Методическая статья

Простой и гибкий метод инокуляции для точной оценки фенотипов мучнистой росы и других растений

DOI:

10.3791/62287

⸱

9 марта 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Bioscience and Biotechnology Research, University of Maryland, 2Department of Nutrition and Food Science, University of Maryland College Park, 3Department of Plant Sciences and Landscape Architecture, University of Maryland College Park

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представлен протокол построения простой системы распределения спор, состоящей из прививочной коробки с сеткой ~50 мкм и прозрачной пластиковой камеры. Это может быть использовано для равномерной прививки растений спорами мучнистой росы, что позволяет точно и воспроизводимо оценивать фенотипы заболеваний исследуемых растений.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Снижение потерь урожая из-за грибковых заболеваний требует лучшего понимания механизмов, регулирующих иммунитет растений и грибковый патогенез, что, в свою очередь, требует точного определения фенотипов заболеваний растений при заражении конкретным грибковым патогеном. Тем не менее, точное фенотипирование заболевания некультурными биотрофными грибковыми патогенами, такими как мучнистая роса, нелегко достичь и может быть ограничивающим скорость шагом исследовательского проекта. Здесь мы разработали безопасную, эффективную и простую в эксплуатации систему фенотипирования заболеваний, используя в качестве примера взаимодействие арабидопсис-мучнистая роса. Эта система в основном состоит из трех компонентов: (i) деревянная прививочная коробка, оснащенная съемной крышкой, установленной с помощью нержавеющей стали или нейлоновой сетки длиной ~ 50 мкм пор для прививки плоской части растений грибковыми спорами, (ii) прозрачная пластиковая камера с небольшим передним отверстием для минимизации утечки спор при проведении инокуляции внутри, и iii) метод дифференциации и распределения спор для равномерной и эффективной прививки. Протоколы, описанные здесь, включают этапы и параметры для изготовления прививочной коробки и пластиковой камеры при низких затратах, а также видеодемонстрацию того, как использовать систему, чтобы обеспечить даже прививку спорами мучнистой росы, тем самым повышая точность и воспроизводимость фенотипирования заболевания.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мучнистая роса является одним из самых распространенных и важных заболеваний многочисленных продовольственных культур и декоративных растений1. Исследования болезней мучнистой росы были очень популярны, о чем свидетельствуют более 10 500 публикаций в качестве результата поиска с «мучнистой росой» в качестве ключевого слова в Web of Science (по состоянию на ноябрь 2020 года). Действительно, мучнистая роса (представленная Blumeria graminis) считается одним из 10 лучших грибковых патогенов журналом Molecular Plant Pathology2. Количественная оценка восприимчивости к болезням является необходимым шагом в характеристике генов растений, способствующих устойчивости или восприимчивости к болезням, или функциональной идентификации генов-кандидатов-эффекторов в мучнистой росе. Тем не менее, надежное фенотипирование болезней гораздо сложнее с мучнистой росой по сравнению с большинством других грибковых патогенов, отчасти потому, что, в отличие от спор последних, споры видов мучнистой росы (таких как Golovinomyces cichoracearum UCSC1 на основе нашего лабораторного опыта) показывают снижение жизнеспособности после прохождения процесса водной суспензии 3,4 . Неадекватная и/или неравномерная прививка испытуемых растений конкретным патогеном мучнистой росы может привести к неточным результатам фенотипирования.

Сообщалось о ряде методов вакцинации для исследований мучнистой росы. К ним относятся(i) расчесывание спор непосредственно из зараженных листьев для испытания растений5, (ii) распыление споровой суспензии для испытания растений6, (iii) выдувание спор с использованием вакуумной отстойной башни к растениям в нижней части башни7 и (iv) доставка спор путем комбинаторного использования нейлоновой сетчатой мембраны и звуковой вибрации8 . Метод споровой чистки (или пыления) прост в выполнении, но неравномерен по своей природе, поэтому он может быть неточным для количественной оценки. Распыление спор удобно и равномерно, но, как указано выше, может привести к плохому прорастанию спор4. Последние два (т.е. iii-iv) являются значительно улучшенными методами, способными обеспечить даже прививку; однако оба не являются гибкими в регулировке своей способности к вакцинации с точки зрения количества установок, подлежащих вакцинации в одном событии, что делает любой аппарат нетривиальным, и их работа ограничена лабораторными областями, где есть вакуум и / или источник электричества.

Наша лаборатория работает с взаимодействием растений и мучнистой росы более 20 лет 9,10. За последнее десятилетие мы протестировали ряд методов вакцинации и недавно разработали простой и в то же время эффективный метод прививки мучнистой росы. Этот метод щетки на основе сетки может обеспечить равномерную прививку и является простым и масштабируемым, поэтому должен быть легко принят любой лабораторией, работающей с мучнистой росой.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Изготовление стандартной коробки для прививки со съемной верхней крышкой, установленной с сеткой

  1. Приобретите рулон из 50 мкм нейлоновой мембранной сетки или сетки из нержавеющей стали 48 мкм (рекомендуется) в магазинах. Убедитесь, что заказ достаточно для резки на несколько частей по 14 в х 26 дюймов для замены изношенной сетки.
  2. Приобретите один 1/4 в х 2 фута х 4 фута средней плотности ДВП или фанеры и нарежьте два 24-1/2 в х 10 кусках и два 12 в х 10 в кусках для изготовления ящика для прививки. Используйте 8 угловых зажимов для поддержки четырех сторон.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если кожух обращен к широкой стороне корпуса, то левая сторона 12 в x 10 прикреплена постоянно, а правая 12 в x 10 сбоку представляет собой съемную дверь, удерживаемую на месте четырьмя магнитными зацепами (рис. 1А, В).
  3. Поместите четыре 2-дюймовые угловые скобки по два в каждом внутреннем углу левой стороны, дюйм сверху и дюйм снизу, отметьте и просверлите отверстие. Используйте винты, чтобы навсегда прикрепить левую короткую сторону к двум длинным сторонам (передней и задней). Внутреннее расстояние между двумя длинными сторонами должно составлять 12 дюймов, а не 11-1/2 дюйма.
  4. Когда угловые зажимы все еще на месте и правильное выравнивание правой двери, отметьте и просверлите расположение 4 магнитных зацепок, чтобы удерживать правую съемную дверь на месте. Установите кнопочную ручку на дверь. Верхняя часть двери защелкивается под верхней крышкой (рисунок 1А,В).
  5. Чтобы сделать съемную верхнюю крышку с сеткой, разрежьте длинный деревянный квадратный дюбель на 2 комплекта по 26 дюймов и 12-3/4 дюйма. Приклейте и приклейте четыре куска таким образом, чтобы он поместился вокруг коробки – внутренние размеры рамки немного больше внешних размеров коробки, так как сетка экрана будет прикреплена к этой рамке.
  6. Сократите сетку экрана до уровня чуть менее 14 x 26 дюймов. Не позволяйте экрану выступать за рамки, чтобы предотвратить острые края. Есть помощь, чтобы растянуть экран на раме. Удерживайте сетку с рамой зажимами (рисунок 1С) и используйте степлерный пистолет с правильными скобами, чтобы закрепить экран на раме.
  7. Вырежьте два комплекта более коротких деревянных квадратных дюбелей (21 дюйм и 9 дюймов) и используйте винты, чтобы плотно сэндвичировать сетку вдоль рамы, используя 4 более коротких куска деревянного квадратного дюбеля (рисунок 1C, D).

2. Изготовление камеры прививки

  1. Приобретайте прозрачные акриловые листы и скобяные изделия в соответствующих магазинах. Вырежьте 7 в x 20 в открывающемся окне на лицевой стороне акрилового листа коробки, как показано на рисунке 2C.
  2. Соберите левую и правую стороны, передние (с окном) и задние акриловые листы в коробку с помощью 8 угловых зажимов, как показано на рисунке 2A. Убедитесь, что внутренние измерения камеры равны размерам верхнего листа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Правая сторона предназначена для поддержки и не будет прикреплена к передним или задним листам. Он на 1/2 короче, чем другие листы специально. Эта правая сторона станет «опущенной» дверью, удерживаемой на месте петлей прямого угла внизу и двумя магнитными зацепами вверху, как показано на рисунке 2C, D.
  3. Используйте угловые скобы для закрепления панелей вместе (рисунок 2B,C). Удерживайте брекеты на месте, пометьте маркером шарпи, пробивайте по центру и затем просверлите отверстие.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сверление акрила отличается от сверления чего-либо еще, не форсируйте или сторона отверстия напротив сверла может треснуть. Используйте заклепки или винты. Не перетягивайте винты, иначе акрил может треснуть со временем.
  4. Поверните корпус на заднюю сторону, снимите 4 угловых зажима и расположите верхний лист на месте. Отметьте и сверлите.
  5. Установите прямоугольный шарнир, выполненный из угловой скобы 3/4. Используйте нейлоновую стопорную гайку в качестве шарнирного стержня. Не затягивайте, оставьте зазор, чтобы дверь вращалась на этой петле.
  6. Пометьте, поцентрите перфоратор, сверлите и прикрепите два магнитных дверных магнита с помощью винтов #6-32x3/4". Затем прикрепите пластины захвата с помощью винтов с плоской головкой #6-32x3/8", см. Рисунок 2C,D.

3. Инокуляция растений в квартирах

  1. Приготовьте свежие споры мучнистой росы в виде инокулы (например, Arabidopsis мучнистая роса Golovinomyces cichoracearum UCSC1). Выращивайте чистые растения-мутанты Arabidopsis с ослабленным иммунитетом pad4-1 в камере роста (22 ° C, относительная влажность 65% в течение 6-8 недель) и прививайте одну или половину плоских растений pad4-1 для создания достаточного количества свежих спор мучнистой росы (рисунок 3A).
  2. Выращивайте растения для определения фенотипов инфекции в стандарте 11 в х 21 в х 2,5 в квартирах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Растения Arabidopsis , выращенные в течение короткого дня (8 ч света, 16 ч темноты; 22 ° C) в течение шести-восьми недель, хороши для тестов на инфекцию с мучнистой росой.
  3. Когда свежие споры мучнистой росы из зараженных растений через 8-10 дней после посева (dpi) доступны, переместите плоскую часть растений для теста на инфекцию в ящик для вакцинации внутри камеры инокуляции (рисунок 1B,2C).
  4. Срежьте 15-20 сильно зараженных листьев арабидопсиса (или 4-6 инфицированных розеток, в зависимости от размера листа/ розетки и уровня прививки), дайте листьям высохнуть, если есть конденсированная вода.
  5. Возьмите 1-2 листа или розетку парой длинных щипцов одной рукой и повернитесь вверх ногами. Затем проведите обеими руками через отверстие камеры и осторожно ударьте ножницами по руке щипцов, медленно перемещая листья /розетку над сеткой, установленной на ящике для прививки (рисунок 3B). Повторяйте это до тех пор, пока не будут использованы все листья или розетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Зрелые споры будут легко вытесняться из конидиофоров зараженных листьев. Постарайтесь выбить споры на сетку как можно более равномерно.
  6. Используйте одну или две тонкие щетки для блендера, чтобы аккуратно прочесать споры через сетку (рисунок 3C). Убедитесь, что вы смахиваете всю поверхность сетки в разных направлениях в течение четырех или более раз, чтобы максимизировать равномерное распределение спор по растениям в нижней части прививочной коробки (рисунок 3D). Осторожно похлопайте сетку несколько раз щетками, чтобы стряхнуть споры, которые застряли в сетке.
  7. Дайте спорам успокоиться на полминуты. Затем выдвиньте квартиру, содержащую привитые растения, из прививочной коробки. Накройте квартиру пластиковым куполом и поместите в камеру роста (22 °C, относительная влажность 65%). Фенотипирование заболевания может быть выполнено при 5 или от 8 до 12 dpi 12.

4. Инокулируйте растения с меньшими ящиками для вакцинации

ПРИМЕЧАНИЕ: В тех случаях, когда необходимо привить меньше растений, все еще можно использовать стандартную коробку для вакцинации. Обязательно поместите растения в середину коробки. Вытесняйте споры и расчесывайте споры в области сетки, которая покрывает растения, чтобы обеспечить инокуляцию всех растений, сохраняя при этом инокула. Альтернативно, предпочтительно, можно использовать меньшие прививочные коробки (как описано ниже).

  1. Преобразуйте картонные коробки в коробку для вакцинации. Просто снимите верхнюю и нижнюю стороны коробки, заклейте угол, чтобы при необходимости укрепить его, и установите сетку подходящего размера 50 мкм сверху путем склеивания или сшивания (рисунок 4A, B).
  2. Переместите квартиру, содержащую растения, внутрь камеры прививки, поместите меньшую коробку для вакцинации поверх плоской, чтобы покрыть растения.
  3. Вытесняйте и расчесывайте споры, как описано выше.

5. Прививка отсоединившихся листьев в чашках Петри

ПРИМЕЧАНИЕ: В тех случаях, когда (i) свежие споры мучнистой росы очень ограничены и / или (ii) растения должны содержаться в чистоте, в то время как фенотипы заболевания и / или белковая субклеточная локализация в инфицированных клетках должны быть оценены, отслоившиеся листья могут быть использованы для инфекции в пластинах MS-агара.

  1. Сделайте мини-прививочную коробку, которая лишь немного больше, чем чашка Петри.
  2. Приготовьте 1/2-сильные murashige и Skoog (MS) средние агаровы (1,5%) пластины. Добавьте тиабендазол (40 мг / л), чтобы уменьшить загрязнение плесенью, если это необходимо. Храните тарелки при температуре 4 °C в холодильнике до использования.
  3. Срежьте один или два полностью расширенных листа с основания черешка для каждого отдельного растения, подлежащего тестированию. Вставить черешок отслоившихся листьев в агаровую среду под углом ~30°.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая пластина может содержать 20-40 листьев в зависимости от размера листьев и используемой пластины (рисунок 4C).
  4. Инокулируют листья внутри камеры прививки, как описано выше. Переместите пластину с крышкой в камеру роста.
  5. Вырежьте небольшой участок листа и проверьте субклеточную локализацию белков в определенные временные точки.
  6. Для оценки фенотипов инфекции перенесите листья на свежую асептическую пластину MS-агара при 4 или 5 dpi. Срежьте основание черешка перед тем, как вставить листья в среду свежего агара. Оцените фенотипы заболевания на уровне 8 или 9 dpi.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем новый метод прививки спор мучнистой росы, который прост в приготовлении, эксплуатации и регулировке. На рисунке 1 показана сборка стандартной прививочной коробки с акцентом на марку съемной крышки, установленной с мембранной сеткой 50 мкм. На рисунке 2 показана сборка камеры прививки. На рисунке 3 показаны ключевые этапы процесса вакцинации с использованием этой системы. На рисунке 4

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наш метод инокуляции на основе сетчатой коробки имеет ряд преимуществ по сравнению с другими методами инокуляции. Во-первых, он может достичь равномерного распределения спор при правильной эксплуатации, как показано на рисунке 5. Во-вторых, использование сетки ~ 50 мкм, а также смещение спор путем мягкого встряхивания зараженных листьев может уменьшить заражение растений трипсами или другими насекомыми, заражающими растения, которые присутствуют в растениях-источниках. В-третьих, использован...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Работа была поддержана Национальным научным фондом (IOS-1901566) С. Сяо. Авторы хотели бы поблагодарить Ф. Кокера и К. Хукса за обслуживание установки для роста растений, а также Хорхе Самору за техническую помощь, связанную с изготовлением прививочной коробки и камеры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
  48 & микро; решетчатый сетчатый экран из нержавеющей стали; Размер: 24" X 48" AmazonNAДля изготовления крышки коробки для прививки
#6-32 x ¾ " Винты крепостные, плоские шайбы и гайки Home DepotNAДля изготовления камеры модификации
# 6-32 оцинкованная нейлоновая контргайка (4 шт.)Home DepotNAДля изготовления камеры для модификации
# 6-32x3/8" Шурупы с плоской головкой Phillips, плоские шайбы и гайки Home DepotNAДля крепления   магнитные дверные защелки
пластины #8-32x1/2" крепежные винты, плоские шайбы и гайкиHome DepotNAДля крепления угловых скоб и дверных петель
0,250 толщины прозрачный лист с акриловой пленкой;   Размер: 17 ½ " X 20"Профессиональные пластмассыSACR.250CEFДля изготовления камеры модифицирования
0,250 толщины прозрачный экструдированный акриловый лист с маскировочной пленкой; Размер: 18 дюймов x 20 дюймов;  Профессиональные пластмассы  SACR.250CEFДля изготовления камеры модифицирования
прозрачная прозрачная экструдированная акриловая пленка толщиной 0,250 листа; Размер: 18" X 30" Профессиональные пластмассыSACR.250CEFДля изготовления камеры модифицирования
толщиной 0,250 прозрачный лист с покрытием из экструдированной акриловой пленки; Размер: 20 дюймов x 29 & frac12; "Professional PlasticsSACR.250CEFДля изготовления камеры инокуляции
1-5/8" дверца шкафа магнитная защелка белогоHome DepotМодель #P110-WДля изготовления камеры инокуляции
2" стальная оцинкованная угловая скоба (8-Pack)Главная Depot  Модель #13611 Для изготовления коробки и камеры для прививки
3-дюймовый угловой зажимHarbor Freight ToolsАртикул 63653, 1852, 60589Для изготовления камеры для прививки
3/4"  стальная оцинкованная угловая скоба (4-Pack)Home DepotМодель #13542Для изготовления коробки и камеры для прививки
4-7/8" оцинкованная легкая дверная ручкаHome DepotМодель #15184Для изготовления коробки для прививки
Тонкий вентилятор-блендер щеткиMichaels StoreM10472846 Для инокуляции
Kelleher 3/4" x 3/4" x 36" деревянный квадратный дюбель Home DepotNAДля изготовления крышки инокуляционного бокса
Древесноволокнистая плита средней плотности (1/4" x 2' x 4');  Home DepotModel# 1508104Для изготовления коробки для прививки
Круглые стеклянные покровные стекла с 500 & микро; m gridibidi США Inc.10816Для определения плотности спор

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huckelhoven, R., Panstruga, R. Cell bi ology of the plant-powdery mildew interaction. Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 738-746 (2011).
  2. Dean, R., et al. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
  3. Sakurai, H., Hirata, K. Some observations on the relation between the penetration hypha and haustorium of barley powdery mildew and host cell. V. Influence of water spray on the pathogen and host tissue. Annual Phytopathology Society of Japan. 24, 239-245 (1959).
  4. Shomari, S. H., Kennedy, R. Survival of Oidium anacardii on cashew (Anacardium occidentale) in southern Tanzania. Plant Pathology. 48 (4), 505-513 (1999).
  5. Sitterly, W. R. Powdery Mildews. Spencer, D. M. , Academic Press. 369(1978).
  6. Reuveni, M., Agapov, V., Reuveni, R. Induction of systemic resistance to powdery mildew and growth increase in cucumber by phosphates. Biological Agriculture & Horticulture. 9 (4), 305-315 (1993).
  7. Reifschneider, F. J. B., Boiteux, L. S. A vacuum-operated settling tower for inoculation of powdery mildew fungi. Phytopathology. 78 (11), 1463-1465 (1988).
  8. Chowdhury, A., Bremer, G. B., Salt, D. W., Miller, P., Ford, M. G. A novel method of delivering Blumeria graminis f. sp hordei spores for laboratory experiments. Crop Protection. 22 (7), 917-922 (2003).
  9. Xiao, S., et al. Broad-spectrum mildew resistance in Arabidopsis thaliana mediated by RPW8. Science. 291 (5501), 118-120 (2001).
  10. Xiao, S., Ellwood, S., Findlay, K., Oliver, R. P., Turner, J. G. Characterization of three loci controlling resistance of Arabidopsis thaliana accession Ms-0 to two powdery mildew diseases. The Plant Journal. 12 (4), 757-768 (1997).
  11. Reuber, T. L., et al. Correlation of defense gene induction defects with powdery mildew susceptibility in Arabidopsis enhanced disease susceptibility mutants. The Plant Journal. 16 (4), 473-485 (1998).
  12. Xiao, S., et al. The atypical resistance gene, RPW8, recruits components of basal defence for powdery mildew resistance in Arabidopsis. The Plant Journal. 42 (1), 95-110 (2005).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Arabidopsis

Похожие статьи