Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Мультисистемный мониторинг для выявления судорог, аритмий и апноэ у сознательных сдерживаемых кроликов

5.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62256

⸱

27 марта 2021 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Upstate Medical University, 2Department of Neurology, Upstate Medical University, 3Strong Epilepsy Center, Departments of Neurology, Anesthesiology / Perioperative Medicine, & Pediatrics, University of Rochester Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

Используя одновременную видео-ЭЭГ-ЭКГ-оксиметрию-капнографию, мы разработали методику оценки восприимчивости моделей кроликов к развитию спровоцированных аритмий и судорог. Эта новая система записи создает платформу для проверки эффективности и безопасности терапии и может захватывать сложный каскад многосистемных событий, которые завершаются внезапной смертью.

Аннотация

Пациенты с ионными канальнопатиями подвергаются высокому риску развития судорог и фатальных сердечных аритмий. Существует более высокая распространенность сердечных заболеваний и аритмий у людей с эпилепсией (т. Е. Эпилептическое сердце). Кроме того, сообщалось о сердечных и вегетативных нарушениях, связанных с судорогами. 1:1000 пациентов с эпилепсией в год умирают от внезапной неожиданной смерти при эпилепсии (SUDEP). Механизмы SUDEP остаются не до конца понятыми. Электроэнцефалограммы (ЭЭГ) и электрокардиограммы (ЭКГ) являются двумя методами, обычно используемыми в клинических условиях для обнаружения и изучения субстратов / триггеров судорог и аритмий. Хотя многие исследования и описания этой методики проводятся на грызунах, их сердечная электрическая активность значительно отличается от человеческих. В данной статье приведено описание неинвазивного метода записи одновременной видео-ЭЭГ-ЭКГ-оксиметрии-капнографии у сознательных кроликов. Поскольку электрическая функция сердца схожа у кроликов и людей, кролики обеспечивают отличную модель трансляционных диагностических и терапевтических исследований. Помимо изложения методологии сбора данных, мы обсуждаем аналитические подходы к изучению нервно-сердечной электрической функции и патологии у кроликов. Это включает в себя обнаружение аритмии, спектральный анализ ЭЭГ и шкалу судорог, разработанную для сдерживаемых кроликов.

Введение

Электрокардиография (ЭКГ) обычно используется в клинических условиях для оценки динамики сердечной электрической проводимости и процесса электрической активации-восстановления. ЭКГ важна для выявления, локализации и оценки риска развития аритмий, ишемии и инфарктов. Как правило, электроды прикрепляются к груди, рукам и ногам пациента, чтобы обеспечить трехмерный вид сердца. Положительное отклонение производится, когда направление деполяризации миокарда находится к электроду, а отрицательное отклонение производится, когда направление деполяризации миокарда находится вдали от электрода. Электрографические компоненты сердечного цикла включают деполяризацию предсердий (волна Р), предсердно-желудочковую проводимость (интервал P-R), желудочковое возбуждение (комплекс QRS) и реполяризацию желудочков (Т-волна). Существует большое сходство в ЭКГ и мерах потенциала действия у многих млекопитающих, включая людей, кроликов, собак, морских свинок, свиней, коз и лошадей1,2,3.

Кролики являются идеальной моделью для сердечных трансляционных исследований. Сердце кролика похоже на сердце человека по составу ионных каналов и потенциалу действия2,4,5. Кролики были использованы для генерации генетических, приобретенных и медикаментозных моделей сердечных заболеваний2,4,6,7,8. Имеются большие сходства в ЭКГ сердца и потенциальном ответе на действие препаратов у человека и кроликов7,10,11.

Частота сердечных сокращений и процесс электрической активации-восстановления сердца сильно отличаются у грызунов, по сравнению с кроликами, людьми и другими более крупными млекопитающими12,13,14. Сердце грызунов бьется примерно в 10 раз быстрее, чем люди. В отличие от изоэлектрического сегмента ST в ЭКГ человека и кролика,у грызунов14, 15,16нет сегмента ST. Также грызуны имеют форму сигнала QRS-r' с перевернутой Т-волной14,15,16. Измерения интервала QT сильно отличаются у грызунов и людей и кроликов14,15,16. Кроме того, нормальные значения ЭКГ сильно отличаются у людей и грызунов12,15,16. Эти различия в формах волн ЭКГ можно объяснить различиями в морфологии потенциала действия и ионных каналах, которые управляют реполяризацией сердца9,14. В то время как переходный наружу ток калия является основным реполяризующим током в короткой (некупольной) морфологии потенциала сердечного действия у грызунов, у людей и кроликов существует большой купол фазы-2 по потенциалу действия, а отсроченные выпрямительные калийные токи (IKr и IKs)являются основными реполяризующими токами у людей и кроликов4,9,13,17. Важно отметить, что экспрессия IKr и IKs отсутствует/минимальна у грызунов, и из-за кинетики временной активации IKr и IKs она не играет роли в морфологии потенциала сердечного действия9,13. Таким образом, кролики обеспечивают более трансляционную модель для оценки механизмов лекарственно-индуцированных, приобретенных и унаследованных аномалий ЭКГ и аритмий4,7,13. Далее, поскольку многочисленные исследования показали наличие как нейрональных, так и сердечных электрических аномалий при первичных сердечных (синдром удлиного QT18,19,20)или нейронных заболеваниях (эпилепсия21,22,23,24),важно изучить основные механизмы на животной модели, которая близко воспроизводит физиологию человека. В то время как грызунов может быть достаточно для моделирования человеческого мозга, грызуны не являются идеальной моделью физиологии сердца человека7.

Электроэнцефалография (ЭЭГ) использует электроды, обычно помещаемые на кожу головы или интракраниально, для записи электрической функции коры. Эти электроды могут обнаруживать изменения скорости срабатывания и синхронности групп близлежащих пирамидальных нейронов в коре головного мозга25. Эта информация может быть использована для оценки мозговой функции и состояния бодрствования / сна. Кроме того, ЭЭГ полезны для локализации эпилептиформной активности и отличия эпилептических припадков от неэпилептических событий (например, психогенной неэпилептиформной активности и кардиогенных событий). Чтобы диагностировать тип эпилепсии, провоцирующие факторы и происхождение припадка, больные эпилепсией подвергаются различным маневрам, которые могут вызвать приступ. Различные методы включают гипервентиляцию, фотическую стимуляцию и лишение сна. Данный протокол демонстрирует использование фотической стимуляции для индуцирования ЭЭГ аберраций и судорог у кроликов26,27,28,29.

Одновременные видеозаписи ЭЭГ-ЭКГ широко используются у людей и грызунов для оценки поведенческой, нейронной и сердечной деятельности во время преиктального, иктального и постиктального состояний30. В то время как в нескольких исследованиях проводились записи ЭЭГ и ЭКГ отдельно у кроликов4,31,32,33,система получения и анализа одновременного видео-ЭЭГ-ЭКГ у сознательного сдерживаемого кролика не является устоявшейся34. В данной работе описывается разработка и реализация протокола, который может записывать одновременные данные видео-ЭЭГ-ЭКГ-капнографии-оксиметрии у сознательных кроликов с целью оценки нервно-сердечной электрической и дыхательной функции. Результаты, полученные с помощью этого метода, могут указывать на восприимчивость, триггеры, динамику и соответствие между аритмиями, судорогами, нарушениями дыхания и физическими проявлениями. Преимущество нашей экспериментальной системы заключается в том, что мы приобретаем сознательные записи без необходимости седативного средства. Кролики остаются в ограничителях в течение ≥5 ч, с минимальными движениями. Поскольку анестетики возмущают нейронную, сердечную, дыхательную и вегетативную функции, записи во время сознательного состояния обеспечивают большинство физиологических данных.

Эта система записи может в конечном итоге обеспечить подробную информацию для продвижения понимания неврологических, сердечных и дыхательных механизмов внезапной неожиданной смерти при эпилепсии (SUDEP). В дополнение к неврологическому и сердечному мониторингу выше, последние данные также подтверждают роль дыхательной недостаточности как потенциального вклада в внезапную смерть после припадка35,36. Для мониторинга респираторного статуса кроликов были внедрены оксиметрия и капнография для оценки состояния дыхательной системы до, во время и после припадка. Представленный здесь протокол был разработан с целью оценки порога фармакологических и фотических стимулов, вызванных припадками кроликов. Этот протокол может обнаруживать тонкие аномалии ЭЭГ и ЭКГ, которые могут не привести к физическим проявлениям. Кроме того, этот метод может быть использован для тестирования сердечной безопасности и антиаритмической эффективности новых лекарств и устройств.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами Национального института здравоохранения (NIH) и Комитетом по институциональным уходу и использованию животных (IACUC) Медицинского университета штата Штата. Кроме того, описание этого протокола приведено на рисунке 1.

1. Подготовка записывающего оборудования

  1. Подключите компьютер к усилителю с помощью 64-контактной головной коробки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждое животное имеет четыре прямых подкожных штифтовых электрода (7 или 13 мм) для ЭЭГ из 4 квадрантов головы, 3 изогнутых подкожных штифтовых электрода (13 мм, угол 35°) для ЭКГ (треугольник Эйнтховена), 1 изогнутый подкожный заземляющий электрод на правой ноге и 1 прямой подкожный электрод из головы на центре головы.
  2. Чтобы сделать каждый8-й контакт на головном блоке эталоном, обновите настройки программного обеспечения для сбора, вкладку сбора, чтобы эталонный электрод был «независимым»(т. Е. Режим исследования).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволяет записывать до 7 животных одновременно, каждый с 7 электродами плюс специальный опорный электрод и заземляющий электрод, все через один усилитель, дигитайзер и компьютер. Все электроды приобретаются в виде униполярных каналов и сравниваются с эталонным (центром головки). Дополнительные биполярные и дополненные конфигурации/монтажи свинца могут быть настроены во время или после записи. Поскольку установка имеет возможность записи от нескольких животных одновременно, заземляя электрод от каждого животного подключается параллельно наземному входу на усилителе(рисунок 2).
  3. Выньте кроликов из клетки и взвесьте их, чтобы рассчитать соответствующую дозу препарата для каждого животного. Поместите кроликов в транспортную переноску и вынесите их в отдельное помещение, чтобы минимизировать стресс для неопытных животных. В этом исследовании использовались самцы и самки новозеландских белых кроликов, а также их последующее потомство. Эксперименты проводились на кроликах > 1-месячного возраста. На момент эксперимента эти кролики весили от 0,47 до 5,00 кг.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку кролики должны находиться в одной комнате и на виду у камеры, не следует полностью изолировать кроликов. Существует потенциал для визуальных и слуховых проявлений от одного кролика, стрессового другого кролика. Поэтому идеально иметь одного кролика в комнате за раз, что делается для экспериментов с фотической стимуляцией. Для всех остальных экспериментов кролики максимально разнесаются, сохраняя при этом всех их в поле зрения видеокамеры. В идеале используются барьеры или одновременно изучается только одно животное. Это не было серьезным путаницей, так как частотасердечных колебаний кроликов оставалась довольно стабильной во время экспериментов, и было частое присутствие веретен сна. Записи от нескольких животных одновременно гарантируют, что данные как контрольных, так и тестовых животных получены в одних и тех же условиях окружающей среды.

2. Имплантация электродов ЭЭГ-ЭКГ и подключение респираторных мониторов

  1. Вынь один кролик из переноски и положите на колени сидящего следователя.
  2. Держите кролика вертикально и держите егоблизко к телу следователя.
  3. Опуститекроликав лежачее положение, с головой кролика наколеняхисследователя, а головойкроликаниже, чем остальная часть его тела.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот маневр расслабляет животное и сводит к минимуму вероятность того, что оно пытается двигаться или убегать при размещении электродов.
  4. Теперь, когда кролик закреплен в положении лежа на спине, попросите второго исследователя распространить мех до тех пор, пока кожа не будет идентифицирована и изолирована от подлежащей ткани.
  5. Вставьте35° изогнутые электроды подкожно в каждую подмышечную впадина(рисунок 3А).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Электроды должны быть проталкиваемы так, чтобы они надежно зацеплялись за кожу, но не проникали в более глубокие структуры. Ввод и выход электрода из кожи (насквозь) снижает вероятность смещения поводков при помещении кролика в ограничитель или при его движении во времяэксперимента (рисунок 3B). Все электроды стерилизуют 70% этанолом перед установкой.
  6. Место ведет на груди с задней и левой передних конечностей и на брюшке передней к левой задней конечности. Поместите заземленный штифт-электрод с передней правой задней конечностью на живот(рисунок 4А).
  7. Как только все поводки ЭКГ правильно размещены, верните кролика в положение лежа, когда поводки проходят вверх по одной стороне живота кролика, и переместе кролика в ограничитель соответствующего размера (например, 6" x 18" x 6").  Помещая кролика в ограничитель, потяните свободную проволоку вверх, чтобы кролик не вытаскивал электроды ногами. Приклейте провода к боковой стороне ограничителя, чтобы они не попали под кролика во времяэксперимента (рисунок 4В).
  8. Закрепите кролика в ограничитель, опуская удерживающее устройство на шее и запирая его на месте. Кроме того, переместите задние конечности вверх под животным и закрепите заднее удерживающее устройство.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нужно уметь помещать 1-2 пальца в пространство под шеей, чтобы убедиться, что оно не слишком плотное. В частности, во время экспериментов, где может быть двигательное движение, важно ужесточить удерживающее устройство, чтобы свести к минимуму движение, потенциальные травмы позвоночника, вывих конечностей и возможность выгнать заднее удерживающее устройство(рисунок 4B). Кролики содержались в ограничительнике в течение ~ 5 ч без каких-либо проблем, связанных с увеличением движения или признаками обезвоживания.
    1. Для маленьких кроликов (например, менее 2 месяцев) поместите резиновую бустерную подушку под животное, чтобы поднять кролика вверх, что не позволяет кролику упираться шеей в нижнюю часть подголовника(рисунок 4C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Внезапное падение частоты дыхания и сердечного ритма может быть вторичным по отношению к ущемлению шеи. Если это произойдет, ослабьте ограничитель шеи и поднимите головукролика,чтобы облегчить любое сжатие шеи.
    2. Когда заднее удерживающее устройство не отслеживает близко спину / позвоночник кролика, поместите распорку из ПВХ, чтобы предотвратить любое движение, которое может привести к травмам позвоночника.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Например, труба ПВХ длиной ~14 см x 4" внутреннего диаметра, с нижними 25-33% удаленными, может быть помещена поверх кролика с пеной для обеспечения соответствующего удерживающего устройства(рисунок 4C).
  9. Теперь, когда кролик надежно помещен в ограничитель, вставьте в кожу головы подкожные прямые штифт-электроды диаметром 7-13 мм(рисунок 3А). Используя угол подхода входа под углом45°, проведите провода между ушами и свободно привяжите провода к ограничителю за головой, чтобы сохранить размещение свинца. Поместите 5 ЭЭГ в следующие положения: правый передний, левый передний, правый затылочный, левый затылочный и центральный опорный (Cz) свинц в точке между другими 4 отведениями(рисунок 4D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Электроды правильно размещены, когда они расположены в подкожной клетчатке против черепа. Такое расположение сводит к минимуму артефакты из носа, ушей и других окружающих мышц. Некоторые артефакты из ритмичного движения носа неизбежны. Передние отведки ЭЭГ должны быть размещены медиаль к глазамкроликаи указываться с передней стороны. Затылочные отведки должны быть размещены с передней стороны к ушам и будут указывать в медиальном направлении. Cz помещается в центр верхней части головы в точке, которая находится между всеми 4 электродами (на полпути между Lambda и Bregma, вдоль линии шва). Штифт электрода Cz указывает с передней стороны.
    1. Пропустите провода ЭЭГ вверх между ушами, чтобы кролик не пытался укусить провода.
  10. Прикрепите пульсоксиметр плетизмограф к уху кролика над краевой веной уха.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Может потребоваться сбрить лишние волосы из уха, чтобы улучшить сигнал, или использовать марлю, чтобы держать датчик на месте.
    1. Убедитесь, что частота сердечных сокращений на плетизмографии коррелирует с частотой сердечных сокращений от ЭКГ и что отображается насыщение кислородом(рисунок 5C).
  11. Аккуратно поместите маску для лица с капнографической трубкой над ртом и носом кролика(рисунок 4H). Закрепите маску с помощью веревки, обернутой вокруг маски, и прикрепите оба конца веревки к ограничителем. Прикрепите другой конец трубки капнографии к монитору жизненно важных показателей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно предотвратить наложение струны на глаза кролика во время эксперимента. Для этого приклейте веревку к середине ограничителя между ушами кролика. Для того чтобы улучшить сигнал капнографии, создайте односторонний клапан с использованием ленты и тонкого куска нитрила, который позволит кислороду входить в Т-образную часть и направит выдыхаемый CO2 в капнографическую трубку(рисунок 4I).

3. Запись видео-ЭЭГ-ЭКГ

  1. Выполняйте запись видео-ЭЭГ-ЭКГ с использованием коммерчески доступного программного обеспечения ЭЭГ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Биопотенциальные провода и видео блокируются по времени для последующей корреляции электрических и видеосигналов (например, всплеск ЭЭГ с миоклоническим рывком).
  2. Подтвердите оптимальное подключение без дрейфа базовой линии, без электрического шума 60 Гц и высокого отношения сигнал/шум. В частности, убедитесь, что каждая фаза формы сердечного волна может быть визуализирована на ЭКГ и что дельта, тета и альфа-волны визуально не скрыты высокочастотным шумом на ЭЭГ.
    1. Если все электроды производят чрезмерное количество шума, отрегулируйте центральный опорный ввод. Если только один электрод чрезмерно шумный, то протолкнуть этот электрод глубже в кожу или переместить его до тех пор, пока не будет обнажен металл.
  3. Отрегулируйте видео так, чтобы всех кроликов можно было увидеть одновременно, что позволяет соотнести двигательную активность с результатами ЭЭГ(рисунок 5А).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Система позволяет одновременно записывать ЭЭГ/ЭКГ/оксиметрию/капнографию от 7 кроликов.
  4. Начните базовую запись с каждого животного минимум на 10-20 минут или до тех пор, пока частота сердечных сокращений не стабилизируется до спокойного расслабленного состояния (200-250 пп/мин) и кролики не проявляют больших движений в течение не менее 5 мин. Получение полной полосы пропускания электрографических данных без каких-либо фильтров. Для лучшей визуализации данных устанавливается низкочастотный фильтр (=фильтр высоких частот) при 1 Гц и высокочастотный фильтр (=фильтр нижних частот) при 59 Гц.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Еще одним признаком того, что кролик расслаблен, является начало шпиндели сна ЭЭГ (обсуждается позже).
  5. Добавьте привязанные ко времени заметки во время эксперимента в режиме реального времени, чтобы указать время вмешательств (например, доставка лекарств) и нервно-сердечные события (например, всплеск ЭЭГ, двигательные судороги, эктопический ритм и аритмии), а также моторные / исследовательские артефакты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за частоты, с которой исследователю необходимо применять вмешательство (например, фотическая стимуляция, доставка лекарств), чтобы свести к минимуму стресс от того, что исследователь входит и выходит из комнаты и открывает/ закрывает дверь, исследователь остается на противоположной стороне комнаты на протяжении всего эксперимента. Исследователь сидит как можно дальше от животного и остается неподвижным и спокойным, чтобы свести к минимуму потенциальное беспокойство животных.

4. Экспериментальные протоколы

ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый из следующих экспериментов проводится в отдельные дни, если они проводятся на одном и том же животном. Существует 2-недельная задержка между пероральными тестами сложных исследований лекарств и острым терминальным просудорожным лекарственным исследованием. При необходимости проводится эксперимент с фотической стимуляцией, за которым следует 30-минутное ожидание, а затем исследование препарата PTZ.

  1. Чтобы позволить кроликам акклиматизироваться в ограничителях и чтобы исследователь объективно подтвердил стабилизацию кардиореспираторных показателей, инструментирование всех кроликов кардиореспираторными и нейронными датчиками и выполнение непрерывного видеомониторса в течение > 1 час, 1 - 3 раза на каждое животное.
  2. Эксперимент с фотической стимуляцией
    1. В дополнение к способу, описанному выше, поместите источник света с круглым отражателем 30 см перед кроликом на уровне глаз, при этом интенсивность вспышки установлена на максимум (16 кандел)29. Источник света обозначен белой точкой на рисунке 4E.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения светочувствительного отклика37следует использовать тускло освещенную комнату.
    2. Поскольку глазакроликанаходятся на стороне головы, а не на передней части его головы (как у людей), поместите 2 зеркала по обе стороны от кролика и 1 позади кролика, чтобы свет проник в глазакролика.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плоское зеркало высотой ≥ 20 см, длиной ≥ 120 см создает треугольное ограждение вокруг кролика,чтобы гарантировать, что мигающий свет попадает в глаза кролика, как показано на рисунке 4E.
    3. Подключите источник света к контроллеру с регулируемой скоростью, интенсивностью и длительностью.
    4. Записывайте видео с помощью камеры с возможностью записи красным светом и инфракрасным светом.
    5. Подвергайте кроликов воздействию каждой частоты в течение 30 с с открытыми глазами, а затем еще 30 с хирургической маской, закрывающей их лицо, чтобы имитировать или вызывать закрытие глаз на каждой частоте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предыдущие исследования показали, что закрытие глаз является наиболее провокационным маневром для получения фоточувствительности к припадку29. Кроме того, 10% светочувствительных пациентов проявляют только электроэнцефалографические признаки, в то время как их глаза закрыты29. Припадок можно выявить клинически, наблюдая за наличием миоклонических рывков головы и всего тела, клонуса или тонического состояния. Запись ЭЭГ более тщательно анализируется на электроэнцефалографическую корреляцию (например, шипы, полижиксы и ритмические разряды) с двигательными проявлениями для окончательного диагноза судорожной активности. Движения, при которых ЭЭГ скрыт мышечным артефактом или волнами неопределенной эпилептогенности, должны быть рассмотрены эпилептологом для подтверждения.
    6. Увеличьте частоту фотического стимулятора с 1 Гц до 25 Гц с шагом 2 Гц. Затем выполняют тот же протокол фотостимуляции, но на этот раз уменьшают частоту с 60 Гц до 25 Гц с шагом 5 Гц.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если у кролика случился припадок, эксперимент следует прекратить. Продолжайте наблюдать за кроликом в течение 30 минут. Затем верните кролика в комнату и контролируйте каждые 1 ч в течение 3 ч для полного выздоровления. Однако, если фотическая стимуляция вызывает фотопароксизмальный ответ, то остальные восходящие частоты пропускаются, и серия начинается снова с опускания с 60 Гц до тех пор, пока не произойдет другой фотопароксизмальный ответ. Это позволит определить верхний и нижний пороги фотической стимуляции. Задержка не требуется, так как фотопароксизмальный ответ прекратится после прекращения фотической стимуляции. Если неясно, произошел ли фотопароксизмальный отклик, частота повторяется после задержки 10 с38.
    7. После завершения эксперимента удалите у кролика отводки ЭЭГ и ЭКГ и верните его в домашнюю клетку для обычного ухода со стороны персонала животноводства.
  3. Пероральный прием лекарственных препаратов
    1. Так как многие препараты принимаются перорально, готовят пероральные соединения, смешивая с пищевым яблочным соусом. Смешайте 0,3 мг/кг Е-4031 в 3 мл яблочного соуса и загрузите в шприц для перорального орошения 3 мл без иглы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Таким образом можно вводить несколько лекарств, в том числе тестовые соединения, препараты, которые, как известно, изменяют продолжительность QT (моксифлоксацин или E-4031), а также отрицательный контроль или транспортное средство. Некоторые препараты не доступны в составе внутривенного препарата. Кроме того, многие лекарства назначаются в пероральном составе, и поэтому внутривенное введение может иметь меньшую клиническую значимость.
    2. Поднимите верхние губы и сдвиньте кончик орального шприца в сторону ртакролика,которая неограниченазубами кролика, и введите все лекарства и яблочный соус в роткролика.
    3. Продолжайте запись видео-ЭЭГ-ЭКГ в течение 2 ч, а затем верните животное в домашнюю клетку для рутинного ухода.
    4. На экспериментальный день 2 и 3 подключите кролика к видео-ЭЭГ-ЭКГ, запишите 10-20 мин исходного уровня, затем введите тот же препарат и записывайте в течение 2 ч.
    5. После 1 недели вымывания выполняют 10-20 мин исходного уровня, а затем дают каждому кролику разовую дозу плацебо в течение 3 дней подряд и записывают в течение 2 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Введение пероральных препаратов может быть разработано как перекрестное исследование, в котором плацебо дается в течение 1 недели, а лекарство на 2-й неделе.
  4. Эксперимент с внутривенным введением медикаментов (Пентилентетразол, PTZ)
    1. Для того чтобы визуализировать краевую ушную вену, побрейте заднюю поверхностьухакролика. Используйте 70% этаноловую салфетку для дезинфекции участка и расширения краевой венки уха. На это указывает черный пунктирный овал на рисунке 4F.
    2. В этот момент один экспериментатор прикроет лицокроликарукой, чтобы уменьшить стресс от процедуры для кролика. Второй экспериментатор осторожно канюлирует краевую ушную вену стерильным 25-G ангиокатетером.
    3. Как только катетер окажется в вене, поместите стерильную инъекционную пробку на конец катетера, чтобы игла могла вводить лекарство внутривенно. Расположение впрыскной пробки обозначено синим кружком на рисунке 4G.
    4. Сделайте шину, обернув марлю 4 х 4 дюйма скотчем так,чтобы она образовала форму трубки и поместила ее внутрь уха кролика. Затем прикрепите шину к уху так, чтобы катетер был закреплен на месте и оставался в вертикальном положении, подобно некатетеризированному уху.
    5. Вводят 1 мл 10 единиц USP на мл гепаринизированного физиологического раствора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Катетер и сосуд должны быть заметно очищены от воздуха и оставаться патентованными. Если катетер не находится в сосуде, шприц не будет легко давить и в подкожной клетчатке будет накапливаться физиологический раствор.
    6. Давайте кроликам дополнительные дозы ПТЗ внутривенно от 1 мг / кг до 10 мг / кг с шагом 1 мг / кг каждые 10 мин. Сделайте пометку в начале каждой дозы, чтобы указать, какое животное вводится и концентрацию лекарства.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволяет оценить острые и аддитивные эффекты введения PTZ. Альтернативно, для дальнейшей оценки хронических эффектов низких доз ПТЗ кролику дают повторные дозы при каждой низкой концентрации дозы, 7 доз по 2 мг/кг, 3 дозы по 5 мг/кг, затем 3 дозы по 10 мг/кг, каждая доза отделяется 10 мин.
    7. После каждой дозы тщательно контролируйте видео-ЭЭГ-ЭКГ-капнографию-оксиметрию на наличие любых нервно-сердечных электрических и дыхательных аномалий и визуальных признаков эпилептиформной активности. Обратите внимание на эти изменения в режиме реального времени и во время пост-анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Судорожная активность часто начинается в течение 60 с после введения PTZ.

5.Завершение экспериментов, не являющихся выжившими.

  1. Если кролик не испытал внезапной смерти в ходе эксперимента PTZ, вводят 1 мл 390 мг / мл пентобарбитала натрия на каждые 4,54 кг массы тела (или 1,5 мл всем кроликам), а затем 1 мл нормального физиологического раствора. Следите за ЭКГ, чтобы убедиться, что у кролика остановка сердца.
  2. Как только кролик испытает остановку сердца, быстро выполните некропсию, чтобы только что изолировать различные органы, включая сердце, легкие, печень, мозг, скелетные мышцы и любую другую ткань, необходимую для последующего молекулярного / биохимического анализа.
  3. Утилизируйте кролика в соответствии с институциональной политикой.

6. Анализ ЭКГ

  1. Используйте коммерчески доступное программное обеспечение для анализа ЭКГ для визуального осмотра ЭКГ, а также для выявления периодов тахикардии, брадикардии, эктопических ударов и других аритмий(рисунок 6). Чтобы уменьшить объем данных для просмотра, создайте тахограмму, которая повысит легкость, с которой можно выявить периоды тахикардии, брадикардии или нарушения интервала ОР.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Аномалии ЭКГ (например, удлинение QTc) и аритмии выявляются вручную путем обзора ЭКГ на наличие аномалий в скорости (например, бради-/тахи-аритмии), ритма (например, преждевременные предсердные/желудочковые комплексы), проводимости (например, атрио-желудочковая блокада) и формы волны (например, несинусовая предсердная/желудочковая тахикардия и фибрилляция). Аритмии можно обнаружить, просмотрев тахограмму на наличие нарушений в интервале ОР. Тахикардию можно выявить по участкам тахограммы, в которых частота сердечных сокращений выше 300 ударов в минуту. Брадикардия выявляется, когда частота сердечных сокращений составляет менее 120 ударов в минуту на тахограмме.
  2. Используя коммерчески доступное программное обеспечение для анализа ЭКГ, выполняйте стандартные измерения ЭКГ (частота сердечных сокращений, интервалы сердечного цикла) на исходном уровне и при провокации (например, исследователь манипулирует животным, введение тестовых агентов и изменения ЭКГ, вызванные судорогами).

7. Анализ видео-ЭЭГ

  1. Визуально прокрутите видео и трассировку ЭЭГ с помощью коммерчески доступного программного обеспечения для идентификации базовогосигнала (рисунок 7)и наличия ожидаемых разрядов ЭЭГ, таких как шпиндели сна(рисунок 8)и вершинные волны(рисунок 9).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя полнополупточные электрографические данные получаются без каких-либо фильтров, данные должны отображаться с низкочастотнымфильтром (т.е. фильтром высоких частот), установленным на 1 Гц, и на основе теоремы Найквиста высокочастотный фильтр (т.е. фильтр нижних частот) установлен на частоте 120 Гц, чтобы избежать пропуска какого-либо сигнала. Фильтры могут быть отрегулированы для обеспечения лучшей визуализации и снижения шума (например, 1-59 Гц) при просмотре низкочастотной (<25 Гц) активности ЭЭГ.
  2. В дополнение к капнографическим формам волн, используйте артефакт движения носа на ЭЭГ, чтобы определить наличие и отсутствие дыхания. Это также может быть связано с движениями носа, наблюдаемыми на видеозаписи.
  3. Визуально прокрутите видео и трассировку ЭЭГ с использованием коммерчески доступного программного обеспечения, чтобы различать эпилептические и неэпилептические (например, сознательные) движения в течение не менее 1 мин после каждой дозы PTZ(рисунок 10). Сканирование межуставных эпилептических выделений и изменений ЭЭГ до, во время и после приступов. Припадок может быть идентифицирован клинически, наблюдая за наличием миоклонических толчков головы и всего тела, клонуса или тонического состояния с коррелятом ЭЭГ. Изменения ЭЭГ могут включать всплески ЭЭГ, поли-шипы и ритмические разряды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Движения, при которых ЭЭГ скрыт мышечным артефактом или волнами неопределенной эпилептогенности, должны быть рассмотрены неврологом для подтверждения. Может быть выгодно сфокусировать видео на одном кролике, чтобы более внимательно просмотреть его поведение, а также его записи ЭЭГ и ЭКГ(рисунок 5B).
  4. Оценка видео-ЭЭГ для судорог основана на типе и тяжести двигательных проявлений, которые обычно возникают в течение 1 мин после инъекции PTZ(таблица 1).
  5. После эксперимента с фотической стимуляцией проанализируйте затылочные провода ЭЭГ на наличие и отсутствие затылочно-движущего ритма, создав график спектрального анализа в коммерчески доступном программном обеспечении для анализа ЭЭГ. Затылочное движение ритма создаст пик в спектральном анализе, соответствующий частоте фотического стимулятора(рисунок 11).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фотическая стимуляция может производить гармонические пики частоты в дополнение к пику фундаментальной частоты.

7. Анализ дыхательной функции

  1. Просмотрите выходные данные монитора жизненно важных показателей(рисунок 4I)и экспортируйте сигнал для дальнейшего анализа.
  2. Обратите внимание на изменение дыхательного паттерна во время припадка и после припадка, особенно в точку времени, когда начинается апноэ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Описанный выше метод способен обнаруживать аномалии в системе электропроводности головного мозга и сердца, а также нарушения дыхания. Программное обеспечение для сбора данных используется для оценки морфологии ЭКГ и обнаружения любых аномальных частот сердечных ритмов, нарушений проводимости или ритмов ЭКГ (внебольничные / желудочковые эктопические удары и бради-/ тахи-аритмии)(рисунок 6). В дополнение к визуализации морфологии ЭКГ, следы анализируются для ко...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Эта экспериментальная установка облегчает детальные одновременные видеозаписи и анализы видео-ЭЭГ-ЭКГ-оксиметрии-капнографии у кроликов, особенно в моделях сердечных и/или нейронных заболеваний. Результаты данной статьи показывают, что данный метод способен выявлять судороги и аритмии и дифференцировать их от электрографических артефактов. Ожидаемые результаты были получены при даче кроликам просудорожного вещества, что индуцировало судороги. Данные, полученные из видеозаписей ЭЭГ, можно было дополнительно проанализирова...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы признают, что это исследование было поддержано грантами Американской кардиологической ассоциации, Американского общества эпилепсии и Департамента фармакологии SUNY Upstate.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,9% хлорида натрия для орошения, USP - гибкий контейнерPFIZER (HOSPIRA)7983-09Разбавитель
10cc шприц Luer Lock с иглой 20G x 1"Sur-VetSS-10L2025Используется в качестве промывки после инъекции препарата
4x4 марлевые губкиFisher Scientific22-415-469Свернутый в тюбике для шины уха с помощью ангиокатетера
Яблочный соусKirkland897971Транспортное средство для пероральных препаратов
КомпьютерDellOptiplex 5040Компьютер сбора данных
E-4031Tocris1808Агент известен тем, что удлиняет интервал QT
Электрод ЭКГRhythmLinkRLSND116-2,513 мм 35 градусов изогнутый (диаметр 0,4 мм) подкожный штифтовый электрод
Электрод ЭЭГRhythmLinkRLSP5135-круточные прямые (диаметр 0,4 мм) подкожные штифтовые электроды
EEGLAB (2020)Центр вычислительной нейронауки им. ШварцаОткрытый доступМожет выполнять спектральный анализ ЭЭГ
Адаптер Ethernet-to-ethernetLinksysUSB3G16Адаптер для подключения камеры к компьютеру
Эвтаназия-III РастворMed-PharmexANADA 200-280Содержит пентобарбитал натрия и фенитоин натрия, контролируемое вещество
Пенная прокладкаДженерикН/ДСнижает давление, оказываемое на шею маленьких кроликов ограничителем с целью предотвращения неблагоприятных кардиореспираторных эффектов компрессии шеи
Heparin Lock FlushMedlineEMZ50051240Для поддержания проходимости ангиокатетера
IR LightBoschEX12LED-3BD-8WОблегчает запись в темноте
LabChart Pro (2019, версия 8.1.16)ADInstrumentsN/AАнализ ЭКГ
JELCO PROTECTIV Safety I.V. Катетеры, 25 калибрSmiths Medical3060Используется для катетеризации краевой ушной вены
MATLAB (R2019b, Update 5)MathWorksN/AТребуется для запуска EEGLAB
МикрофонSony StereoECM-D570PЗапись слышимых проявлений судорог
Микропоры Медицинская лента, бумага, белый3M1530-1Используется для фиксации проводов и создания ушной шины
Natus NeuroWorksNatusLC101-8Программное обеспечение для сбора и обзора
Пентилентретразол (1 - 10 мг/кг всегда в объеме 1мл)Sigma-Aldrich88580Разведения, приготовленные в физрастворе
Фотоический стимуляторТраваPS22Стимулятор для управления частотой, задержкой, продолжительностью, интенсивностью световых импульсов
Пластиковый органайзер / связующий12Vwire.comLM-12-100-BLKПучок проводов для снижения шума
PS 22 Фотический стимуляторТравяные инструментыBZA641035Стробоскоп с регулируемой частотой вспышки, задержкой и интенсивностью
Трубка из ПВХОбщийН/ДПредотвращает удары задних лап маленькими кроликами и травму позвоночника
Quantum AmplifierNatus13926Amplifier / digitizer
Quantum HeadBox AmplifierNatus2213464-контактный коммутационный бокс
Rabbit RestrainerPlas-Labs501-TCДоступны ограничители для кроликов различных размеров. 6" x 18" x 6" в этом исследовании.
Резиновая накладка (усилитель)GenericN/AПоднимает маленьких кроликов вверх в удерживателе для предотвращения сдавливания шеи
SpO2 ушной зажимNONIN61000PureSAT/SpO2
Адаптер для датчикаNONIN13931XPOD PureSAT/SpO2
SRG-X120 1080p PTZ-камера с выходом HDMI, IP и 3G-SDI Камера
Sony SRG-X120 ImpelaTerumo Sur-Vet Туберкулиновый шприц 1cc 25G x 5/8" Regular LuerSur-Vet13882Используется для внутривенного введения лекарств
Ветеринарная инъекционная пробка Luer LockSur-VetSRIP2VИнъекционная пробка для введения иглы для внутривенного введения лекарств
Webcol Alcohol Prep, стерильный, большой, 2-слойныйCovidien5110Для подготовки ушной вены перед катетеризацией

Ссылки

  1. Kaese, S., et al. The ECG in cardiovascular-relevant animal models of electrophysiology. Herzschrittmacherther Elektrophysiology. 24 (2), 84-91 (2013).
  2. Pogwizd, S. M., Bers, D. M. Rabbit models of heart disease. Drug Discovery Today: Disease Models. 5 (3), 185-193 (2008).
  3. O'Hara, T., Rudy, Y. Quantitative comparison of cardiac ventricular myocyte electrophysiology and response to drugs in human and nonhuman species. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 302 (5), 1023-1030 (2012).
  4. Brunner, M., et al. Mechanisms of cardiac arrhythmias and sudden death in transgenic rabbits with long QT syndrome. Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2246-2259 (2008).
  5. Lengyel, C., et al. Pharmacological block of the slow component of the outward delayed rectifier current (I(Ks)) fails to lengthen rabbit ventricular muscle QT(c) and action potential duration. British Journal of Pharmacology. 132 (1), 101-110 (2001).
  6. Baczko, I., Hornyik, T., Brunner, M., Koren, G., Odening, K. E. Transgenic rabbit models in proarrhythmia research. Frontiers in Pharmacology. 11, 853(2020).
  7. Rudy, Y., et al. Systems approach to understanding electromechanical activity in the human heart: a national heart, lung, and blood institute workshop summary. Circulation. 118 (11), 1202-1211 (2008).
  8. Zhu, Y., Ai, X., Oster, R. A., Bers, D. M., Pogwizd, S. M. Sex differences in repolarization and slow delayed rectifier potassium current and their regulation by sympathetic stimulation in rabbits. Archives. 465 (6), 805-818 (2013).
  9. Nerbonne, J. M., Nichols, C. G., Schwarz, T. L., Escande, D. Genetic manipulation of cardiac K(+) channel function in mice: what have we learned, and where do we go from here. Circulation Research. 89 (11), 944-956 (2001).
  10. Eckardt, L., et al. Drug-related torsades de pointes in the isolated rabbit heart: comparison of clofilium, d,l-sotalol, and erythromycin. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 32 (3), 425-434 (1998).
  11. Baczko, I., Jost, N., Virag, L., Bosze, Z., Varro, A. Rabbit models as tools for preclinical cardiac electrophysiological safety testing: Importance of repolarization reserve. Progress on Biophysics and Molecular Biology. 121 (2), 157-168 (2016).
  12. Richig, J. W., Sleeper, M. M. Electrocardiography of Laboratory Animals. , Elsevier Inc. (2019).
  13. Edwards, A. G., Louch, W. E. Species-dependent mechanisms of cardiac arrhythmia: A cellular focus. Clinical Medicine Insights. Cardiology. 11, 1179546816686061(2017).
  14. Salama, G., London, B. Mouse models of long QT syndrome. Journal of Physiology. 578, Pt 1 43-53 (2007).
  15. Zhang, Y., Wu, J., King, J. H., Huang, C. L., Fraser, J. A. Measurement and interpretation of electrocardiographic QT intervals in murine hearts. American Journal of Physiology. Heart and Circulation Physiology. 306 (11), 1553-1557 (2014).
  16. Auerbach, D. S., et al. Altered cardiac electrophysiology and SUDEP in a model of dravet syndrome. PLoS One. 8 (10), 15(2013).
  17. Aiba, T., Tomaselli, G. F. Electrical remodeling in the failing heart. Current Opinion in Cardiology. 25 (1), 29-36 (2010).
  18. Auerbach, D. S., et al. Genetic biomarkers for the risk of seizures in long QT syndrome. Neurology. 87 (16), 1660-1668 (2016).
  19. Anderson, L. L., et al. Antiepileptic activity of preferential inhibitors of persistent sodium current. Epilepsia. 55 (8), 1274-1283 (2014).
  20. Johnson, J. N., et al. Identification of a possible pathogenic link between congenital long QT syndrome and epilepsy. Neurology. 72 (3), 224-231 (2009).
  21. Devinsky, O., Hesdorffer, D. C., Thurman, D. J., Lhatoo, S., Richerson, G. Sudden unexpected death in epilepsy: epidemiology, mechanisms, and prevention. Lancet Neurology. 15 (10), 1075-1088 (2016).
  22. Bagnall, R. D., et al. Exome-based analysis of cardiac arrhythmia, respiratory control, and epilepsy genes in sudden unexpected death in epilepsy. Annals in Neurology. 79 (4), 522-534 (2016).
  23. Frasier, C. R., et al. Channelopathy as a SUDEP biomarker in dravet syndrome patient-derived cardiac myocytes. Stem Cell Reports. 11 (3), 626-634 (2018).
  24. Glasscock, E. Genomic biomarkers of SUDEP in brain and heart. Epilepsy and Behavior. 38, 172-179 (2014).
  25. Olejniczak, P. Neurophysiologic basis of EEG. Journal of Clinical Neurophysiology. 23 (3), 186-189 (2006).
  26. Gastaut, H., Hunter, J. An experimental study of the mechanism of photic activation in idiopathic epilepsy. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 2 (3), 263-287 (1950).
  27. Fisher, R. S., et al. Photic- and pattern-induced seizures: A review for the Epilepsy Foundation of America Working Group. Epilepsia. 46 (9), 1426-1441 (2005).
  28. Specchio, N., et al. Diagnosing photosensitive epilepsy: fancy new versus old fashioned techniques in patients with different epileptic syndromes. Brain Development. 33 (4), 294-300 (2011).
  29. Kasteleijn-Nolst Trenite, D., et al. Methodology of photic stimulation revisited: updated European algorithm for visual stimulation in the EEG laboratory. Epilepsia. 53 (1), 16-24 (2012).
  30. Mishra, V., Gautier, N. M., Glasscock, E. Simultaneous video-EEG-ECG monitoring to identify neurocardiac dysfunction in mouse models of epilepsy. Journal of Visualized Experiments. (131), e57300(2018).
  31. Green, J. D., Maxwell, D. S., Schindler, W. J., Stumpf, C. Rabbit EEG "theta" rhythm: Its anatomical source and relation to activity in single neurons. Journal of Neurophysiology. 23 (4), 403-420 (1960).
  32. Petersen, J., Diperri, R., Himwich, W. A. The comparative development of the EEG in rabbit, cat and dog. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 17, 557-563 (1964).
  33. Strain, G. M., Van Meter, W. G., Brockman, W. H. Elevation of seizure thresholds: a comparison of cerebellar stimulation, phenobarbital, and diphenylhydantoin. Epilepsia. 19 (5), 493-504 (1978).
  34. Cheng, Y., et al. Effectiveness of retigabine against levobupivacaine-induced central nervous system toxicity: A prospective, randomized animal study. Journal of Anesthesia. 30 (1), 109-115 (2016).
  35. Nascimento, F. A., et al. Pulmonary and cardiac pathology in sudden unexpected death in epilepsy (SUDEP). Epilepsy and Behavior. 73, 119-125 (2017).
  36. Buchanan, G. F. Impaired CO2-Induced Arousal in SIDS and SUDEP. Trends in Neuroscience. 42 (4), 242-250 (2019).
  37. Van Egmond, P., Binnie, C. D., Veldhuizen, R. The effect of background illumination on sensitivity to intermittent photic stimulation. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 48 (5), 599-601 (1980).
  38. Harding, G. F., Fylan, F. Two visual mechanisms of photosensitivity. Epilepsia. 40 (10), 1446-1451 (1999).
  39. Kuwada, S., Stanford, T. R., Batra, R. Interaural phase-sensitive units in the inferior colliculus of the unanesthetized rabbit: effects of changing frequency. Journal of Neurophysiology. 57 (5), 1338-1360 (1987).
  40. Kalume, F., et al. Sudden unexpected death in a mouse model of Dravet syndrome. Journal of Clinical Investigation. 123 (4), 1798-1808 (2013).
  41. Xiang, C., et al. Threshold for maximal electroshock seizures (MEST) at three developmental stages in young mice. Zoology Research. 40 (3), 231-235 (2019).
  42. Ross, K. C., Coleman, J. R. Developmental and genetic audiogenic seizure models: behavior and biological substrates. Neuroscience and Biobehavior Reviews. 24 (6), 639-653 (2000).
  43. Faingold, C. L., Randall, M., Tupal, S. DBA/1 mice exhibit chronic susceptibility to audiogenic seizures followed by sudden death associated with respiratory arrest. Epilepsy and Behavior. 17 (4), 436-440 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Детекция судорогсердечные аритмииреспираторная дисфункциявидео-ЭЭГ-ЭКГкролики в сознаниипульсоксиметриякапнографический мониторингспектральный анализдетекция аритмии
Мультисистемный мониторинг для выявления судорог, аритмий и апноэ у сознательных сдерживаемых кроликов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.