Method Article

Мультиплексированный анализ экспрессии генов сетчатки и доступности хроматина с использованием scRNA-Seq и scATAC-Seq

DOI:

10.3791/62239

⸱

March 12th, 2021

 ,  ,  , 
1Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Psychiatry and Behavioral Science, The Johns Hopkins Hospital, 3Department of Ophthalmology, The Johns Hopkins Hospital, 4Department of Neurology, The Johns Hopkins Hospital, 5Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Kavli Neuroscience Discovery Institute, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь авторы демонстрируют полезность MULTI-seq для фенотипирования и последующих пар scRNA-seq и scATAC-seq в характеристике профилей доступности транскриптома и хроматина в сетчатке.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мощные методы секвенирования следующего поколения предлагают надежный и всесторонний анализ для изучения того, как регуляторные сети генов сетчатки функционируют во время развития и в болезненных состояниях. Секвенирование одноклеточной РНК позволяет всесторонне профилировать изменения экспрессии генов, наблюдаемые при развитии и заболевании сетчатки на клеточном уровне, в то время как одноклеточный ATAC-Seq позволяет профилировать анализ доступности хроматина и связывания фактора транскрипции с аналогичным разрешением. Здесь описывается использование этих методов в развивающейся сетчатке и демонстрируется MULTI-Seq, где отдельные образцы маркируются модифицированным олигонуклеотид-липидным комплексом, что позволяет исследователям как увеличить объем отдельных экспериментов, так и существенно снизить затраты.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Понимание того, как гены могут влиять на судьбу клеток, играет ключевую роль в опросе таких процессов, как болезнь и эмбриональное прогрессирование. Сложные взаимосвязи между факторами транскрипции и их генами-мишенями могут быть сгруппированы в генные регуляторные сети. Растущие доказательства помещают эти генные регуляторные сети в центр как болезни, так и развития в эволюционных линиях1. В то время как предыдущие методы, такие как qRT-PCR, были сосредоточены на одном гене или наборе генов, применение технологии высокопроизводительного секвенирования позволяет профилировать полные клеточные транскриптомы.

RNA-seq предлагает взглянуть на крупномасштабную транскриптомику 2,3. Секвенирование одноклеточной РНК (scRNA-seq) дает исследователям возможность не только профилировать транскриптомы, но и связывать конкретные типы клеток с профилями экспрессии генов4. Это достигается биоинформатически путем подачи отдельных профилей клеток в алгоритмы сортировки с использованием известных генных маркеров5. Мультиплексирование с использованием секвенирования индексов с липидными метками (MULTI-seq) предлагает беспрецедентное разнообразие в количестве профилей scRNA-Seq, которые могут быть собраны6. Этот метод на основе липидов отличается от других методов индексации образцов, таких как хеширование клеток, которые полагаются на присутствие поверхностных антигенов и антител с высоким сродством вместо интеграции плазматической мембраны7. Мало того, что теперь можно профилировать профили экспрессии генов по типам клеток, но различные эксперименты могут быть объединены в единую библиотеку секвенирования, что значительно снижает стоимость отдельного эксперимента scRNA-seq6. Стоимость scRNA-seq может показаться непомерно высокой для использования в экспериментах по фенотипированию, где анализируется множество различных генотипов, состояний или образцов пациентов, но мультиплексирование позволяет комбинировать до 96 образцов в одной библиотеке6.

Профилирование экспрессии генов с помощью scRNA-seq было не единственным высокопроизводительным методом секвенирования, который произвел революцию в современном понимании того, как молекулярные механизмы диктуют судьбу клеток. Хотя понимание того, какие транскрипты генов присутствуют в клетке, позволяет идентифицировать тип клетки, не менее важным является понимание того, как геномная организация регулирует развитие и прогрессирование заболевания. Ранние исследования основывались на обнаружении Опосредованного ДНКазой расщепления последовательностей, не связанных с гистонами, с последующим секвенированием полученных фрагментов ДНК для идентификации областей открытого хроматина. Напротив, одноклеточный анализ для транспозонного доступного секвенирования хроматина (scATAC-seq) позволяет исследователям исследовать ДНК с помощью одомашненного транспозона, чтобы легко профилировать открытый хроматин на уровне одного нуклеотида8. Это прошло через масштабирование, аналогичное scRNA-seq, и теперь исследователи могут идентифицировать отдельные типы клеток и фенотипы профиля в тысячах отдельных геномов8.

Сочетание scRNA-seq и scATAC-seq позволило исследователям профилировать тысячи клеток для определения клеточных популяций, геномной организации и регуляторных сетей генов в моделях заболеваний и процессах развития 9,10,11,12. Здесь авторы описывают, как сначала использовать MULTI-seq для конденсации фенотипирования множества животных моделей и использовать парные scRNA-seq и scATAC-seq, чтобы лучше понять ландшафт хроматина и регуляторные сети в этих животных моделях.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование животных для этих исследований проводилось с использованием протоколов, одобренных Комитетом по уходу и использованию животных Джона Хопкинса, в соответствии с руководящими принципами ARRIVE, и выполнялось в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами.

1. МУЛЬТИ-сек

  1. Подготовка СМИ
    1. Приготовьте и уравновешивайте овомукуоидный ингибитор, 10 мг овомукуоидного ингибитора и 10 мг альбумина на мл сбалансированного солевого раствора Эрла (ЭБСС), в течение 30 мин перед применением13. Уравновешивайте 95% O2:5% CO2 в инкубаторе.
      1. Приготовьте раствор для диссоциации папаина, 20 единиц / мл папаина и 0,005% ДНКазы в ЭБСС, во время этой инкубационной стадии13.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Одного флакона раствора ДНКазы будет достаточно для 5 образцов. Дополнительные флаконы, возможно, потребуется восстановить при выполнении MULTI-seq на более чем 5 образцах.
    2. Готовят липидно-модифицированные олигобаркодирующие растворы.
      1. Сделайте уникальное разбавление штрих-кода для каждого образца, объединив 0,5 мкл раствора штрих-кода 100 мкМ с 4,5 мкл фосфатного буферизованного физиологического раствора (PBS).
      2. Чтобы приготовить раствор якоря: штрих-кода в молярном соотношении 1:1, смешайте 4,4 мкл разбавления штрих-кода 10 мкМ, 0,9 мкл анкерного раствора 50 мкМ и 16,7 мкл PBS и поместите на лед. Конечная концентрация как для нитей штрих-кода, так и для анкерных нитей должна составлять 2 мкМ.
      3. Для приготовления коякорного раствора смешайте 0,88 мкл 50 мкМ коякорного раствора и 21,12 мкл ПБС и поместите на лед. Конечная концентрация коякоря должна составлять 2 мкМ. Умножьте объемы на этом этапе на 1,1 раза больше количества образцов.
    3. Чтобы получить 1% BSA в PBS, растворите 0,1 г бычьего сывороточного альбумина (BSA) в 10 мл PBS и поместите на лед.
    4. Чтобы получить PBS с ингибитором РНКазы, соедините 2,5 мкл ингибитора РНКазы 40 Ед/мкл с 197,5 мкл PBS и храните на льду. Умножьте объемы на этом шаге в 1,1 раза больше количества образцов.
  2. Диссоциация образцов
    1. Эвтаназия животных через вывих шейки матки и/или асфиксиюCO2 в соответствии с институциональными требованиями IACUC. Метод эвтаназии будет зависеть от институциональных требований и используемой модели организма.
    2. Рассечение сетчатки от обоих глаз в холодном PBS под рассеченным микроскопом и перенос в стерильную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл с помощью трансферной пипетки.
    3. Перенесите 500 мкл раствора папаина в пробирку объемом 1,5 мл для каждого образца.
    4. Поместите образцы в раствор папаина и сразу же закройте пробирки.
    5. Инкубируют пробирки, содержащие образцы при 37 °C, 5% CO2 в течение 30 мин. Переворачивайте флаконы 3 раза каждые 10 минут. Выборки должны постепенно диссоциировать с каждым раундом инверсий.
    6. Верните флаконы до комнатной температуры и тритурируйте каждый образец 3-4 раза с помощью пипетки 1 мл, установленной на 300 мкл.
    7. Дайте любым кусочкам нерасслоенной ткани, оставшимся после тритурации, осесть.
    8. Удалите мутную клеточную суспензию, избегая при этом любых кусочков недиссоциированной ткани, и поместите клеточную суспензию каждого образца в новую стерильную трубку с винтовой крышкой 15 мл.
    9. Центрифугируют клеточные суспензии при 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    10. На этапе центрифугирования подготовьте клеточную ресуспенсионную среду.
      1. Смешайте 857 мкл ЭБСС (флакон 1) с 95 мкл восстановленного раствора альбумин-овомукуоидного ингибитора в стерильной трубке с винтовой крышкой 1,5 мл. Добавьте 48 мкл раствора ДНКазы, сэкономленного из 1.1.1. Умножьте объемы на этом шаге в 1,1 раза больше количества образцов.
    11. Выбросьте супернатант, осторожно сохранив клеточные гранулы, и немедленно повторно суспендируйте гранулы клеток в 1 мл клеточного раствора для повторного суспензии, приготовленного на стадии 1.2.10.
    12. Подготовьте прерывистый градиент плотности.
      1. Для каждого образца добавляют 1,6 мл раствора овомукуоидного ингибитора в новую 15 мл стерильную завинчивающуюся трубку и аккуратно накладывают клеточную суспензию сверху. Интерфейс между двумя слоями градиента должен быть видимым, но некоторое смешивание не влияет на результаты.
    13. Центрифугируйте прерывистые градиенты плотности при 70 х г в течение 6 мин при комнатной температуре. Диссоциированные клетки должны гранулироваться в нижней части трубок, в то время как фрагменты мембраны остаются на границе раздела.
    14. Выбросьте супернатант и добавьте 200 мкл PBS для промывки гранулированных клеток. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    15. Откажитесь от супернатанта и повторно суспендируйте клетки в 180 мкл PBS с ингибитором РНКазы. Пропустите клетки через клеточный сетчатый фильтр 40 мкм в стерильную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
  3. Штрих-кодирование ячеек
    1. Добавьте 20 мкл раствора якоря: штрих-кода к каждому образцу и аккуратно перемешайте. Убедитесь, что каждый образец получает уникальный раствор якоря: штрих-кода и инкубируйте на льду в течение 5 минут.
      1. Подготовьте материалы, необходимые для генерации гелевой бусины в эмульсии (GEM) и штрих-кодирования во время этой инкубации14.
    2. Добавьте 20 мкл ко-анкерного раствора к каждому образцу и аккуратно перемешайте. Инкубировать на льду в течение 5 мин.
    3. Добавьте 1 мл ледяного 1% BSA в PBS к каждому образцу и центрифугируйте ячейки при 300 х г в течение 5 мин при 4 °C.
    4. Удалите супернатант, не нарушая клеточную гранулу, и добавьте 400 мкл ледяного холода 1% BSA в PBS. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин при 4 °C.
      1. Повторите шаг 1.3.4 в общей сложности 2 промывки. Удалить супернатант и повторно суспендировать в 400 мкл ледяного холода 1% BSA в PBS.
    5. Определите концентрацию клеток для каждого образца с помощью гемоцитометра.
      1. Определите общее количество ячеек для загрузки для каждого образца. Как правило, это общее количество желаемых клеток, деленное на количество образцов. Однако, если биологическая реплика для одного состояния была потеряна, ее доля может быть разделена между другими биологическими репликациями из этого состояния.
      2. Разделите число ячеек, необходимое для каждого образца, на концентрацию клеток этого образца, рассчитанную на этапе 3.5, чтобы определить объем, необходимый для загрузки желаемого количества ячеек.
    6. Объедините объемы, рассчитанные на этапе 3.5.2 из каждого образца, в новую стерильную центрифужную трубку объемом 1,5 мл. Разумно удвоить объем, взятый из каждого образца, в случае сбоя генерации GEM.
      1. Определите «конечную» концентрацию клеток комбинированных образцов с помощью гемоцитометра.
  4. Генерация GEM и штрих-кодирование
    1. Используйте комбинированные образцы для генерации и штрих-кода GEMs14.
  5. Очистка после GEM-RT и усиление кДНК
    1. Подготовить материалы для очистки обратной транскриптазы после GEM и усиления кДНК в соответствии с инструкциями производителя со следующими модификациями14. Выполните очистку после GEM-RT по выбору размера14.
      1. Увеличить объем 80% этанола, приготовленного на 2 мл.
      2. Приготовьте смесь для усиления кДНК на льду14. Добавьте 1 мкл праймера MULTI-seq 2,5 мкМ в смесь усиления кДНК. Вихрь на 5 с и центрифуга на 5 с в настольной мини-центрифуге.
    2. Выполняют усиление кДНК14. КДНК может храниться при 4 °C в течение 72 ч в этот момент.
    3. Выполните очистку кДНК по выбору размера14. Эндогенная транскриптная кДНК может храниться при 4 °C в течение 72 ч или при -20 °C в течение до 4 недель на этом этапе.
      1. Не отбрасывайте супернатант из первого раунда выбора размера. Эта фракция содержит образцы штрих-кодов. Перенесите супернатант в новую стерильную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
      2. Храните супернатант на льду.
    4. Вихрь для повторного суспендирования реагента для выбора размера на основе парамагнитных шариков и добавления 260 мкл парамагнитного реагента для выбора размера на основе шариков (конечный 3,2x) и 180 мкл 100% изопропанола (1,8x) к супернатанту. Пипетку перемешать 10 раз и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин.
    5. Поместите трубку на магнитную стойку и дождитесь очистки раствора. Затем удалите и выбросьте супернатант.
    6. Добавьте в шарики 500 мкл 80% этанола и оставьте настояться 30 с. Удалите и выбросьте супернатант.
      1. Повторите в общей сложности 2 стирки.
    7. Кратковременно центрифугируйте бусины и вернитесь в магнитную стойку. Запустите таймер на 2 мин.
    8. Удалите оставшийся этанол пипеткой P10 и высушите шарики на воздухе на магнитной стойке в течение оставшейся части 2 мин. Не более 2 мин.
    9. Извлеките шарики из магнитной стойки и повторно суспендируйте в буфер элюирования 100 мкл (EB). Пипетку тщательно использовать повторно.
    10. Инкубировать при комнатной температуре в течение 2 мин.
    11. Вернитесь в магнитную стойку и дождитесь очистки раствора.
    12. Перенесите супернатант в свежую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
    13. Повторите шаги с 1.5.4 по 1.5.12. Вдвое уменьшить объем буфера EB, используемого на шаге 1.5.9.
    14. Определение концентрации и распределения ДНК штрих-кода с помощью высокочувствительного набора для анализа dsDNA и флуорометра и анализатора фрагментов15,16. Штрих-код кДНК может храниться при 4 °C в течение 72 ч или при -20 °C в течение 4 недель на этом этапе.
  6. Построение библиотеки штрих-кодов
    1. Готовят 1 мл 80% этанола.
    2. Подготовьте мастер-смесь ПЦР-матрицы библиотеки штрих-кодов в стерильной ленточной трубке ПЦР: объедините 26,25 мкл готовой смеси для ПЦР горячего запуска, 2,5 мкл универсальной грунтовки i5 10 мкМ, 2,5 мкл праймера RPI 10 мкМ, 3,5 нг кДНК штрих-кода (объем, определяемый концентрацией из Шага 5,14) и достаточное количество воды без нуклеазы, чтобы довести конечный объем до 50 мкл.
      1. Используйте уникальный букварь RPI для каждой библиотеки штрих-кодов, если несколько библиотек MULTI-seq секвенированы вместе.
    3. Подвергите мастер-микс библиотеки штрих-кодов библиотеке подготовки ПЦР: 95 °C в течение 5 мин; 10 циклов при 98 °C в течение 15 с, 60 °C в течение 30 с, 72 °C в течение 30 с; 72 °C в течение 1 мин; а затем удерживать при температуре 4 °C.
    4. Вихрь для повторного суспендирования парамагнитного реагента для подбора размера на основе шариков.
    5. Извлеките продукт ПЦР из термоциклера и добавьте 80 мкл (1,6x) реагента для подбора размера на основе парамагнитных шариков. Пипетка основательно.
    6. Инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин. Поместите на магнитный сепаратор в высокое положение и дождитесь очистки раствора.
    7. Удалите и выбросьте супернатант.
    8. Добавьте в шарики 200 мкл 80% этанола и дайте постоять 30 с. Удалите и выбросьте супернатант.
      1. Повторите шаг 1.6.8, чтобы выполнить в общей сложности 2 промывки.
    9. Кратковременно центрифугируют трубку и размещают на магнитном сепараторе в низком положении. Запустите таймер на 2 мин.
    10. Удалить оставшийся этанол пипеткой P20 и высушить шарики на воздухе на магнитном сепараторе в течение оставшейся части 2 мин. Не более 2 мин.
    11. Извлеките трубку из магнитного сепаратора и повторно суспендируйте шарики в 25 мкл буфера EB. Пипетку тщательно перемешать, чтобы повторно суспендировать бусины.
    12. Инкубировать в течение 2 мин при комнатной температуре.
    13. Вернитесь к магнитному сепаратору в низком положении и дождитесь очистки раствора. Перенесите супернатант в новую трубку для полосы ПЦР.
    14. Количественная оценка концентрации библиотеки выражений и библиотеки штрихкодов и распределения фрагментов по размерам с помощью высокочувствительного набора для анализа adsDNA и флуорометра и анализатора фрагментов.
  7. 3' Построение библиотеки экспрессии генов
    1. Выполните построение библиотеки экспрессии генов 3' в соответствии с инструкциямипроизводителя 14.
  8. Секвенирование
    1. В дополнение к эндогенной библиотеке кДНК, усиленной на шаге 7, представьте библиотеку штрих-кодов, усиленную на шаге 6. Для простоты представить эти библиотеки по отдельности или в качестве экономически эффективной меры включить аликвоту образца штрихкодирующего материала с эндогенной библиотекой кДНК. Целевой показатель между 20 000-50 000 кДНК и 3000-5000 штрих-кодов на ячейку.
    2. Преобразуйте результирующую последовательность bcl-файлов в файлы fastq с помощью cellranger mkfastq и матрицы подсчета, сгенерированные из них по счетчику cellranger.
    3. Деконволюционные образцы после анализа Cellranger с использованием пакета deMULTIplex r, доступного в репозитории MULTI-seq GitHub (https://github.com/chris-mcginnis-ucsf/MULTI-seq).

2. Парные scRNA-seq и scATAC-seq

  1. Флэш-замораживание ткани для scATAC-seq и фиксации метанола клеток сетчатки для scRNA-seq
    1. Подготовка СМИ
      1. Чтобы подготовить растворы для диссоциации сетчатки, повторите шаги 1.1.1 и 1.1.4.
      2. Приготовьте ванну с этанолом для сухого льда в небольшом ведре со льдом.
      3. Приготовьте 15 мл 70% этанола, добавив 10,5 мл этанола в 4,5 мл воды без нуклеазы.
      4. Добавьте достаточно сухого льда в ведро со льдом (желательно в форме гранул), чтобы 15 мл жидкости поднялись, чтобы просто покрыть лед. Добавьте 15 мл этанола.
      5. Поместите PBS на лед и 1 мл аликвоты 100% метанола в удобную морозильную камеру -20 °C.
    2. Пробоподготовка
      1. Выполните шаги 1.2.1 и 1.2.2 для изоляции сетчатки; однако на этот раз поместите каждую сетчатку в отдельную микроцентрифужную трубку.
      2. Для образцов, предназначенных для scATAC-seq, удалите любую жидкость из микроцентрифужной трубки с помощью пипетки P200 и немедленно поместите трубку в ванну с этанолом и сухим льдом, чтобы мгновенно заморозить образец.
      3. Для образцов, предназначенных для scRNA-seq, чтобы диссоциировать клетки, повторите шаги с 1.2.3 по 1.2.15 на рассеченной сетчатке.
      4. Центрифугируйте ячейки при 300 х г в течение 3 мин при комнатной температуре.
      5. Удалите супернатант, не нарушая клеточную гранулу.
      6. Добавьте 1 мл охлажденного PBS и аккуратно перемешайте 10 раз или до тех пор, пока клетки полностью не станут суспендированными.
      7. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин при 4 °C.
        1. Повторите шаги 2.1.2.5-2.1.2.7 в общей сложности 2 промывки.
      8. Удалите супернатант, не нарушая клеточную гранулу.
      9. Добавьте 100 мкл охлажденного PBS и осторожно перемешайте 10x или до тех пор, пока клетки не будут полностью суспендированы.
      10. Начните вихрь трубки на самой низкой скорости. Добавьте 900 мкл охлажденного метанола (-20 °C) капля за каплей, продолжая осторожно вихрять трубку, чтобы предотвратить слипание клеток.
      11. Инкубировать клетки на льду в течение 15 мин.
      12. Определить концентрацию фиксированных клеток можно с помощью гемоцитометра.
      13. Оцените эффективность стадии фиксации с помощью трипан синего цвета. Высокая доля жизнеспособных клеток указывает на то, что требуется больше времени фиксации.
      14. Храните замороженную ткань и фиксированные клетки при -80 °C.
  2. Выделение ядер из замороженной ткани для scATAC-seq
    1. Подготовка СМИ
      1. Подготовьте буфер разбавления лизиса, объединив 9,77 мл воды без нуклеазы, 100 мкл 1 M Tris-HCl (рН 7,4), 100 мкл 1 M NaCl, 30 мкл 1 MMgCl2 и 0,1 г BSA.
      2. Подготовьте буфер разбавления лизиса заранее, например, накануне, и храните при температуре 4 °C. В день составления протокола поместите на лед.
      3. Уравновешивание 20x буфера ядер, предусмотренного производителем комплекта scATAC, от -20 °C до комнатной температуры. Вихрь и центрифуга ненадолго.
      4. Подготовьте 1x буфер лизиса, инкубируя 5% раствор дигитонина на водяной бане с температурой 65 °C до растворения осадка. Затем смешайте 2 мл буфера разбавления лизиса, 20 мкл 10% Tween-20, 20 мкл заменителя Nonidet P40 (может быть альтернативно маркирован IGEPAL) и 4 мкл Digitonin.
      5. Храните 1x буфер лизиса на льду.
      6. Чтобы приготовить буфер лизиса 0,1x, соедините 1,8 мл буфера разбавления лизиса с 200 мкл буфера лизиса 1x и храните на льду.
      7. Чтобы подготовить промывочный буфер, соедините 2 мл буфера разбавления лизиса и 20 мкл 10% Tween-20 и храните на льду.
      8. Чтобы подготовить разбавленный буфер ядер, соедините 950 мкл воды без нуклеазы с 50 мкл буфера ядер (20x) и храните на льду.
    2. Выделение ядер
      1. Не размораживайте образец перед лизисом. Добавьте 500 мкл охлажденного 0,1-кратного лизисного буфера в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, содержащую замороженный образец. Немедленно гомогенизируйте 15x с помощью гранул пестика.
      2. Инкубировать в течение 5 мин на льду. Подготовьте материалы, необходимые для транспозиции scATAC на этом этапеинкубации 17.
      3. Пипетку смешать 10x с пипеткой 1 мл и инкубировать в течение 10 мин на льду. Полная подготовка материалов, необходимых для транспозиции scATAC на этом этапе инкубации, если она еще не завершена. Нет необходимости готовить больше разбавленного буфера ядер.
      4. Добавьте 500 мкл охлажденного промывочного буфера в лизированные ячейки. Пипетка микс 5x.
      5. Пропустите суспензию через клеточный сетчатый фильтр 70 мкм в новую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Фильтруйте ~ 300 мкл за раз, используя новый 70-мкм клеточный сетчатый фильтр каждый раз.
      6. Пропустите собранный поток через клеточный сетчатый фильтр 40 мкм в новую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл и храните на льду.
      7. Определить концентрацию ядер с помощью гемоцитометра. Исходя из концентрации ядер и общего объема клеточной суспензии, рассчитывают общее количество диссоциированных ядер.
      8. Центрифугу при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C и удаляют супернатант, не разрушая гранулы ядер.
      9. Чтобы создать запас ядер на основе общего количества ядер, определенного на шаге 2.2.2.7., повторно суспендируйте ядра в достаточно разбавленном буфере ядер для достижения желаемой концентрации ядер.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Желаемая концентрация ядер основана на целевом восстановлении ядер для эксперимента scATAC-seq и определяется из Руководства по концентрации ядер, содержащегося в протоколе17 производителя. Например, если в конечном итоге желательно 10 000 ядер, желаемая концентрация ядер для nuclei Stock составляет от 3 080 до 7 700 ядер/мкл. Возможно, лучше всего стремиться к середине диапазона концентрации.
      10. Определить концентрацию ядер с помощью гемоцитометра.
      11. Немедленно приступают к транспозиции scATAC с использованием подготовленного запаса ядер17.
  3. Регидратация фиксированных клеток метанола для использования в scRNA-Seq
    1. Подготовка СМИ
      1. Для приготовления буфера для промывки/разбавления растворите 0,01 г BSA в 1 мл PBS. Затем добавляют 12,5 мкл ингибитора РНКАЗЫ 40 Ед/мкл и осторожно перемешивают. Хранить на льду.
    2. Регидратация клеток
      1. Центрифуга метанола фиксирует ячейки в микроцентрифужной трубке 1,5 мл при 3000 х г в течение 10 мин при 4 °C. Затем удалите супернатант.
      2. Добавьте 200 мкл охлажденного буфера промывки/разбавления в микроцентрифужную трубку. Центрифугу при 300 х г в течение 10 мин при 4 °C и удаляют супернатант. Повторите в общей сложности 2 стирки.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте материалы, необходимые для генерации GEM и штрих-кодирования в течение предыдущих двух шагов14.
      3. Чтобы подготовить клеточный запас, основываясь на общем количестве клеток, рассчитанном в 2.1.2.12., повторно суспендируйте ячейки в достаточном буфере промывки/разбавления для достижения желаемой концентрации клеток. Предпочтительные клеточные концентрации составляют от 700 до 1200 клеток/мкл.
      4. Определить клеточную концентрацию клеточного запаса можно с помощью гемоцитометра.
      5. Немедленно приступайте к генерации GEM и штрих-кодированию с использованием клеточного запаса14.
    3. Секвенирование
      1. При выполнении анализа временного курса (например, при развитии или заболевании) последовательность нескольких образцов в мультиплексированном запуске (т. Е. Несколько библиотек на одной проточной ячейке), чтобы сократить технические вариации.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот рабочий процесс излагает стратегию исследования фенотипов развития и регуляторных процессов с использованием секвенирования одиночных клеток. Мультиплексирование образцов MULTI-seq позволяет проводить первоначальный недорогой анализ фенотипирования, в то время как парный сбор и фиксация образцов для scRNA-seq и scATAC-seq позволяет проводить более углубленное исследование (рисунок 1).

Штрих-кодирование MULTI-seq обеспечивает комбинированное секвенирование нес...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сила MULTI-seq проистекает из бесшовной интеграции данных из нескольких экспериментальных условий или моделей и огромной выгоды с точки зрения стоимости и ограничения пакетных эффектов. Использование MULTI-seq обеспечивает лабораторную беспрецедентную глубину фенотипирования. Негенетические методы мультиплексирования, такие как хеширование клеток или хеширование ядер, открыли дверь к мультиплексированным образцам с использованием штрих-кодированных антител 7,19,20

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Раскрывать нечего.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Линду Орзолек из Johns Hopkins Transcriptomics и Deep Sequencing Core за помощь в секвенировании созданных библиотек и Lizhi Jiang за выполнение ex vivo retinal explants.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 & микро; L, 200 & микро; L, 1000 & микро; L наконечники для фильтра
10% Tween 20Bio-Rad1662404
100 &; M Штрихкод Запрос от лаборатории Gartnerhttps://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897& edit_requested
=true
100% этанолMillipore SigmaE7023-500ML
100% метанолMillipore Sigma322415-100ML
10x Держатель чипов10x Genomics1000195
10x Chromium контроллер и Набор принадлежностей10x GenomicsPN-120263
15 мл центрифужная пробиркакачество БиологическийP886-229411
40 &; m Фильтр для ячеек FlowMiBel-ArtH13680-0040
50 µ M Anchor SolutionSigma или запрос из лаборатории Gartnerhttps://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897& edit_requested
=true
50 &микро; M Co-Anchor SolutionSigma или запрос из лаборатории Gartnerhttps://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897& edit_requested
=true
5200 Система анализа фрагментовAgilentM5310AA
70 мкм Фильтр для клеток FlowMiBel-ArtH13680-0070
Центрифуга Allegra X-12RVWRBK392302
бычья сыворотка альбуминSigma-AldrichA9647
Chromium Next GEM Chip G10x GenomicsPN-1000120
Chromium Next GEM Chip H10x GenomicsPN-1000161
Chromium Next Gem Single Cell ATAC Reagent Kit v1.110x GenomicsPN-1000175
Chromium Single Cell 3' GEM, Библиотека и Набор гелевых шариков v3.110x GenomicsPN-1000121
ДигитонинFisher ScientificBN2006
Диссекционный микроскопLeica
DNA LoBind Tubes, 1,5 млEppendorf22431021
сухой лед
EVA Пенопластовая сковорода для льдаTequipment04393-54
FA 12-капиллярный Массив короткий, 33 смAgilentA2300-1250-3355
Fisherbrand Isotemp Водяная баняFisher Scientific15-460-20Q
Forma CO2 Инкубатор с водяной рубашкойThermoFisher Scientific3110
Глицерин 50% водный растворRicca Chemical Company3290-32
Hausser Scientific Счетная камера Bright-LineFisher Scientific02-671-51B
Illumina NextSeq или NovaSeqIllumina
Kapa Hifi Hotstart ReadyMixHiFi7958927001
низким TE БуферКачество Биологический351-324-721
Раствор хлорида магния 1 мSigma-AldrichM1028
Магнитный сепаратор штатив для пробирок объемом 1,5 млMillipore Sigma20-400
Магнитный сепаратор Стеллаж для 200 & микро; L-пробирки10x GenomicsNC1469069
MULTI-seq PrimerSigma или IDTСмотрите список
MyFuge Mini CentrifugeBenchmark ScientificC1008
Nonidet P40 SubstituteSigma-Aldrich74385
Безнуклеаза водаFisher ScientificAM9937
P2, P10, P20, P200, P1000Eppendorf
Papain Dissociation SystemWorthington Biochemical CorporationLK003150
PBS pH 7,4 (1X)Fisher Scientific10010-023
Qiagen Buffer EBQiagen19086
Рефрижераторная центрифуга 5424 REppendorf2231000655
одноразовые пеллетные пестикибез РНКазыFisher Scientific12-141-368
РНКазин плюс ингибитор РНКазыPromegaN2615
RPI праймерSigma или IDTСмотрите список
Single Index Kit N, Set A10x GenomicsPN-1000212
Single Index Kit T Set A10x GenomicsPN-1000213
Раствор хлорида натрия 5 MSigma-Aldrich59222C
Набор реагентов SPRIselectBeckman CoulterB23318
Стандартные одноразовые переводные пипеткиFisher Scientific13-711-7M
TempAssure PCR 8-пробирочная полоскаСША Scientific1402-4700
Раствор тризмы гидрохлорида, pH 7,4Sigma-AldrichT2194
Раствор трипанового синего цвета, 0,4% (по объему)Corning25-900-CI
Универсальный праймер I5Sigma или IDTСмотрите список
Veriti Thermal CyclerApplied Biosystems4375786
Vortex MixerVWR10153-838
для пипетокпоследовательностейпоследовательностейпоследовательностей

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370, (2020).
  2. Nagalakshmi, U., et al. The Transcriptional Landscape of the Yeast Genome Defined by RNA Sequencing. Science. 320, 1344-1349 (2008).
  3. Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
  4. Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50, 96(2018).
  5. Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36, 411-420 (2018).
  6. McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 16, 619-626 (2019).
  7. Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19, 224(2018).
  8. Chen, X., Miragaia, R. J., Natarajan, K. N., Teichmann, S. A. A rapid and robust method for single cell chromatin accessibility profiling. Nature Communications. 9, 5345(2018).
  9. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. , 8598(2020).
  10. Clark, B. S., et al. Single-Cell RNA-Seq Analysis of Retinal Development Identifies NFI Factors as Regulating Mitotic Exit and Late-Born Cell Specification. Neuron. 102, 1111-1126 (2019).
  11. Zheng, Y., et al. A human circulating immune cell landscape in aging and COVID-19. Protein Cell. 11, 740-770 (2020).
  12. Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37, 925-936 (2019).
  13. Worthington Biochemical Corporation. Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System. , (2020).
  14. 10x Genomics. Chromium Single Cell 3' Reagent Kits v3 User Guide. , (2020).
  15. Agilent. DNF-468 HS Genomic DNA 50 kb Kit Quick Guide for Fragment Analyzer Systems. , (2015).
  16. ThermoFisher Scientific. Qubit dsDNA HS Assay Kits. ThermoFisher Scientific. , (2015).
  17. 10x Genomics. Chromium Single Cell ATAC Reagent Kits User Guide (v1.1 Chemistry). , (2020).
  18. Weir, K., Kim, D. W., Blackshaw, S. Regulation of retinal neurogenesis by somatostatin signaling. bioRxiv. , (2020).
  19. Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14, 865-868 (2017).
  20. Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10, 2907(2019).
  21. Ma, S., et al. Chromatin Potential Identified by Shared Single-Cell Profiling of RNA and Chromatin. Cell. , (2020).
  22. Buenrostro, J. D., et al. Integrated Single-Cell Analysis Maps the Continuous Regulatory Landscape of Human Hematopoietic Differentiation. Cell. 173, 1535-1548 (2018).
  23. Pliner, H. A., et al. Cicero Predicts cis-Regulatory DNA Interactions from Single-Cell Chromatin Accessibility Data. Molecular Cell. 71, 858-871 (2018).
  24. Granja, J. M., et al. ArchR: An integrative and scalable software package for single-cell chromatin accessibility analysis. BioRxiv. , (2020).
  25. Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177, 1888-1902 (2019).
  26. METABRIC Group. The genomic and transcriptomic architecture of 2,000 breast tumours reveals novel subgroups. Nature. 486, 346-352 (2012).
  27. Izadi, F. Differential Connectivity in Colorectal Cancer Gene Expression Network. Iranian Biomedical Journal. 23, 34-46 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Cell RNA SeqSingle Cell ATAC SeqRetinal Gene ExpressionChromatin AccessibilityGene Regulatory NetworksMULTI Seq BarcodingCell Type IdentificationCell ClusteringSample BarcodingRetinal Development

Related Articles