Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

3D-печать микронесущих с гидрогелем in vitro методом чередования вязко-инерционной струйной обработки

2.5K просмотров

DOI:

10.3791/62252

21 апреля 2021 г.

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь представлена мягкая техника 3D-печати, управляемая чередующимися вязко-инерционными силами, позволяющая строить гидрогелевые микроносители. Самодельные насадки обеспечивают гибкость, что позволяет легко заменять различные материалы и диаметры. Микроносители клеточного связывания диаметром 50-500 мкм могут быть получены и собраны для дальнейшего культивирования.

Аннотация

Микроносители представляют собой шарики диаметром 60-250 мкм и большой удельной площадью поверхности, которые обычно используются в качестве носителей для крупномасштабных клеточных культур. Технология микронесущих культур стала одним из основных методов в цитологических исследованиях и широко используется в области крупномасштабного расширения клеток. Было также показано, что микроносители играют все более важную роль в построении тканевой инженерии in vitro и клиническом скрининге лекарств. Современные методы подготовки микронесущих включают микрофлюидные чипы и струйную печать, которые часто полагаются на сложную конструкцию канала потока, несовместимый двухфазный интерфейс и фиксированную форму сопла. Эти методы сталкиваются с проблемами сложной обработки сопла, неудобными изменениями сопла и чрезмерными экструзионными силами при применении к нескольким биочернам. В этом исследовании был применен метод 3D-печати, называемый чередующимся вязко-инерционным струйным действием, чтобы позволить построить гидрогелевые микроносители диаметром 100-300 мкм. Впоследствии клетки были посеяны на микроносителях для формирования тканевых инженерных модулей. По сравнению с существующими методами, этот метод предлагает свободный диаметр наконечника сопла, гибкое переключение сопел, свободное управление параметрами печати и мягкие условия печати для широкого спектра биологически активных материалов.

Введение

Микроносители представляют собой шарики диаметром 60-250 мкм и большой удельной площадью поверхности и обычно используются для крупномасштабной культивирования клеток1,2. Их внешняя поверхность обеспечивает обильные участки роста для клеток, а внутренняя обеспечивает опорную структуру для пространственной пролиферации. Сферическая структура также обеспечивает удобство в мониторинге и контроле параметров, включая pH, O2 и концентрацию питательных веществ и метаболитов. При использовании в сочетании с биореакторами с перемешиваемым резервуаром микроносители могут достигать более высокой плотности клет....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Клеточная культура

  1. Дополните модифицированную минимальную незаменимую среду Dulbecco с высоким содержанием глюкозы (H-DMEM) 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 1% заменимым раствором аминокислот (NEAA), 1% пенициллином G и стрептомицином и 1% добавкой глутамина в качестве культуральной среды для клеток A549.
  2. Культивирование клеток A549 в CO2-инкубаторе при 37 °C и 5% CO2
  3. Диссоциировать клетки для субкультуры с использованием трипсина примерно при 80% слиянии.
    1. Используйте 3 мл трипсина для обработки клеток в колбе для культуры T75 при 37 °C в течение 3 мин, а затем добавьте 6 мл питательной среды, чтобы....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Печатающие головки с различной скоростью конвергенции и диаметром были изготовлены для достижения печати нескольких типов материалов. Сопла, полученные с увеличением силы натяжения, показаны на рисунке 1В. Сопла были разделены на три области: резервуар (III), сокращение (II) и печатающая головка (I). Резервуар представлял собой необработанную часть сопла, в которой жидкость обеспечивала статическое давление и ввод биочернила для печати. Зона сжатия была основной частью для генерации нисходящ.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Протокол, описанный здесь, содержит инструкции по приготовлению многотипных микроносителей гидрогеля и последующему посеву клеток. По сравнению с методами микрофлюидной чиповой и струйной печати, подход AVIFJ к созданию микронесущих обеспечивает большую гибкость и биосовместимость. Независимое сопло позволяет использовать в этих системах печати широкий спектр легких сопел, включая стеклянные микропипетты. Высококонтролируемая обработка позволяет свободно регулировать параметры, включая объем резервуара, внутренний диамет.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Пекинским фондом естественных наук (3212007), Программой научных исследований Инициативы Университета Цинхуа (20197050024), Фондом весеннего бриза Университета Цинхуа (20201080760), Национальным фондом естественных наук Китая (51805294), Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2018YFA0703004) и Проектом 111 (B17026).

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
A549 клеткиATCCCCL-185Клеточная линия немелкоклеточного рака легкого человека
Светлопольный микроскопOlympusDP70
Конфокальный микроскопNikonTI-FL
Фетальная бычья сыворотка, FBSBI04-001-1ACS
ЖелатинSIGMAG1890
Стеклянные микропипеткисаттер инструментb150-110-10
GlutaMAXGIBCO35050-061
H-DMEMGIBCO11960-044Модифицированный орлиный средний
порошок пероксидазы хренаДульбекко SIGMAP6782
Гидрофобный агент3MPN7026Следуйте инструкциям производителя и используйте после разбавления
устройство Micro-forgenarishigeMF-900
Заменимые аминокислоты, NEAAGIBCO11140-050Заменимые аминокислоты
Пенициллин G и стрептомицинGIBCO15140-122
Чашка ПетриSIGMAP5731-500EA
Pullersutter instrumentP-1000
Альгинат натрияSIGMAA0682
ТрипсинGIBCO25200-056
Раствор коллагена типа I из крысиного хвостаSIGMAC3867

Ссылки

  1. Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction. Biotechnol Advances. 31, 1032-1046 (2013).
  2. Li, B., et al.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги