Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Измерение поглощения глутамата с помощью меченого радиоактивными веществами L-[3H]-глутамата в острых поперечных срезах, полученных из резецированного гиппокампа грызунов

846 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62292

⸱

2 октября 2021 г.

 ,  ,  , 
1Graduate Program in Biochemistry, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 2Department of Biochemistry, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 3Department of Biological Sciences, Universidade Federal de Ouro Preto, 4Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье описан надежный и простой способ получения ex vivo острых поперечных срезов гиппокампа у мышей и крыс с помощью тканевого измельчителя. Срезы, полученные из резецированного гиппокампа, могут быть представлены для функционального анализа поглощения глутамата для исследования гомеостаза глутаматергической системы.

Аннотация

Удаление глутамата из внеклеточного пространства высокоаффинными Na+-зависимыми транспортерами необходимо для обеспечения правильной работы внутренних механизмов связи мозга и поддержания гомеостаза. Гиппокамп — это уникальная структура мозга, которая управляет высшими когнитивными функциями, и является предметом нескольких исследований, касающихся неврологических заболеваний. Исследование физиологических и патологических механизмов на моделях грызунов может быть полезно с помощью препаратов острого разреза гиппокампа (AHS). Преимущество AHS заключается в том, что он предоставляет достоверную информацию о функции клетки, поскольку цитоархитектория и синаптические контуры сохраняются. Несмотря на то, что препараты AHS широко используются в нейрохимических лабораториях, в литературе можно найти некоторые методологические различия. Учитывая, что различные протоколы подготовки срезов могут изменить анализируемые области гиппокампа, данный протокол предлагает стандартную технику получения поперечной AHS из резецированного гиппокампа. Этот простой в исполнении протокол может быть использован в экспериментальных моделях мышей и крыс и позволяет использовать несколько подходов ex vivo, исследующих нейрохимическую динамику (в дорсальном, промежуточном и вентральном гиппокампе) в различных условиях (например, трансгенные манипуляции) или после манипуляций in vivo (например, фармакологическое лечение или подходящие модели грызунов для изучения клинических расстройств). После рассечения гиппокампа из мозга грызуна были получены поперечные срезы по септовременной оси (толщиной 300 мкм). Эти АГС содержат отдельные части гиппокампа и были подвергнуты индивидуальному нейрохимическому исследованию (например, переносчики нейротрансмиттеров, использующие соответствующие субстраты). Поскольку гиппокамп имеет высокую плотность возбуждающих синапсов, а глутамат является наиболее важным нейромедиатором в мозге, глутаматергическая система является интересной мишенью для наблюдаемых in vivo явлений. Таким образом, текущий протокол содержит подробные шаги по изучению поглощения глутамата при ex vivo AHS с использованием L-[3H]-глутамата. Использование этого протокола для исследования функции гиппокампа может помочь лучше понять влияние метаболизма глутамата на механизмы нейропротекции или нейротоксичности.

Введение

Гиппокамп, структура мозга, расположенная глубоко в медиальной височной доле каждого полушария, где лежат высокие когнитивные функции, является одним из наиболее изученных образований центральной нервной системы (ЦНС). Функция гиппокампа тесно связана с декларативной и пространственной памятью. Эта структура также играет роль в эмоциональном поведении и в регуляции функций гипоталамуса 1,2,3,4. С тех пор, как это было подтверждено, в этой области происходят важные механизмы формирования и хранения памяти, и в полевых условиях началось глубокое исследование области гиппокампа. Соответственно, использование животных моделей, которые напоминают человеческие церебральные расстройства, связанные с функциями гиппокампа, такие как болезнь Альцгеймера, эпилепсия, большая депрессия и стресс, продолжает расти.

У грызунов гиппокамп представляет собой изогнутую структуру, начинающуюся от медиальной перегородки по направлению к вентральной височной коре. Вдоль своей продольной оси гиппокамп может быть разделен на три различные области, каждая из которых связана с определенной схемой1. Верхняя часть представляет собой дорсальный/септальный гиппокамп, нижняя часть представляет собой вентральный/височный гиппокамп, а область между ними считается промежуточным гиппокампом. Существует обширная литература, охватывающая различия в клеточных проекциях для каждой части, а также отчеты о конкретных когнитивных аспектах, обрабатываемых каждым из 5,6. Что касается его внутренней организации, то отделы гиппокампа можно разделить по его функциональным зонам. Область аммониса (CA) подразделяется на CA1, CA2 и CA3 и проходит через верхнюю часть гиппокампа, над зубчатой извилиной (DG) и субикулумом, которые являются наиболее внутренними частями гиппокампа (Рисунок 1). Синапсы, расположенные в этих областях, претерпевают непрерывную перестройку, демонстрируя нейрогенные и пластические процессы на протяжении всей жизни3. Несколько исследований уже показали, что отдельные экспериментальные манипуляции в гиппокампе приводят к когнитивной инвалидности7. Что касается оценки биохимических и молекулярных изменений, методы с использованием острых срезов мозга являются отличным инструментом для улучшения знаний о различных аспектах гиппокампа.

Благодаря своей точности и воспроизводимости, во многих исследованиях, в которых изучались аспекты явлений, связанных с нейротрансмиссией (активность, поглощение или высвобождение ферментов), использовалась поперечная AHS из резецированного гиппокампа, полученная с помощью тканевого измельчителя 8,9,10,11,12. Этот метод среза с последующей оценкой поглощения подходит для сложных нейрохимических экспериментов, требующих сохранения активности транспортера из ткани гиппокампа. Для этого предпочтительнее использовать измельчитель тканей, так как он работает быстрее, чем вибратом, и обеспечивает AHS в нужное время для экспериментального использования с подходящей точностью.

Возбуждающая нейротрансмиссия в мозге осуществляется глутаматом, наиболее распространенным нейромедиатором, в том числе в гиппокампе, который в большей степени зависит от глутаматной передачи сигналов 13,14. Это изобилие нейротрансмиттеров строго контролируется во внеклеточной среде. Однако внутри внутриклеточных пузырьков она может достигать до 100мМ15. После высвобождения в синаптической щели глутамат не метаболизируется и должен быть удален, чтобы избежать эксайтотоксичности, обычно вызванной реакцией на перегрузку глутамата14,16. Единственным механизмом, отделяющим токсичность от нормальной передачи сигналов, является натрий-зависимый транспорт через активность белков, расположенных в плазматических мембранах, в основном, глиальных клеток 14,17,18,19. Эти транспортеры [GLAST (EAAT1) и GLT-1 (EAAT2)] жестко регулируют внеклеточные уровни глутамата и могут модулироваться широким спектром факторов, таких как транскрипция ДНК, сплайсинг и деградация мРНК, синтез и нацеливание белков, активность транспорта аминокислот и активность ионных каналов 20,21,22,23. Соответственно, их активность может быть измерена по транспорту радиоактивно меченного субстрата, как глутамата.

Использование радиоактивно меченых субстратов представляет собой предпочтительный метод количественной оценки активности транспортеров, поскольку они позволяют отслеживать динамические механизмы, такие как транспорт через клеточные мембраны. Помимо высокой чувствительности и специфичности, преимущества экспериментов с радиоиндикаторами включают их простоту и небольшую стоимость по сравнению с конкурирующими технологиями, такими как масс-спектрометрия24. Кроме того, при использовании только небольших количеств индикатора физиологические уровни субстратов не изменяются, что обеспечивает более репрезентативную картину реального сценария метаболической активности.

Доступность экспериментальных подходов ex vivo имеет решающее значение для поддержки фундаментальных исследований по выявлению новых молекулярных мишеней и деятельности по открытию лекарств. Таким образом, учитывая значимость поглощения глутамата для гомеостаза глутаматергической системы и высокую преобладание глутаматергических синапсов в гиппокампе, этот протокол демонстрирует, как оценить активность поглощения глутамата быстрым и простым в воспроизведении методом с использованием поперечной AHS из резецированного гиппокампа. В этом анализе используется меченый радиоактивными веществами L-[3H]-глутамат, который позволяет проводить количественные сравнения и четкую визуализацию результатов, и может быть модифицирован для использования со специфическими или специализированными субстратами в широком диапазоне условий реакции25.

Острые срезы мозга имеют много преимуществ и используются для поддержки изменения функций при фармакологических и генетических манипуляциях 26,27,28. Их использование выигрывает от следующего: (i) сохранение нейрохимической функциональности и межклеточных взаимодействий; (ii) возможность проведения многочисленных фармакологических и генетических манипуляций для исследования путей, лежащих в основе нейрональных и глиальных функций; (iii) точный контроль внеклеточной среды; и (iv) хороший экспериментальный доступ к различным областям гиппокампа (таким как CA1, CA3 или DG), которые хранятся в одном и том же срезе в зависимости от метода среза. Учитывая, что различные протоколы подготовки среза могут изменить обнаженные области гиппокампа, этот протокол предлагает стандартную технику получения поперечной AHS из резецированного гиппокампа. Этот простой в исполнении протокол может быть использован на моделях грызунов и может позволить использовать несколько подходов ex vivo для исследования нейрохимической динамики в различных условиях или после манипуляций in vivo29,30 (рис. 2).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры были выполнены в соответствии с Руководством NIH по уходу за лабораторными животными и их использованию и одобрены местным Комитетом по этике (одобрение проекта # 33732/CEUA-UFRGS). Были приложены все усилия, чтобы свести к минимуму дискомфорт и количество животных, используемых в экспериментах.

1. Приготовление сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS)

  1. В стакан объемом 1 л добавьте примерно 0,5 л стерильной или дважды дистиллированной воды и начните энергично помешивать на магнитной мешалке. Добавьте следующие компоненты HBSS (в мМ): 137 NaCl, 0,63 Na2HPO4, 4,17 NaHCO3, 5,36 KCl, 0,44 KH2PO4, 0,41 MgSO4, 0,49 MgCl2, 5,55 D-глюкоза (см. таблицу 1).
  2. Отрегулируйте pH до 7,4 с помощью NaOH или HCl перед добавлением 1,26 мМ CaCl2 , чтобы избежать осадков. Добавляйте эту соль очень медленно и при перемешивании. Доведите его до объема 1 л стерильной или дважды дистиллированной водой. Этот буфер будет использоваться для промывания ткани и поддержания AHS в жизнеспособном состоянии во время эксперимента. Он будет обеспечивать неорганические ионы, поддерживая физиологический pH и осмотическое давление.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление двухвалентных катионов производится после титрования pH во избежание выпадения осадков.
  3. Разделите две разные фракции HBSS: одна будет храниться на водяной бане при температуре 37 °C и использоваться во время парадигмы поглощения, а другая будет храниться в ледяном холоде (4 °C) и использоваться для стирки до и после эксперимента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из каждой соли можно приготовить исходные растворы и хранить их в замороженном виде до использования, хранить в морозильной камере (-20 °C) и использовать в течение нескольких недель.

2. Приготовление HBSS без натрия

  1. Перед тем, как смешивать компоненты для HBSS без натрия, заранее приготовьте два других раствора: Glucamine-HCl (137 мМ) и Glucamine-HEPES (4,17 мМ). Смешайте эквимолярные концентрации основания NMDG и HCl для получения раствора глюкамина-HCl. Проделайте ту же процедуру с 2,0 М свободной кислотой HEPES для получения раствора NMDG-HEPES (см. Таблицу 2).
  2. В стакан объемом 0,5 л добавьте примерно 0,2 л стерильной или дважды дистиллированной воды и начните энергично помешивать в магнитной мешалке. Добавьте следующие буферные компоненты (в мМ): 137 глюкамин-HCl, 4,17 глюкамина-HEPES, 5,36 KCl, 0,44 KH2PO4, 1,26 MgSO4, 0,41 MgCl2 и 5,55 D-глюкозы (см. Таблицу 2).
  3. Отрегулируйте pH до 7,4 с помощью KOH или HCl и продолжайте помешивать. Добавьте 1,26 мМ CaCl2 очень медленно и при перемешивании. Доведите раствор до объема 0,3 л стерильной или дважды дистиллированной водой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот буфер будет использоваться для измерения независимого от натрия поглощения глутамата, что позволит измерить пассивное/неспецифическое поглощение глутамата. После эксперимента этот параметр вычитается из общего поглощения глутамата для определения зависимого поглощения натрия.
  4. После приготовления этот буфер можно хранить в морозильной камере (-20 °C) и использовать в последующих экспериментах. То же самое относится и к решениям NMDG.
  5. Во время эксперимента всегда держите HBSS без натрия холодным.

3. Организация материала для вскрытия гиппокампа у крыс

  1. Перед началом эксперимента организуйте зону вскрытия рядом с раковиной. Поместите в раковину специальную гильотину для крыс (для мышей можно будет использовать острые ножницы) для поддержания чистоты на скамейке.
  2. Расположите хирургические инструменты и другие материалы для удаления мозга и рассечения гиппокампа в порядке использования и как можно ближе к тому месту, где они необходимы (см. Таблицу материалов). Поместите чашку Петри в ведро со льдом. Кроме того, держите рядом полиэтиленовый пакет для утилизации туши.
  3. Приготовьте оба раствора HBSS в рекомендуемой для использования концентрации. Не содержащий натрия HBSS можно замораживать и размораживать перед экспериментом.
    1. Разделите натрийсодержащий HBSS на две отдельные части, как рекомендовалось ранее: одну нагреть до 37 °C, а другую — до 4 °C, которые будут использоваться для вскрытия. Разморозьте HBSS без натрия и держите при температуре 4 °C.
  4. Чтобы вызвать анестезию, используют 3% изофлуран31. Перед началом эксперимента обязательно убедитесь в отсутствии роговичного рефлекса и ноцицептивной стимуляции задней лапы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте внимательны при выборе адекватного обезболивающего препарата, так как он не должен влиять на какие-либо параметры, которые будут исследоваться. Для этого протокола рекомендуется использовать ингаляционный анестетик (например, изофлуран)32.

4. Усыпление крысы

  1. Усыпьте грызуна с использованием методов, одобренных Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC), а также Руководством Национальных институтов здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных (публикации NIH No 8023, пересмотренные в 1978 году).
  2. С помощью гильотины обезглавьте крысу непосредственно перед первым шейным позвонком.
  3. Положите голову на чистое бумажное полотенце, смоченное холодным солевым раствором. Хирургическими ножницами размера S полностью удалите волосистую часть головы, а также кожную мышцу, стремясь полностью обнажить швы на верхней поверхности черепа. Начинайте эту процедуру осторожно, начиная с затылочной кости и двигаясь сзади к носовой кости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В случае, если экспериментальной моделью являются мыши, используйте острые ножницы для удаления головы. Обязательно разрежьте сразу за черепом, чтобы исключить лишнюю ткань.

5. Удаление мозга крысы

  1. Выполните удаление мозга как можно быстрее. С помощью подходящего костного плоскогубца сделайте один разрез между обоими отверстиями, соединяющими оба отверстия в черепе крысы. После этого поместите один кончик хирургических ножниц размера S в большое затылочное отверстие и сделайте один разрез латерально в черепе. Повторите для другой стороны.
  2. Разрежьте пластины черепа от затылочной пластины, затем по средней линии шва теменных пластин и, наконец, до лобной пластины по направлению к носу. Убедитесь, что голова грызуна крепко удерживается, а давление направлено в сторону от мозга, чтобы предотвратить повреждение тканей под ним.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно, чтобы давление было направлено в сторону от мозга, чтобы предотвратить повреждение тканей под ним. У молодых крыс и мышей есть возможность разрезать череп небольшими хирургическими ножницами.
  3. Аккуратно удалите затылочную и теменную пластины с обоих полушарий с помощью шпателя или щипцов. Внимательно осмотрите на наличие твердых мозговых оболочек, которые могут быть прикреплены к костям черепа и растянуты по поверхности мозга.
  4. Немедленно извлеките мозг тонким двусторонним шпателем и аккуратно положите весь мозг на ледяную чашку Петри, покрытую фильтровальной бумагой. С помощью пластиковой пипетки Пастера смочите ее ледяным физиологическим раствором. Немедленно приступайте к рассечению гиппокампа с обоих полушарий мозга, как описано ниже.
  5. Аккуратно удалите мозжечок со всего мозга лезвием скальпеля #11. Для того чтобы полностью разделить полушария головного мозга, проведите лезвием скальпеля по всей внутриполушарной щели. С помощью пластиковой пипетки Пастера часто увлажняйте ее ледяным буфером HBSS, чтобы ткань оставалась влажной и сохранной.
  6. Возьмите каждое полушарие отдельно, удалите ствол мозга и средний мозг из вышележащей коры с помощью ножниц Iris. Осторожно хирургическими ножницами разрежьте ствол мозга/средний мозг/таламус, при этом тонкой щеткой надавите и потяните эти структуры мозга. Ниже можно будет наблюдать за гиппокампом (медиальной поверхностью) и боковым желудочком. Кора головного мозга с гиппокампом теперь должна быть свободна от ствола мозга.

6. Вскрытие гиппокампа у крыс

  1. Чтобы резецировать гиппокамп, поместите одно полушарие мозга в корональную плоскость так, чтобы теменная кора была обращена вниз. В этот момент можно наблюдать белые волокна фимбрии, которые образуют неглубокую гиперболу в нижней части гиппокампа.
  2. Очень аккуратно, недоминирующей рукой, закрепите ткани мозга тонким пинцетом. Доминирующей рукой поместите другой пинцет под каудальный кончик гиппокампа.
  3. Закрепив медиальные тракты белого вещества, расположите пинцет полностью под гиппокампом, чтобы аккуратно отделить его от остальной части мозга. Надавите, двигая второй кончик немного вперед и вбок. Если все сделано правильно, гиппокамп должен приземлиться на фильтровальную бумагу.
  4. Чтобы завершить диссекцию гиппокампа, удалите тем же пинцетом запасную ткань (обычно это любая оставшаяся кора головного мозга, кровеносные сосуды и белое вещество). Повторите ту же методику для второго полушария.
  5. После того, как оба гиппокампа будут удалены, перенесите его в чашку Петри с HBSS, помещенную на ведро со льдом, и перенесите в область режущего стола над лезвием в измельчителе для тканей. Обязательно правильно определите дорсальную и брюшную области, если исследование требует их анализа по отдельности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно всегда различать вентральную и дорсальную части гиппокампа во время диссекции. При этом передний конец будет обращен вверх33. Эта часть гиппокампа немного тоньше, чем задний конец.

7. Подготовка ломтиков

ПРИМЕЧАНИЕ: При размещении операционного материала на скамье (сеанс 2) подготовьте измельчитель тканей для получения поперечного среза из резецированного гиппокампа.

  1. Установите параметры в измельчителе тканей перед его использованием. Измельчитель может нарезать ломтики от 100 до 400 мкм; Установите его на 300 μм. Кроме того, рекомендуется диапазон 60-80 ударов в минуту, так как он сохраняет целостность тканей во время процедуры среза.
  2. После всех процедур, выполненных на сеансе 2, после того, как гиппокампы были удалены из мозга и помещены на фильтровальную бумагу, увлажненную холодным физиологическим раствором поверх гладкой полипропиленовой основы, выровняйте каждый гиппокамп на фильтровальной бумаге перед тем, как подвергнуть их процедуре измельчения.
  3. Поместите гиппокамп за раз на круглый стол для резки из нержавеющей стали от измельчителя тканей, перпендикулярно режущим лезвиям, чтобы получить поперечные срезы гиппокампа вдоль септовременной оси. Перед началом процесса измельчения слегка увлажните лезвие с помощью изопропилового спирта. Эта процедура предотвращает прилипание ткани к лезвию, что позволяет проводить более гладкую и точную нарезку.
  4. После включения оборудования лезвие в измельчающем рычаге будет подниматься и опускаться, нарезая ткань выбранной толщины. Это быстрый процесс, и обычно ткань будет правильно разрезана через минуту. Можно измельчать более одного гиппокампа одновременно, если они правильно отделены друг от друга на разделочном столе.
  5. Чтобы отделить ломтики, осторожно возьмите каждый нарезанный образец из измельчителя тканей с помощью двустороннего шпателя и погрузите его в чашку Петри с ледяным физиологическим раствором. С помощью двух тонких кистей аккуратно зажмите гиппокамп и отделите ломтики. Будьте осторожны, чтобы сохранить целостность среза во время этого процесса.
    1. Проведите этот эксперимент в трех экземплярах, следовательно, выберите 6 срезов из каждого образца: 3 среза для общего поглощения глутамата и 3 для неспецифического поглощения.
  6. С помощью щетки аккуратно переложите каждый ломтик из чашки Петри на 24-луночный планшет, содержащий: (i) 1 мл HBSS; и (ii) 1 мл HBSS без натрия. Определите скважину/планшет с соответствующими экспериментальными группами и проведите анализ не менее чем в трех экземплярах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за ограниченного по времени времени, если эксперимент проводится в трех экземплярах, количество животных/групп ограничивается только 6 за один раз (один гиппокамп на животное за 5 минут). Это означает, что L-[3H]-глутамат будет вводиться каждые 15 с до тех пор, пока все срезы не будут инкубированы. Чтобы остановить реакцию, следует соблюдать тот же интервал, чтобы гарантировать, что все образцы подвергаются воздействию 5-минутного инкубационного периода.

8. Анализ поглощения глутамата

  1. Во время стабилизации ломтиков в соответствующем буфере (HBSS или HBSS без натрия) готовят радиоактивный раствор путем разведения L-[3H]-глутамата в стерильной воде до конечной концентрации 4,5 μCi/мл в конечном объеме, который позволяет получить 20 μL на ломтик плюс некоторый избыток, что предотвратит отсутствие радиоактивного ввода в конце партии, поскольку потребуется количественно определить, сколько распадов в минуту (DPM) было предложено для каждого среза в начале.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого 24-луночного планшета рекомендуется готовить 500 мкл 4,5 мкКи/мл L-[3H]-глутамата из-за общего времени инкубации, необходимого для поглощения L-[3H]-глутамата (5 минут) и времени пипетирования каждого 20 μL аликвоты (0,33 μCi в каждой лунке), как описано ниже. Исходная концентрация L-[3H]-глутамата обычно составляет 1,0 мКи/мл, поэтому приготовьте разведение в соотношении 1:200 для нанесения на ломтики.
  2. После 15 минут предварительной инкубации в HBSS полностью удалите буфер с помощью пастеровской пипетки и замените его, добавив в ломтики 280 μL одного из следующих веществ: (i) обычный HBSS (37 °C) для полного поглощения; или ii) не содержащий натрия HBSS (4°C) для неспецифического поглощения. Важно отметить, что полное поглощение должно осуществляться на нагревательной пластине при температуре 37 °C, в то время как неспецифическое поглощение должно осуществляться на льду.
  3. Подготовьте один таймер и установите начало эксперимента при добавлении 20 мкл в первую лунку, содержащую срез. Подождите 15 - 20 с (в зависимости от количества срезов в пластине) и добавьте радиоактивный ввод в следующую лунку и так далее до окончания срезсодержащих лунок. Распределите 20 мкл входного материала во всех лунках, всегда учитывая общее время инкубации (5 минут).
  4. После того, как каждая из лунок, содержащих ломтики в тарелке, будет заполнена, подождите, пока первый ломтик не завершится 5-минутной инкубацией с L-[3H]-глутаматом. Затем немедленно удалите инкубационную среду в подходящую колбу для радиоактивных отходов.
  5. Сразу после удаления быстро добавьте 300 μL ледяного HBSS и аккуратно удалите его. Повторите эту процедуру еще два раза в каждой лунке, выполняя по три промывки для каждого ломтика. Обязательно используйте не содержащий натрия HBSS для промывки ломтиков, предназначенных для неспецифического измерения поглощения. Промыв все ломтики в тарелке, добавьте в каждую лунку по 300 мкл 0,5 М NaOH и храните тарелку, защищенную парапленкой, при температуре 4 °C в течение ночи.

9. Подсчет радиоактивного L-[3H]-глутамата

  1. На следующий день пометьте столько пробирок, сколько срезов в эксперименте, и соберите содержимое лунки до каждой пробирки. Следите за тем, чтобы срезы полностью растворились в лизисном растворе. При необходимости гомогенизировать образец следует с помощью иглы 26 калибра, соединенной со шприцем объемом 1 мл.
  2. Добавьте 1,2 мл сцинтилляционной жидкости до конечного объема приблизительно 1,5 мл и гомогенизируйте все образцы в вихре перед их считыванием в сцинтилляционном счетчике в течение 60 с каждый.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что параметры обнаружения установлены на тритий, и результат будет доставлен в DPM.

10. Расчеты

  1. Преобразуйте результаты, полученные сцинтилляционным счетчиком, в радиоактивность, испускаемую реагентом, захваченным внутри среза, и представляющую собой количество поглощенного глутамата. Вычтите значение, полученное для неспецифического поглощения, из результата, полученного с помощью обычного HBSS. Один μCi эквивалентен 2,22×106 DPM.
  2. Зная количество μCi и исходную концентрацию [3H]L-глутамата (информация обычно приводится в колбе или техническом описании реагента), рассчитайте L-[3H]-глутамат, захваченный каждым срезом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Поглощение глутамата является одним из наиболее важных механизмов, контролирующих нейротрансмиссию в мозге. Гиппокамп, в частности, является критически важным местом в передаче сигналов глутамата, являясь важным узлом, соединяющим память, познание и эмоции в мозге. Следуя протоколу, взрослые самцы крыс линии Wistar были использованы для получения репрезентативных результатов. Животных анестезировали изофлураном 3% до потери сознания. После вскрытия мозга гиппокампы удалялись и помещались на стол измельчителя перпендикуля...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Представленный протокол показывает простую в выполнении оценку поглощения глутамата с использованием срезов гиппокампа. Результаты показывают, что AHS регулярно поглощает около 60 фмоль меченого радиоактивными веществами L-[3H]-глутамата, что толщина среза (количество белка) не влияет на поглощение L-[3H]-глутамата (данные не показаны), и что дорсальная, промежуточная и вентральная части гиппокампа продемонстрировали аналогичные характеристики при получении от наивн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы получают финансовую поддержку от Бразильского национального института науки и технологий в области эксайтотоксичности и нейропротекции [465671/2014-4], CNPq [438500/2018-0] и [152189/2020-3], FAPERGS/CAPES/DOCFIX [18/2551-0000504-5], CAPES [88881.141186/ 2017-01], CNPq [460172/2014-0], PRONEX, FAPERGS/CNPq [16/ 2551-0000475-7], FAPERGS/MS/CNPq/SESRS-PPSUS [30786.434.24734.23112017]

UFOP - MODALIDADE: "EDITAL PROPP 19/2020 AUXÍLIO À PUBLICAÇÃO DE ARTIGOS CIENTÍFICOS - 2020", PROCESSO N.: 23109.000929/2020-88

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
#11 лезвие скальпеляSwann-Morton525
100 мм стеклянная чашка ПетриОбщие поставщики
110 мм диаметр Ватман ФильтрSigma AldrichWHA1001110
42,5 мм Ватман ФильтрSigma AldrichWHA1001042
24-луночный клеточный культуральный планшетFalcon353047
BeckerОбщие поставщики
Лезвия для измельчителя тканейWilkinson3241
Bone rongeurErwin Guth9,00,005
CaCl2SigmaAldrich C4901
D-[2,3-3H]-Аспарагиновая кислотаPerkinElmerNET581001MC11,3 Ci/ммоль
(37 MBq)
D-глюкозаSigma AldrichG8270
N-метил-D-глюкаминSigma AldrichM2004
HEPESSigma AldrichH3375
Hidex 300 SLHidex Oy.Super Low Level #425-020
Ножницы для радужной оболочкиглаза Erwin Guth8,00,040
IsofluraneCristalia (Sã o Паулу, Бразилия)4,10,5251 мл/мл
KClSigma AldrichP3911
KH2PO4SigmaAldrichP0662
L-[3,4-3H]-глутаминовая кислотаPerkinElmerNET490005MC49,7 Ci/ммоль
(185 MBq)
MgCl2Sigma AldrichM8266
MgSO4Sigma AldrichM7506
Na2HPO4Sigma AldrichS9763
NaClSigma AldrichS9888
NaHCO3Sigma AldrichS5761
Пластиковая пипетка ПастераОбщие поставщики
Сцинтилляционная жидкостьPerkinElmer1200.437 для 1 x 5 литров OptiphaseHiSafe 3
Маленькие хирургические ножницыErwin Guth8,00,040
Маленький пинцетErwin Guth6,00,131
Запасные разделочные диски для измельчителяОбщие поставщики
Стандартные ножницыErwin Guth8,00,010
Тонкие щетки ( размер 0 или 2)Общие поставщики
Тонкий двусторонний шпательErwin Guth470.260E
Измельчитель тканейTed Pella, Inc.10180

Ссылки

  1. Knierim, J. J. The hippocampus. Current Biology. 25 (23), 1116-1121 (2015).
  2. Stella, F., Cerasti, E., Si, B., Jezek, K., Treves, A. Self-organization of multiple spatial and context memories in the hippocampus. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 36 (7), 1609-1625 (2012).
  3. Toyoda, H., et al. Interplay of amygdala and cingulate plasticity in emotional fear. Neural Plasticity. 2011, 813749(2011).
  4. Koehl, M., Abrous, D. N. A new chapter in the field of memory: adult hippocampal neurogenesis. European Journal of Neuroscience. 33 (6), 1101-1114 (2011).
  5. Bannerman, D. M., et al. Regional dissociations within the hippocampus--memory and anxiety. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 28 (3), 273-283 (2004).
  6. Moser, E., Moser, M. B., Andersen, P. Spatial learning impairment parallels the magnitude of dorsal hippocampal lesions, but is hardly present following ventral lesions. Journal of Neuroscience. 13 (9), 3916-3925 (1993).
  7. Spiers, H. J., Bendor, D. Enhance, delete, incept: manipulating hippocampus-dependent memories. Brain Research Bulletin. 105, 2-7 (2014).
  8. Gubert, P., et al. Low concentrations of methamidophos do not alter AChE activity but modulate neurotransmitters uptake in hippocampus and striatum in vitro. Life Sciences. 88 (1-2), 89-95 (2011).
  9. Andersen, J. V., et al. Extensive astrocyte metabolism of gamma-aminobutyric acid (GABA) sustains glutamine synthesis in the mammalian cerebral cortex. Glia. 68 (12), 2601-2612 (2020).
  10. Nonose, Y., et al. Guanosine enhances glutamate uptake and oxidation, preventing oxidative stress in mouse hippocampal slices submitted to high glutamate levels. Brain Research. 1748, 147080(2020).
  11. Rambo, L. M., et al. Creatine increases hippocampal Na(+),K(+)-ATPase activity via NMDA-calcineurin pathway. Brain Research Bulletin. 88 (6), 553-559 (2012).
  12. Papp, L., Vizi, E. S., Sperlagh, B. Lack of ATP-evoked GABA and glutamate release in the hippocampus of P2X7 receptor-/- mice. Neuroreport. 15 (15), 2387-2391 (2004).
  13. Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31 (3), 571-591 (1989).
  14. Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Progress in Neurobiology. 65 (1), 1(2001).
  15. Featherstone, D. E. Intercellular glutamate signaling in the nervous system and beyond. ACS Chem Neurosci. 1 (1), 4-12 (2010).
  16. Dong, X. X., Wang, Y., Qin, Z. H. Molecular mechanisms of excitotoxicity and their relevance to pathogenesis of neurodegenerative diseases. Acta Pharmaceutica Sinica B. 30 (4), 379-387 (2009).
  17. Grewer, C., Rauen, T. Electrogenic glutamate transporters in the CNS: molecular mechanism, pre-steady-state kinetics, and their impact on synaptic signaling. Journal of Membrane Biology. 203 (1), 1-20 (2005).
  18. Tzingounis, A. V., Wadiche, J. I. Glutamate transporters: confining runaway excitation by shaping synaptic transmission. Nature Reviews Neuroscience. 8 (12), 935-947 (2007).
  19. Vandenberg, R. J., Ryan, R. M. Mechanisms of glutamate transport. Physiological Reviews. 93 (4), 1621-1657 (2013).
  20. Peterson, A. R., Binder, D. K. Post-translational Regulation of GLT-1 in Neurological Diseases and Its Potential as an Effective Therapeutic Target. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 164(2019).
  21. Martinez-Lozada, Z., Guillem, A. M., Robinson, M. B. Transcriptional Regulation of Glutamate Transporters: From Extracellular Signals to Transcription Factors. Advances in Pharmacology. 76, 103-145 (2016).
  22. Carbone, M., Duty, S., Rattray, M. Riluzole elevates GLT-1 activity and levels in striatal astrocytes. Neurochemistry International. 60 (1), 31-38 (2012).
  23. Jimenez, E., et al. Differential regulation of the glutamate transporters GLT-1 and GLAST by GSK3beta. Neurochemistry International. 79, 33-43 (2014).
  24. Wang, C. H., et al. Radiotracer Methodology in the Biological, Environmental and Physical Sciences. , Prentice-hall. (1975).
  25. Karra, A. S., Stippec, S., Cobb, M. H. Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP. Journal of Visualized Experiments. (123), e55504(2017).
  26. Buskila, Y., et al. Extending the viability of acute brain slices. Scientific Reports. 4, 5309(2014).
  27. Cho, S., et al. Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Neurochemistry International. 45 (1), 117-127 (2004).
  28. Pringle, A. K., Sundstrom, L. E., Wilde, G. J., Williams, L. R., Iannotti, F. Brain-derived neurotrophic factor, but not neurotrophin-3, prevents ischaemia-induced neuronal cell death in organotypic rat hippocampal slice cultures. Neuroscience Letters. 211 (3), 203-206 (1996).
  29. Paniz, L. G., et al. Neuroprotective effects of guanosine administration on behavioral, brain activity, neurochemical and redox parameters in a rat model of chronic hepatic encephalopathy. Metabolic Brain Disease. 29 (3), 645-654 (2014).
  30. Hansel, G., et al. The potential therapeutic effect of guanosine after cortical focal ischemia in rats. PLoS One. 9 (2), 90693(2014).
  31. Cittolin-Santos, G. F., et al. Neurochemical and Brain Oscillation Abnormalities in an Experimental Model of Acute Liver Failure. Neuroscience. 401, 117-129 (2019).
  32. Westphalen, R. I., Hemmings, H. C. Effects of isoflurane and propofol on glutamate and GABA transporters in isolated cortical nerve terminals. Anesthesiology. 98 (2), 364-372 (2003).
  33. Lee, A. R., Kim, J. H., Cho, E., Kim, M., Park, M. Dorsal and Ventral Hippocampus Differentiate in Functional Pathways and Differentially Associate with Neurological Disease-Related Genes during Postnatal Development. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 331(2017).
  34. Thomazi, A. P., et al. Ontogenetic profile of glutamate uptake in brain structures slices from rats: sensitivity to guanosine. Mechanisms of Ageing and Development. 125 (7), 475-481 (2004).
  35. Nonose, Y., et al. Cortical Bilateral Adaptations in Rats Submitted to Focal Cerebral Ischemia: Emphasis on Glial Metabolism. Molecular Neurobiology. 55 (3), 2025-2041 (2018).
  36. Arriza, J. L., et al. Functional comparisons of three glutamate transporter subtypes cloned from human motor cortex. Journal of Neuroscience. 14 (9), 5559-5569 (1994).
  37. Aggarwal, S., Mortensen, O. V. In Vitro Assays for the Functional Characterization of the Dopamine Transporter (DAT). Current Protocols in Pharmacology. 79, 12(2017).
  38. MacGregor, D. G., Chesler, M., Rice, M. E. HEPES prevents edema in rat brain slices. Neuroscience Letters. 303 (3), 141-144 (2001).
  39. Moreira, J. D., et al. Dietary omega-3 fatty acids prevent neonatal seizure-induced early alterations in the hippocampal glutamatergic system and memory deficits in adulthood. Nutritional Neuroscience. , 1-12 (2020).
  40. Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current Neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
  41. Zuo, Z. Isoflurane enhances glutamate uptake via glutamate transporters in rat glial cells. Neuroreport. 12 (5), 1077-1080 (2001).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Радиоактивно меченный глутаматсрезы гиппокампагиппокамп грызуновтранспортеры нейромедиаторованализ ex vivoтранспортеры глутаматасинаптические цепинейрохимическая динамика

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.