Микрофлюидический подход к функциональному исследованию сигнальных колебаний, управляющих сомитогенезом

Краткое содержание

Предусмотрен протокол культивирования и манипуляции эмбриональной тканью мыши на микрофлюидном чипе. Применяя импульсы модуляторов пути, эта система может быть использована для внешнего управления сигнальными колебаниями для функционального исследования мышиного сомитогенеза.

Аннотация

Периодическая сегментация пресомитической мезодермы развивающегося эмбриона мыши контролируется сетью сигнальных путей. Считается, что сигнальные колебания и градиенты контролируют время и интервал формирования сегментов соответственно. В то время как вовлеченные сигнальные пути были широко изучены в течение последних десятилетий, прямые доказательства функции сигнальных колебаний в контроле сомитогенеза отсутствовали. Чтобы обеспечить функциональное исследование динамики сигнализации, микрофлюидика является ранее установленным инструментом для тонкой модуляции этой динамики. При таком подходе, основанном на микрофлюидике, эндогенные сигнальные колебания синхронизируются импульсами модуляторов путей. Это позволяет модулировать, например, период колебаний или фазовую зависимость между двумя колебательными путями. Кроме того, пространственные градиенты модуляторов путей могут быть установлены вдоль ткани для изучения того, как специфические изменения в сигнальных градиентах влияют на сомитогенез.

Настоящий протокол призван помочь установить микрофлюидные подходы для начинающих пользователей микрофлюидики. Описаны основные принципы и оборудование, необходимые для настройки микрофлюидной системы, а также предусмотрена конструкция чипа, с помощью которой можно удобно подготовить форму для генерации чипа с помощью 3D-принтера. Наконец, обсуждается, как культивировать первичную ткань мыши на микрофлюидном чипе и как увлекать сигнальные колебания внешними импульсами модуляторов пути.

Эта микрофлюидная система также может быть адаптирована для размещения других модельных систем in vivo и in vitro , таких как гаструлоиды и органоиды, для функционального исследования динамики передачи сигналов и градиентов морфогенов в других контекстах.

Введение

Развитие контролируется межклеточной связью через сигнальные пути. Существует только ограниченное количество сигнальных путей, которые организуют сложное формирование тканей и правильную дифференцировку клеток в пространстве и времени. Чтобы регулировать это множество процессов, информация может быть закодирована в динамике сигнального пути, изменения пути с течением времени, такого как частота или продолжительность ^{сигнала1,2}.

Во время сомитогенеза сомитическая ткань периодически сегментируется от пресомитической мезодермы (ПСМ)³. PSM пространственно организован по градиентам Wnt, фактору роста фибробластов (FGF) и передаче сигналов ретиноевой кислоты. В передней части PSM на фронте определения, где сигналы Wnt и FGF низкие, клетки загрунтованы для дифференцировки в сомиты. Дифференциация возникает, когда волна транскрипционной активации достигает этого фронта детерминации. Внутри PSM, Wnt, FGF и Notch колеблются сигналы. Соседние клетки немного колеблются вне фазы, что приводит к волнам колебательной транскрипционной активации вниз по течению от путей Wnt, FGF и Notch, проходящих от заднего к переднему PSM. У эмбрионов мышей транскрипционная волна достигает фронта определения примерно каждые 2 ч и инициирует образование сомита. Изучение сомитогенеза путем возмущения или активации сигнальных путей может проиллюстрировать важность этих путей4,5,6,7,8,9. Однако, чтобы иметь возможность исследовать функцию динамики передачи сигналов в контроле клеточного поведения, важно тонко модулировать сигнальные пути, а не постоянно активировать или ингибировать их.

Чтобы временно модулировать активность сигнального пути в сегментирующем эмбрионе мыши, Sonnen et al. разработали микрофлюидную ^{систему10}. Эта система позволяет жестко контролировать потоки жидкости в микроканалах чипа, содержащего биологический ^{образец11}. Для изучения важности динамики сигнализации для правильной сегментации PSM эта микрофлюидная установка используется для модуляции динамики сигнализации часов сегментации мыши ex vivo. Путем последовательного пульсирования активаторов или ингибиторов пути в культуральную камеру достигается внешний контроль динамики передачи сигналов Wnt, FGF и ^Notch10. Например, можно модифицировать период отдельных путей и фазовую зависимость между несколькими колебательными сигнальными путями. Используя сопутствующую визуализацию динамических сигнальных репортеров в режиме реального времени, можно проанализировать влияние уноса на сами пути, на дифференцировку и образование сомита. Используя этот уровень контроля над динамикой сигнализации, была подчеркнута важность фазовой зависимости между Wnt- и Нотч-сигнальными путями во время сомитогенеза10.

Персонализированные конструкции чипов позволяют использовать множество вариантов пространственно-временных возмущений в локальной среде, например, формирование стабильного градиента12,13,14,15, пульсационную активацию/ингибирование10,16,17,18 или локализованные возмущения19,20 . Микрофлюидика также может обеспечить более воспроизводимое считывание и более высокую пропускную способность благодаря автоматизации экспериментальной обработки21,22,23. Настоящий протокол предназначен для передачи микрофлюидики и увлечения эндогенными сигнальными колебаниями внутри тканей в каждую стандартную лабораторию наук о жизни. Даже при отсутствии сложного оборудования для генерации чипов, такого как чистая комната и оборудование для мягкой литографии, микрофлюидные чипы могут быть изготовлены и использованы для решения биологических вопросов. Пресс-формы могут быть спроектированы с использованием свободно доступного программного обеспечения автоматизированного проектирования (CAD). Пресс-форма для генерации микрофлюидных чипов, обычно состоящая из полидиметилсилоксана (PDMS), может быть напечатана на 3D-принтере или заказана у полиграфических компаний. Таким образом, микрофлюидные чипы могут быть изготовлены в течение одного дня без необходимости дорогостоящего ^{оборудования24}. Здесь представлена конструкция чипа, с помощью которого с помощью 3D-принтера можно напечатать форму для утомления часов сегментации мыши в двумерных (2D) ex vivo ^{культурах25}.

Встроенные культуры и точные возмущения, обеспечиваемые микрофлюидикой, обладают выдающимся потенциалом в разгадке молекулярных механизмов того, как сигнальные пути контролируют многоклеточное поведение. Динамика передачи сигналов и градиенты морфогенов необходимы для многих процессов развития. Ранее лаборатории культивировали клетки, ткани и целые организмы в микрофлюидных чипах, а протоколы для пространственно-временного возмущения в основном 2D-культуры клеток представлены в другом месте12,26,27,28,29. Применение микрофлюидики для модуляции локальных сред в многоклеточных системах открывает новые перспективы для высокопроизводительных и точных пространственно-временных возмущений. Область микрофлюидики в настоящее время достигла точки, что она стала неспециализированным, недорогим и легко применимым инструментом для биологов развития.

Здесь приведен протокол для уноса часов сегментации мыши к импульсам сигнального ингибитора Notch. Такой эксперимент состоит из следующих этапов: (1) генерация микрофлюидного чипа, (2) подготовка трубки и покрытия чипа и (3) сам микрофлюидный эксперимент (рисунок 1А). Исследования, связанные с модельными системами позвоночных, требуют предварительного этического одобрения со стороны ответственного комитета.

Протокол

Исследование, представленное здесь, было одобрено комитетом по этике ^EMBL10 и голландским комитетом по исследованиям животных (dierenexperimentencommissie, DEC) и соответствует руководящим принципам Хубрехта по уходу за животными.

Надевайте перчатки при работе с жидким PDMS. Покрытие поверхностей и оборудования. Немедленно удалите любые разливы, так как очистка становится трудной, как только она затвердевает.

1. Генерация чипа

ПРИМЕЧАНИЕ: Микрофлюидные чипы генерируются путем литья PDMS (полидиметилсилоксан) в пресс-форме. Пресс-формы могут быть спроектированы с использованием программного обеспечения CAD (например, uFlow или ^3DμF30). Репозиторий свободных дизайнов предоставляется MIT (Metafluidics.org). Пресс-формы либо печатаются с помощью 3D-принтера, либо могут быть сгенерированы мягкой литографией с использованием фотомаски, содержащей желаемый дизайн (для получения дополнительной информации см., например, Qin et al., 201031). Здесь представлен дизайн формы, которая может быть напечатана с помощью 3D-принтера для встроенной культуры ткани эмбриона мыши (рисунок 1B, C, дополнительные файлы 1 и 2). Чтобы разрешить печать на 3D-принтерах с более низким разрешением, дизайн был изменен по сравнению с ранее опубликованным ^one10. Предусмотрена форма без пузырьковых ловушек воздуха и форма с пузырьковыми ловушками воздуха (Дополнительные файлы 1 и 2 соответственно). Поскольку процедура печати зависит от доступного принтера, сведения о печати описываться не будут. Тем не менее, нужно убедиться, что вся неполимеризованная смола полностью удалена. Часто требуется выполнить дополнительную промывку растворителями для удаления неполимеризованной смолы из небольших отверстий <200 мкм в микрофлюидной камере. Эти отверстия будут образовывать столбы PDMS для захвата эмбриональной ткани внутри чипа во время эксперимента. PDMS обычно используется для микрофлюидики, так как она дешевая, биосовместимая и прозрачная, а также имеет низкую автофлуоресценцию. После отверждения чип PDMS вырезается из формы и скрепляется на стеклянной горке. Плазменная обработка как стекла, так и чипа PDMS активирует поверхности и позволяет образовывать ковалентные связи при контакте.

1. Получают необходимое количество PDMS путем смешивания мономера с катализатором в соотношении 9:1 (w:w) для индуцирования полимеризации. Используйте одноразовые инструменты для смешивания, такие как пластиковые стаканчики и вилки. Убедитесь, что смешивание выполнено правильно.
2. Поместите смесь PDMS в осушитель и примените вакуум в течение примерно 30 минут, чтобы удалить воздух из смеси PDMS. Из-за вакуума внутри адсорбцика воздух будет удален из смеси PDMS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Накройте внутреннюю часть осушителя тканями на случай, если PDMS перетечет.
3. Вылейте смесь PDMS в форму для стружки (достаточно слоя PDMS примерно 3-5 мм).
4. Поместите форму, заполненную PDMS, обратно в осушитель и приложите вакуум, чтобы удалить оставшиеся пузырьки. Убедитесь, что воздух удален из всех более мелких структур формы.
5. Отверните форму, поместив ее в печь с температурой 65 °C (или ниже в зависимости от материала формы) на ночь. Вырежьте чип из формы с помощью скальпеля. Вырежьте затвердевший PDMS из формы с достаточным пространством (1-2 см) вокруг конструкции, чтобы обеспечить последующее склеивание. Обязательно полностью вырежьте PDMS, чтобы предотвратить поломку чипа при его извлечении. Осторожно поднимите чип PDMS, сначала тупым концом скальпеля, а по возможности руками.
6. Пробивайте входные и выходные отверстия, начиная с внутренней стороны микрофлюидной камеры с помощью 1 мм биопсийного перфоратора.
7. Кратковременно очистите чип PDMS сжатым воздухом и наклейте клейкую ленту с обеих сторон, чтобы удалить все застрявшие кусочки PDMS и пыли, и сохраните его в чистоте до дальнейшего использования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чип можно хранить таким образом до дальнейшего использования.
8. Очистите стеклянную горку сжатым воздухом. Будьте осторожны, чтобы он не сломался. Снимите клейкую ленту с чипа PDMS.
9. Прикрепите чип к стеклянному слайду с помощью плазменной печи. Следующие инструкции оптимизированы для воздушной плазмы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к руководству плазменной печи лаборатории и оптимизируйте процедуру для конкретного эксперимента.
   1. Поместите стружку и стекло в плазменную печь с помощью сторон, которые должны быть склеены вверх.
   2. Поместите крышку на плазменную печь и удерживайте ее на месте, применяя вакуум, и подождите, пока вакуум не установится.
   3. Включите газ, нажав кнопку «Газ», и подождите примерно 1 минуту (давление должно быть около 0,37 мбар).
   4. Генерация плазмы нажатием кнопки Генератор (Мощность: 9.0, Время: 1 мин).
   5. Когда закончите, выключите насос и газ; проветрить и открыть дверь.
   6. Прикрепите чип к стеклу, поместив активированные поверхности друг на друга и равномерно приложив давление. Будьте осторожны, чтобы стекло не разбилось.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тест на воду может быть выполнен для подтверждения того, что плазменная обработка сработала. Поместите каплю воды на поверхность стекла. Если плазменная обработка сработала, вода должна немедленно распределиться, а не образовывать каплю.
10. Поместите склеенный чипс в духовку при температуре 65 °C на 5 мин.
11. Запечатайте открытую сторону чипа клейкой лентой, чтобы предотвратить попадание пыли на входные отверстия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чип можно хранить до использования. До тех пор отверстия должны быть закрыты скотчем.

2. Подготовка эксперимента по микрофлюидике

ПРИМЕЧАНИЕ: Для выполнения эксперимента по микрофлюидике необходимы следующие подготовительные шаги: Во-первых, при выполнении эксперимента с микрофлюидикой создается поток жидкости от входных отверстий к выходам. Любые отверстия в чипе будут функционировать как выпускные отверстия из-за повышения давления из входных отверстий. Поэтому все отверстия, которые не используются, должны быть закрыты; например, отверстия, которые используются для загрузки ткани на чип. Если они не закрыты, ткань может вытекать вместе с жидкостью. Для закрытия этих отверстий используются трубки, заполненные PDMS. Трубки, заполненные PDMS, могут храниться бесконечно и, следовательно, не нужно будет готовить для каждого эксперимента с микрофлюидикой отдельно, но могут быть изготовлены более крупными партиями. Во-вторых, перед началом микрофлюидного эксперимента подготавливают и стерилизуют трубки, заполненные PDMS трубки и чип, необходимый для эксперимента. Наконец, чип должен быть покрыт фибронектином, чтобы эмбриональная ткань могла прикрепляться к ^{стеклу25}.

1. Изготовление НБДМС-заполненных трубок.
   1. Возьмите ±1 м трубки. Больше трубок можно заполнить PDMS, взяв несколько кусков трубки.
   2. Получают необходимое количество PDMS путем смешивания мономера с катализатором в соотношении 9:1 (w:w) для индуцирования полимеризации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте одноразовые инструменты для смешивания, такие как пластиковые стаканчики и вилки. Правильно перемешать.
   3. Поместите смесь PDMS в осушитель и примените вакуум в течение примерно 30 минут, чтобы удалить воздух из смеси PDMS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Накройте внутреннюю часть осушителя тканями на случай, если PDMS перетечет.
   4. Наполните шприц объемом 3 мл PDMS. Заполняйте осторожно, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха в смеси.
   5. Используйте щипцы, чтобы вставить наконечник иглы весом 22 г в трубку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не проколоть трубку или пальцы иглой.
   6. Прикрепите трубку к шприцу, заполненному PDMS, с помощью иглы. Используйте шприцевой насос для заполнения трубки со скоростью потока приблизительно 500 мкл/ч. Будьте осторожны, чтобы не применять слишком высокое давление, чтобы предотвратить поломку насоса.
   7. Как только трубка будет полностью заполнена PDMS, поместите ее в 15-сантиметровую посуду и вылечите при комнатной температуре (по крайней мере, на ночь).
2. Подготовьте трубку и чип для эксперимента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для эксперимента требуется следующая трубка: во-первых, приблизительно 50 см трубки на выходное отверстие, а во-вторых, примерно 2-3 м на входное отверстие (точный размер зависит от пространственной организации насосов, инкубатора или микроскопа, используемых позже). Впускная трубка должна быть длинной, чтобы культуральная среда могла уравновешиваться с _CO2 для культивирования эмбрионов во время эксперимента.
   1. Разрезать трубку под углом 45° таким образом, чтобы образовались заостренные концы; это облегчит вставку трубки в отверстия чипа. Прикрепите по одной игле к каждой входной трубке. См. шаг 2.1.5.
   2. Нарежьте заполненные PDMS трубки на пробки ±1 см. Разрезать под углом 45° таким образом, чтобы создавались заостренные концы; это облегчит вставку трубки в отверстия чипа. Достаточное количество пробок необходимо для заполнения каждого отверстия, которое не прикреплено к какой-либо трубке.
   3. Снимите клейкую ленту с чипа.
   4. Поместите всю трубку с прикрепленными иглами, чипом и пробками в чашку и стерилизуйте, подвергая воздействию ультрафиолетового света в течение ±15 мин. Можно использовать любую вытяжку для культивирования клеток с возможностью УФ-стерилизации.
3. Покрытие чипа фибронектином.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для культивирования 2D ex vivo культур задней ПСМ, покройте чип фибронектином.
   1. Поместите чип в стакан, содержащий PBS + 1% пенициллина/стрептомицина при комнатной температуре. Убедитесь, что чип полностью покрыт PBS. Промывайте чип PBS, чтобы удалить воздух с помощью пипетки P200.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вся дальнейшая обработка чипа будет производиться в этом стакане до начала эксперимента, чтобы предотвратить попадание воздуха в чип. Будьте осторожны, чтобы не разбить стеклянную горку чипа.
   2. Приготовьте 2 мл фибронектина 1:20 в PBS и заполните стаканом.
   3. Загрузите шприц объемом 3 мл для каждой камеры чипа. Щипцами вставьте иглу весом 22 г в выпускную трубку. Прикрепите иглу к шприцу, содержащему фибронектин.
   4. Подключите шприц к шприцевому насосу. Промывайте трубку, пока в трубке не останется воздуха.
   5. Прикрепите выпускную трубку к выходному отверстию чипа. Обязательно продвиньте трубку до самого низа. Установите низкий расход для покрытия чипа. Все остальные отверстия могут оставаться открытыми. Дайте шприцевому насосу работать не менее 2 часов, также может работать в течение ночи.
   6. Остановите насос. Отрежьте трубку сразу после иглы. Оставшаяся трубка будет служить выходом во время эксперимента позже.

3. Эксперимент с микрофлюидикой

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь представлен протокол для захвата часов сегментации мыши в культурах 2D ex vivo путем применения импульсов сигнального ингибитора Notch DAPT. Применение импульсов с периодом 130 мин, близким к естественному периоду мышиных часов сегментации (137 ^мин25), позволяет эффективно захватывать. Применяются импульсы 100 мин среды и 30 мин 2 мкМ DAPT (рисунок 2А). Присутствие препарата внутри чипа контролируется с помощью флуоресцентного красителя. Спектры возбуждения и излучения этого красителя и флуоресцентного сигнального репортера должны быть достаточно разными, чтобы предотвратить кровотечение во время флуоресцентной визуализации в режиме реального времени. Когда желтые флуоресцентные белки используются в качестве сигнального репортера, такого как сигнальный репортер Notch ^LuVeLu5 (Lunatic fringe-Venus-Lunatic fringe), может быть применен краситель Cascade Blue. Для идентификации других возможных комбинаций флуоресцентного красителя и репортера можно использовать свободно доступный просмотрщик спектров. Эффект увлечения может быть обнаружен с помощью визуализации в режиме реального времени динамических сигнальных репортеров5,10,32. Каждый чип имеет две инкубационные камеры. Это позволяет проводить прямое сравнение лекарственных импульсов (DAPT) с контрольными импульсами (DMSO).

1. Делают средний и дегаз.
   1. В день эксперимента готовят 50 мл питательной среды (DMEM-F12 дополняют 0,5 мМ глюкозы, 2 мМ глутамина и 1% BSA, для получения дополнительной информации о культуре мышиного хвоста ^см.25).
   2. Подготовьте шприцы, наполненные средой для эксперимента. Подготовка питательной среды в стаканах: Чтобы уловить сигнальные колебания Notch, приготовьте 6 мл среды с 1,2 мкл DMSO + 10 мкМ Cascade Blue; 6 мл питательной среды с 2 мкМ DAPT + 10 мкМ Cascade Blue; две трубки по 6 мл среды в каждой. Используйте не менее 6 мл среды на шприц. Нагрузите шприцы средой. Обязательно маркируйте шприцы, содержащие препарат и ДМСО.
   3. Дегазируйте чип внутри PBS и шприцы, содержащие среду в осушителе. Поместите шприцы в стакан с наконечником вверх, чтобы воздух мог выйти наверх. Может случиться так, что чип плавает и все еще заполнен пузырьками. Впоследствии они будут удалены.
   4. Попробуйте смыть/высосать большую часть пузырьков воздуха из чипа с помощью пипетки P200. Если останется немного воздуха, он будет удален во время следующего эксперимента.
   5. Установите шприцы в насосы и прикрепите к шприцам впускную трубку. Чтобы захватить передачу сигналов Notch, используйте два шприцевых насоса, один из которых несет средние шприцы, а другой - шприцы с лекарством / DMSO. Пусть это работает с более высокой скоростью потока (0,5 мл / ч) до начала эксперимента по удалению пузырьков воздуха из трубки. Будьте осторожны, чтобы правильно установить детали шприца (диаметр) в насосе.
2. Загрузка ткани на чип.
   1. Рассечение ткани эмбриона мыши. Рассекайте самый задний кончик хвоста (хвостовой бутон). Поместите рассеченную ткань в культуральную среду + 25 мкМ HEPES.
   2. Промывайте чип питательной средой + 25 мкМ HEPES с помощью P200 для удаления PBS.
   3. Загрузите ткань в чип с помощью пипетки P200 (рисунок 1C). Убедитесь, что вы не вводите пузырьки воздуха в чип.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективная загрузка требует некоторой практики. Если ткань не ориентирована должным образом, ее можно повернуть, осторожно высасывая и снова промывая. Однако это часто приводит к быстрой гибели клеток.
   4. После каждого этапа загрузки ткани закройте соответствующее входное отверстие, нагружающее ткань, используя кусок трубки, заполненной PDMS. Убедитесь, что заглушки достаточно сдвинуты на дно чипа с помощью тупого пинцета.
   5. После того, как все образцы будут загружены, закройте все неиспользуемые входы/выпускные отверстия кусками заполненных PDMS труб с помощью тупых щипцов.
3. Сборка микрофлюидной установки.
   1. Снижение расхода микрофлюидных насосов. 60-100 мкл/ч хорошо работает для хвостовых почек эмбриона мыши. При более высоких скоростях потока наблюдалась гибель клеток — предположительно из-за слишком высокой сдвига клеток. Совокупный расход нескольких насосов не должен превышать этих 60-100 мкл/ч на микрофлюидную камеру в данный момент времени.
   2. Прикрепите трубку к микрофлюидному чипу. Делайте это, не получая пузырьков воздуха внутри чипа (этого можно достичь, убедившись, что в конце трубки присутствует капля среды). Выходы все еще присутствуют из фибронектинового покрытия (см. 2.3).
   3. После того, как вся трубка прикреплена к чипсу, выньте ее из стакана, высушите должным образом, поместите в чашку и положите ее вместе с примерно 1,5 м входной трубки в инкубатор (37 ° C, 20% _O2, 5% _CO2) для ночной культуры. Трубка газопроницаемая; это позволит уравновесить _O2 и _CO2 в среде. Альтернативно, для одновременной флуоресцентной визуализации в режиме реального времени чип и приблизительно 1,5 м впускную трубку помещают непосредственно в микроскоп. Держатель для чипа, который помещается в стандартные держатели пластин с 96 скважинами, предусмотрен в дополнительном файле 3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что влажность достаточно высока во время инкубации. При необходимости добавьте влажную ткань в камеру визуализации или инкубатор, чтобы предотвратить испарение в микрофлюидике. Если влажность в микроскопическом инкубаторе слишком низкая, это приводит к образованию пузырьков воздуха в трубке и микрофлюидном чипе. Затем можно использовать закрытую коробку для визуализации, в которую помещаются чип и трубки. Самый простой способ сделать такую коробку для визуализации - это поместить большую крышку над чипом и добавить влажную ткань, ее не нужно полностью закрывать. Убедитесь, что разница в высоте между насосом и стружкой не слишком велика и при необходимости медленно меняйте высоту, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха из-за силы тяжести.
   4. Пусть все насосы текут со скоростью 20 мкл/ч в течение 20 мин, после того, как установка будет помещена в ее окончательное место. Поскольку камера и насос, скорее всего, переместились по высоте, это необходимо для восстановления правильного давления в трубке.
   5. Выключите насос для лекарств, дайте только среднему насосу работать со скоростью 60 мкл /ч до начала эксперимента / визуализации в режиме реального времени.
4. Начало эксперимента.
   1. Запустите запланированную программу откачки для эксперимента. Чтобы увлечь передачу сигналов Notch, используют программу прокачки 100 мин средних и 30 мин лекарственного импульсов, которая повторяется до конца эксперимента, как правило, в течение 24 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать любой программируемый микрофлюидный насос. В простейшем формате насосы могут быть запрограммированы и запущены вручную. Альтернативно, насосами можно управлять с помощью компьютерного программного обеспечения.
   2. В случае, если выполняется визуализация в режиме реального времени, начните визуализацию через период не менее 30 минут. Это позволит температуре чипа регулировать температуру внутри инкубатора и предотвратить слишком сильный дрейф во время визуализации. Автофокус по-прежнему выгоден.
   3. Выполняйте стандартную конфокальную визуализацию с помощью стеклянного слайда чипа с помощью инвертированного микроскопа. Используйте интервал визуализации 10 мин для достаточного обнаружения сигнальных колебаний с периодом 130 мин.
   4. Для более коротких периодов времени сократите интервал для достаточного отбора проб. Включите трек изображения с низким разрешением для обнаружения Cascade Blue для визуализации присутствия препарата на чипе.
   5. Для возбуждения венеринского репортера используют 515 нм лазер или 2-фотонный лазер на длине волны 960 нм.
   6. Получите z-стек из 6-8 плоскостей с расстоянием 8 мкм через цель 20-кратного плана (разрешение 512 x 512 пикселей, 1,38 мкм/пиксель). Используйте моторизованный этап для визуализации нескольких образцов в рамках одного эксперимента.
   7. Возбуждайте Cascade Blue с помощью лазера 405 нм и приобретайте одну z-плоскость каждые 10 минут (разрешение 32 x 32 пикселя, 22,14 мкм/пиксель).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительная информация о визуализации и анализе изображений приведена в Репрезентативных результатах и может быть найдена в ^{ссылке10}.

Результаты

С помощью этого протокола представлен метод внешнего уноса сигнальных колебаний часов сегментации мыши с использованием микрофлюидики. Применяя импульсы сигнального ингибитора Notch, сигнальные колебания в независимых эмбриональных культурах синхронизируются друг с ^{другом10}. Предпосылкой применения данной системы для изучения функциональности тактовых импульсов сегментации является то, что динамика сигнализации и сегментация все еще присутствуют на кристалле. Ранее было показано, что динамика передачи сигналов Wnt и Notch сохраняется, несмотря на постоянный поток среды, а формирование физических границ сохраняется в периферических 2D-культурах, представляющих передний ^PSM10.

Для подтверждения уноса сигнальных колебаний внешним лекарственным импульсам во время микрофлюидного эксперимента проводится визуализация в режиме реального времени, например, сигнального репортера Notch LuVeLu5, экспрессирующего желтый флуоресцентный белок Venus. Поскольку ориентацию 2D-культур на чипе трудно контролировать, анализируются сигнальные колебания в передней ткани. Периферия 2D-культуры может быть воспроизводимо обнаружена. Ориентация участков ткани на чипе не может контролироваться по желанию, и вся внутренняя поверхность чипа покрывается фибронектином. Поэтому изредка случается так, что культуры прикрепляются к бокам или потолку чипа. В случае, если образцы выходят за пределы поля зрения (в направлении x, y и z) или прикрепляются задним концом хвоста, обращенным вниз, обычно эти образцы исключаются.

Для дальнейшего анализа объединены множественные из таких экспериментов по увлечению. Независимые эксперименты могут быть выровнены друг с другом с использованием времени импульсов лекарственного средства, визуализированных красителем Cascade Blue, примерно на 400 нм. Для анализа и визуализации синхронизации количественные колебания могут быть детрендированы (рисунок 2B, D), а затем либо отображены как среднее и стандартное отклонение, либо могут быть рассчитаны фазы колебаний. Это позволяет проанализировать фазовую зависимость между колебаниями независимых задних культур эмбрионов друг к другу и к внешним лекарственным импульсам (рис. 2С,Е). Программа ^pyBOAT33 на основе python является простым и удобным инструментом для определения периода, фазы и амплитуды таких сигнальных колебаний. Для подтверждения увлечения можно, например, определить период эндогенных сигнальных колебаний. При применении импульсов с периодом 130 мин сигнальные колебания Notch также показывают период 130 мин (рисунок 2F)¹⁰. Кроме того, используя импульсы Cascade Blue, независимые эксперименты с различными сигнальными репортерами могут быть выровнены друг с другом. Таким образом, фазовая зависимость между колебаниями нескольких сигнальных репортеров может быть косвенно ^{определена10}.

Таким образом, представленная микрофлюидная система позволяет контролировать сигнальные колебания в культурах ex vivo развивающегося эмбриона мыши. В сочетании с визуализацией маркеров для формирования и дифференциации сегментов эта система теперь может быть применена для анализа того, как взаимодействуют сигнальные пути часов сегментации и как они контролируют образование сомита.

Рисунок 1: Схематический обзор протокола микрофлюидики. (A) Формы микросхем могут быть спроектированы с использованием программного обеспечения автоматизированного проектирования (CAD). Предусмотрена конструкция микросхемы для улавливания сигнальных колебаний в моделях ex vivo мышиного сомитогенеза. Пресс-формы могут, например, быть сгенерированы с помощью 3D-печати или заказаны. Микрофлюидные чипы производятся методом формования PDMS. Закаленный чип PDMS вырезается и ковалентно скрепляется со стеклянным затвором с помощью плазменной печи. Стеклянная поверхность внутри чипа покрыта фибронектином, чтобы позволить рассеченной ткани прикрепляться. Эмбриональная ткань загружается на чип через загрузочные входы, которые впоследствии закрываются. Насосы с различными условиями среды прикрепляются к входным отверстиям чипа и инициализируется проточная программа. Ткань может быть изображена с помощью конфокального микроскопа во время эксперимента. (Kymographs адаптировано из Sonnen et al., 201810. Перепечатано и изменено из Cell в соответствии с Creative Commons Attribution CC BY-NC-ND 4.0.) (B) Схематический чертеж конструкции пресс-формы для культивирования на чипе задней ткани эмбриона мыши. Высота микрофлюидных каналов составляет 500 мкм, достаточная для культивирования задних эмбриональных хвостов мыши. Файл для печати этой формы предоставляется в дополнительном файле 1, а альтернативный файл приведен в дополнительном файле 2. (C) Яркое изображение разрезанного мышиного хвоста E10.5, заключенного в штыки PDMS на кристалле. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Репрезентативные результаты эксперимента по микрофлюидике. (А) Схематическое представление эксперимента по уносу со средой и лекарственным насосом. Импульсы модулятора сигнального пути применяются к культурам ex vivo эмбрионов мышей, а сигнальные колебания могут быть визуализированы с помощью визуализации в реальном времени динамических сигнальных репортеров (например, сигнального репортера Notch ^LuVeLu5 и сигнального репортера Wnt Axin2T2A10). Пунктирные линии указывают регион, который используется для анализа с течением времени. (Б-Ф) Репортерные колебания LuVeLu увлекаются периодическими импульсами сигнального ингибитора Notch DAPT. (Б,Г) Количественные определения сигнальных колебаний Notch в передней PSM при захвате с использованием DAPT или элемента управления DMSO. (С,Э) Графики фазово-фазового соотношения между фазой сигнальных колебаний Notch и синхронизацией внешних импульсов DAPT/DMSO. В случае увлечения устанавливается устойчивая фазовая зависимость. (F) Количественная оценка среднего периода и SEM репортерных колебаний для сравнения образцов, захваченных импульсами DMSO и DAPT. (Рисунок взят из Sonnenet al., 201810. Перепечатано и изменено из Cell в соответствии с Creative Commons Attribution CC BY-NC-ND 4.0.). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Проблема	Предлагаемое решение (решения)
PDMS не прикрепляется к стеклу.	- Убедитесь, что и PDMS, и стекло чистые.
	- Убедитесь, что вокруг камеры достаточно PDMS для склеивания.
	- Оптимизировать настройки плазменной печи.
На моем чипе есть пузырьки воздуха.	- Проверьте, включен ли насос.
	- Дегазировать чип перед загрузкой ткани на чип.
	- Дега среды перед началом эксперимента.
	- Убедитесь, что влажность в инкубационной камере достаточно высока.
Ткань отмирает в начале эксперимента.	- Добавление HEPES к среде при загрузке и сборке чипа.
	- Не промывайте ткань внутрь и наружу слишком часто во время загрузки.
	- Проверьте, чтобы скорость потока не была слишком высокой.
Ткань отмирает во время визуализации.	- Убедитесь, что нет фототоксичности от изображения
	- Убедитесь, что нет загрязнения.
	- Расход не должен быть слишком высоким.
Фокус изменяется во время визуализации.	- Используйте автофокус во время визуализации, чтобы настроить дрейф слайда изображения.
	- Пусть чип уравновесится до температуры в микроскопе в течение не менее 30 минут.
Розетки/входные отверстия отсоединяются.	- Толкните все трубки полностью вниз на дно.
Стекло чипа разбивается.	- Будьте более осторожны, стекло очень хрупкое.
	- Тонкое стекло требуется только для визуализации. Если визуализация не выполняется, можно использовать обычный более толстый стеклянный слайд.
	- Если разрыв находится за пределами чипа, это может не быть проблемой. Если стеклянное уплотнение к чипу сломается, жидкость вытечет наружу, и воздух войдет.
На моем чипе есть загрязнение.	- Добавить антибиотики в культуральную среду.
	- Стерилизовать все оборудование и трубки.
	- Работа быстро и чисто.

Таблица 1: Устранение неполадок

Дополнительный файл 1: Файл STL для печати пресс-формы с помощью 3D-принтера. Эта форма используется для генерации микрофлюидного чипа для культивирования на чипе задней эмбриональной ткани (конструкция показана на рисунке 1). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: Файл STL для печати пресс-формы с помощью 3D-принтера для генерации микрофлюидного чипа для культивирования задней эмбриональной ткани. В отличие от дополнительного файла 1 и конструкции, показанной на рисунке 1, эта конструкция содержит пузырьковые ловушки на всех входах для предотвращения попадания небольшого количества воздуха в основную микрофлюидную камеру. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 3: Проектный файл для генерации держателя для помещения чипа в микроскоп. Этот держатель имеет размеры 96-луночной пластины и должен помещаться в стандартные держатели большинства микроскопов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Как динамика сигнализации управляет многоклеточными системами, было давним вопросом в этой области. Функциональное исследование представляет собой ключевую проблему, потому что эта динамика должна быть тонко модулирована, чтобы сделать ^это11. Такой временной контроль над возмущениями пути в принципе может быть достигнут с помощью оптогенетики, что также обеспечивает высокий пространственный ^{контроль34}. Однако оптогенетика требует создания сложных генетических инструментов для анализа каждого рассматриваемого сигнального пути. Текущий протокол, описанный здесь, предоставляет очень универсальный инструмент для возмущения любого сигнального пути. Эксперимент с микрофлюидикой позволяет применять импульсы с временным контролем препарата для функционального исследования динамики сигнальных путей в тканевых культурах. Здесь основное внимание уделяется изучению сомитогенеза в культурах ex vivo , но протокол может быть адаптирован к любым другим модельным системам.

Определенные шаги в протоколе имеют решающее значение для проведения успешного эксперимента по микрофлюидике (обобщено в таблице 1). Ключевые моменты обсуждаются следующим образом. Из-за течения среды в ходе эксперимента культура тканей испытывает напряжение сдвига. Воздействие непрерывного потока на модельную систему может вызвать клеточный стресс и в крайних случаях гибель клеток из-за эффекта сдвига. Было обнаружено, что для культур тканей ex vivo мышиных хвостов и текущей конструкции чипа скорость потока 60 мкл / ч (максимум 100 мкл / ч) хорошо работает с минимальным эффектом сдвига. Когда несколько насосов включаются одновременно для одной и той же стружки, расход отдельных насосов необходимо соответствующим образом регулировать, чтобы не вызвать увеличения общего расхода. Когда текущий протокол адаптирован к другим модельным системам и конструкциям чипов, скорость потока должна быть оптимизирована. В качестве альтернативы можно не промывать среду непрерывно, а периодически менять среду на ^чипе35. Такая установка также может быть применена для управления сигнальными колебаниями в сомитогенезе мыши (неопубликованные, данные не показаны). Кроме того, можно представить себе установку, в которой культуры тканей не подвергаются воздействию прямого потока жидкости, но лекарства достигают ткани путем диффузии из соседнего канала. Такие системы успешно используются для применения градиентов факторов роста к моделям дифференциации ЭКУ in ^vitro14,36.

Одной из основных проблем микрофлюидных экспериментов является появление пузырьков воздуха на чипе во время эксперимента. Пузырьки воздуха внутри чипа или трубки могут мешать равномерному потоку жидкости на чипе и могут привести к удалению культуры эмбриона из ее местоположения. Чтобы предотвратить наличие пузырьков воздуха, необходимы различные этапы протокола. Во-первых, культуральная среда внутри шприцев и сам микрофлюидный чип должны быть дегазированы с помощью адсорбциатора (этап 3.1.3). Во-вторых, при загрузке образцов в загрузочные отверстия необходимо соблюдать осторожность, чтобы не поставлять воздух в стружку вместе с образцом (этап 3.2.3). В-третьих, при заполнении трубки средой все пузырьки воздуха должны быть откачаны перед присоединением стружки (этап 3.3.2). В противном случае эти пузырьки будут выталкиваться в основной чип во время эксперимента. Наконец, во время эксперимента среда уравновешивается в камере визуализации или инкубаторе благодаря полупроницаемой трубке. Проницаемость трубки также позволяет испарять среду, поэтому убедитесь, что влажность регулируется во время эксперимента, чтобы предотвратить образование новых пузырьков в трубке.

В целом, микрофлюидика является очень универсальным инструментом, который может быть адаптирован к конкретному вопросу исследователя. Современный подход к проектированию позволяет создавать изображения до 12 культур ex vivo параллельно на чип. Это число в основном ограничено количеством эмбрионов в эксперименте и временем, необходимым для изображения каждой культуры эмбриона с достаточным разрешением. Если в одном эксперименте необходимо сравнить несколько условий, несколько чипов могут быть установлены на одном стеклянном слайде. Предусмотрена конструкция чипа, которая идеально подходит для параллельного изображения нескольких тканевых эксплантов, но персонализированные конструкции могут преодолеть ограничения в количестве образцов, чтобы обеспечить высокую пропускную способность анализа и увеличить комбинацию большего количества условий в рамках одного ^{эксперимента16,17}. Микрофлюидика ограничена моделями, которые могут быть культивированы на чипе, а культура на чипе должна быть оптимизирована для каждой модельной системы индивидуально27,37,38.

В течение последних 5-10 лет микрофлюидика применялась для решения различных биологических вопросов из-за ее потенциала для высокопроизводительных подходов и тонких модуляций динамики и градиентов сигнализации. В настоящее время микрофлюидика стала легко применимым, дешевым и универсальным инструментом, который лаборатории могут легко создать. Здесь текущий протокол оптимизирован для конкретного применения, а именно, изучения динамики сигнализации, управляющей сомитогенезом. Легко адаптировать этот протокол и дизайн в соответствии с индивидуальными исследовательскими вопросами в биологии тканей.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Шприц 10 мл	Becton, Dickinson and company	300912
184 Силиконовый эластомер отвердитель	SYLGARD	1673921
184 Силиконовый эластомер PDMS	SYLGARD	1673921
3 мл шприцы	Becton, Dickinson and company	309657
Клейкая лента			Scotch Magic или аналогичная
Щипцы с тупым наконечником Bochem 18/10 Нержавеющая сталь	Fisher Scientific	10663341
Бычий сывороточный альбумин Лиофилизированный pH~7	Biowest	P6154
Система
Кристаллизационная чашка	VWR	10754-7	Стерилизованная
D-(+)-глюкоза 45%	Sigma	G8769
Десикатор	VWR	467-0104
Одноразовые стаканчики	Duni	173 941
Одноразовые вилки	Скобы	511514
Оборудование для
DMEM/F12	Технологии клеточных культур	на заказ	DMEM/F-12, без фенола красного, без L-глутамина, без глюкозы
Фибронектин	Sigma	F1141-5MG
Вытяжка BioVanguard Greenline	CleanAir by Baker	511514	Для источника ультрафиолетового света
Предметное стекло No 1,5H высокая точность, 70x70 мм	Marienfeld	107999098
HEPES Buffer	Gibco	15630-056
L-глутамин	Gibco	25030024
Микроскоп	Leica	Leica SP8 MP
Иглы 22G	Becton, dickinson и компания	z412139-100EA
Духовка	VWR	390-09
PBS0
Пенициллин-стрептомицин	Gibco	15070063
Плазменная печь Femto	Diener электронная
Punch Ø 1мм	Uni-Core	WB100073
масштаб	Sartorius	Entris
Шприцевой насос	WPI	AL-4000
Трубка и Oslash; 1 мм	APT	AWG24T
Вакуумный насос	VWR	181-0308