифицированных мышей1. Различий между штаммами мышей или полом не наблюдалось. Результаты помогли понять некоторые важные аспекты механизма, лежащие в основе глазных заболеваний, таких как возрастная макулярная дегенерация, которая является наиболее распространенной причиной потери зрения средипожилых людей 9. RpE клетки изолированы после этого протокола были полностью прикреплены к мембранной...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хотя несколько методов для мыши RPE изоляции клетоки культуры были разработаны до 1,13,20,22,26,27, Фернандес-Годино метод впервые используется мембрана вставки позволяет эффективного роста клеток RPE в культуре в течение недели1,9. Еще одним важным изменением

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Институтом глазной геномики в Массачусетсе глаз и ушей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10 мл BD Luer-Lok наконечник шприц, одноразовыйBD Biosciences309604
15 мл центрифуга пробиркаVWR International21008-103
50 мл центрифугаVWR International21008-951
Alpha Minimum Essential MediumSigma-AldrichM4526-500ML
Угловые микрощипцыWPI501727
Настольная центрифугалюбая
СО2 инкубаторThermoHERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V
Препарирующий микроскоплюбой
Dulbecco' s Фоспатный буферный физиологический раствор без кальция, без магнияGibco14190144
Dumont #5 45° Пинцет Medical Biology, наконечник 0,05 x 0,01 мм, длина 11 смWPI14101
ЭтанолSigma-AldrichE7023-500ML
Falcon Easy-Grip Прозрачная чашка для клеточной культуры из полистирола, 35 ммBD Biosciences353001
сыворотка плода крупного рогатого скотаHycloneSH30071,03Термоинактивация.
Хэнк s Сбалансированный раствор соли плюс кальций и магний, без фенола RedLife Technologies14175095
Hank' s Сбалансированный раствор соли плюс кальций и магний, без фенола Красный B6Life Technologies14025092
HEPES 1MGibco15630106
гиалуронидазаSigma-AldrichH-3506 1G
ГидрокортизонSigma-AldrichH-0396
Ламинарный колпакThermoCLASS II A2 4 115V PACKAGECLA
Ламинин 1мг/ млSigma-AldrichL2020-1 MGРазведенный в PBS при 37C до 1 мг/мл
Микроножницы McPherson-Vannas длиной 8 смWPI503216
заменимые аминокислоты 100XGibco11140050
N1 Добавка 100XSigma-AldrichN6530-5ML
Пенициллин-стрептомицинGibco15140-148
Стерильное лезвие Bard-Parker Хирургическое лезвие из углеродистой стали размер 11Fisher-Scientific08-914B
ТауринSigma-AldrichT-0625
Обработанная культура тканей 12-луночные планшетыFisher-Scientific08-772-29
Обработанная культура тканей 6-луночные планшетыFisher-Scientific14-832-11
Трансвелл поддерживает 6,5 ммSigma-AldrichCLS3470-48EA
Трийодо-тиронинSigma-AldrichT-5516
Трипсин-ЭДТА (0,25%), фенол красныйGibco25200056
Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 см, изогнутый, нержавеющая сталь 0,02 x 0,06 мм Мод наконечникиWPI500232
Vannas Ножницы длиной 8 см, нержавеющая стальWPI501790
Ватман Puradisc 25 мм Шприц Фильтры 0.45μ м размер порFisher-Scientific6780-2504

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
  2. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  3. Konari, K., et al. Development of the blood-retinal barrier in vitro: Formation of tight junctions as revealed by occludin and ZO-1 correlates with the barrier function of chick retinal pigment epithelial cells. Experimental Eye Research. 61 (1), 99-108 (1995).
  4. Kay, P., Yang, Y. C., Paraoan, L. Directional protein secretion by the retinal pigment epithelium: Roles in retinal health and the development of age-related macular degeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 833-843 (2013).
  5. Johnson, L. V., Leitner, W. P., Staples, M. K., Anderson, D. H. Complement activation and inflammatory processes in drusen formation and age related macular degeneration. Experimental Eye Research. 73 (6), 887-896 (2001).
  6. Hageman, G. S., et al. An integrated hypothesis that considers drusen as biomarkers of immune-mediated processes at the RPE-Bruch's membrane interface in aging and age-related macular degeneration. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (6), 705-732 (2001).
  7. Lommatzsch, A., et al. Are low inflammatory reactions involved in exudative age-related macular degeneration. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (6), 803-810 (2008).
  8. Bandyopadhyay, M., Rohrer, B. Matrix metalloproteinase activity creates pro-angiogenic environment in primary human retinal pigment epithelial cells exposed to complement. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (4), 1953-1961 (2012).
  9. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. A local complement response by RPE causes early-stage macular degeneration. Human Molecular Genetics. 24 (19), 5555-5569 (2015).
  10. Fernandez-Godino, R., Bujakowska, K. M., Pierce, E. A. Changes in extracellular matrix cause RPE cells to make basal deposits and activate the alternative complement pathway. Human Molecular Genetics. 27 (1), 147-159 (2018).
  11. Fernandez-Godino, R., Pierce, E. A. C3a triggers formation of sub-retinal pigment epithelium deposits via the ubiquitin proteasome pathway. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
  12. Farkas, M. H., et al. Mutations in Pre-mRNA processing factors 3, 8, and 31 cause dysfunction of the retinal pigment epithelium. American Journal of Pathology. 184 (10), 2641-2652 (2014).
  13. Geisen, P., Mccolm, J. R., King, B. M., Hartnett, E. Characterization of Barrier Properties and Inducible VEGF Expression of Several Types of Retinal Pigment Epithelium in Medium-Term Culture. Current Eye Research. 31, 739(2006).
  14. Schütze, C., et al. Retinal pigment epithelium findings in patients with albinism using wide-field polarization-sensitive optical coherence tomography. Retina. 34 (11), 2208-2217 (2014).
  15. Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
  16. Garland, D. L., et al. Mouse genetics and proteomic analyses demonstrate a critical role for complement in a model of DHRD/ML, an inherited macular degeneration. Human Molecular Genetics. 23 (1), 52-68 (2014).
  17. Fu, L., et al. The R345W mutation in EFEMP1 is pathogenic and causes AMD-like deposits in mice. Human Molecular Genetics. 16 (20), 2411-2422 (2007).
  18. Greenwald, S. H., et al. Mouse Models of NMNAT1-Leber Congenital Amaurosis (LCA9) Recapitulate Key Features of the Human Disease. American Journal of Pathology. 186 (7), 1925-1938 (2016).
  19. Gupta, P. R., et al. Ift172 conditional knock-out mice exhibit rapid retinal degeneration and protein trafficking defects. Human Molecular Genetics. 27 (11), 2012-2024 (2018).
  20. Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).
  21. Bonilha, V. L., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. Ezrin promotes morphogenesis of apical microvilli and basal infoldings in retinal pigment epithelium. Journal of Cell Biology. 147 (7), 1533-1547 (1999).
  22. Nandrot, E. F., et al. Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking αvβ5 integrin. Journal of Experimental Medicine. 200 (12), 1539-1545 (2004).
  23. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).
  24. Maminishkis, A., Miller, S. S. Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
  25. Brydon, E. M., et al. AAV-Mediated Gene Augmentation Therapy Restores Critical Functions in Mutant PRPF31+/− iPSC-Derived RPE Cells. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 15, 392-402 (2019).
  26. Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. 2018 (133), (2018).
  27. Bonilha, V. Age and disease-related structural changes in the retinal pigment epithelium. Clinical Ophthalmology. 2 (2), 413(2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи