Методическая статья

Высокопроизводительный анализ транскриптома для исследования взаимодействий хозяина и патогена

DOI:

10.3791/62324

⸱

5 марта 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Pathology of Infectious Diseases, Department of Pathology, Medical School, University of São Paulo, 2Scientific Platform Pasteur USP, 3Department of Clinical and Toxicological Analyses, School of Pharmaceutical Sciences, University of São Paulo, 4Hospital Israelita Albert Einstein

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол, представленный здесь, описывает полный конвейер для анализа данных транскриптома РНК-секвенирования от необработанных считываний до функционального анализа, включая контроль качества и этапы предварительной обработки для передовых статистических аналитических подходов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Возбудители могут вызывать самые разнообразные инфекционные заболевания. Биологические процессы, индуцированные хозяином в ответ на инфекцию, определяют тяжесть заболевания. Для изучения таких процессов исследователи могут использовать высокопроизводительные методы секвенирования (RNA-seq), которые измеряют динамические изменения транскриптома хозяина на разных стадиях инфекции, клинических исходах или тяжести заболевания. Это исследование может привести к лучшему пониманию заболеваний, а также к выявлению потенциальных лекарственных мишеней и методов лечения. Протокол, представленный здесь, описывает полный конвейер для анализа данных секвенирования РНК от необработанных считываний до функционального анализа. Конвейер разделен на пять этапов: (1) контроль качества данных; (2) картирование и аннотация генов; (3) статистический анализ для выявления дифференциально экспрессированных генов и коэкспрессированных генов; 4) определение молекулярной степени возмущения образцов; и 5) функциональный анализ. Шаг 1 удаляет технические артефакты, которые могут повлиять на качество последующего анализа. На этапе 2 гены отображаются и аннотируются в соответствии со стандартными библиотечными протоколами. Статистический анализ на этапе 3 идентифицирует гены, которые дифференциально экспрессируются или совместно экспрессируются в инфицированных образцах, по сравнению с неинфицированными. Изменчивость образца и наличие потенциальных биологических выбросов проверяются с использованием подхода, основанного на молекулярной степени возмущения на этапе 4. Наконец, функциональный анализ на шаге 5 выявляет пути, связанные с фенотипом заболевания. Представленный конвейер направлен на поддержку исследователей посредством анализа данных RNA-seq из исследований взаимодействия хозяина с патогеном и проведение будущих экспериментов in vitro или in vivo , которые необходимы для понимания молекулярного механизма инфекций.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Арбовирусы, такие как лихорадка денге, желтая лихорадка, чикунгунья и зика, были широко связаны с несколькими эндемическими вспышками и стали одним из основных патогенов, ответственных за заражение людей в последние десятилетия1,2. Лица, инфицированные вирусом чикунгуньи (CHIKV), часто имеют лихорадку, головную боль, сыпь, полиартралгию и артрит3,4,5. Вирусы могут подрывать экспрессию генов клетки и влиять на различные сигнальные пути хозяина. Недавно в исследованиях транскриптома крови использовался RNA-seq для идент....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Образцы, используемые в этом протоколе, были одобрены комитетами по этике как из Департамента микробиологии Института биомедицинских наук Университета Сан-Паулу, так и из Федерального университета Сержипи (Протоколы: 54937216.5.0000.5467 и 54835916.2.0000.5546, соответственно).

1. Установка Docker на настольный компьютер

ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги по подготовке среды Docker различаются в зависимости от операционных систем (ОС). Поэтому пользователи Mac должны выполнять действия, перечисленные как 1.1, пользователи Linux должны следовать шагам, перечисленным как 1.2, а пользователи Windows должны следовать ша....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вычислительная среда для анализа транскриптома была создана и настроена на платформе Docker. Такой подход позволяет начинающим пользователям Linux использовать терминальные системы Linux без априорных управленческих знаний. Платформа Docker использует ресурсы ос хоста для создания контейнера сервиса, включающего инструменты конкретных пользователей (рисунок 1B). Был создан контейнер на базе дистрибутива ОС Linux Ubuntu 20.04 и полностью настроен для транскриптомного анализа, доступного ч.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Подготовка библиотек секвенирования является решающим шагом на пути к наилучшим ответам на биологические вопросы. Тип транскриптов, представляющих интерес для исследования, будет определять, какой тип библиотеки секвенирования будет выбран, и стимулировать биоинформационный анализ. Например, из секвенирования взаимодействия патогена и хозяина, в соответствии с типом секвенирования, можно идентифицировать последовательности из обоих или только из транскриптов хозяина.

Оборудование для секвениро.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HN финансируется FAPESP (номера грантов: #2017/50137-3, 2012/19278-6, 2018/14933-2, 2018/21934-5 и 2013/08216-2) и CNPq (313662/2017-7).

Мы особенно благодарны следующим грантам для стипендиатов: ANAG (FAPESP Process 2019/13880-5), VEM (FAPESP Process 2019/16418-0), IMSC (FAPESP Process 2020/05284-0), APV (FAPESP Process 2019/27146-1) и RLTO (CNPq Process 134204/2019-0).

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
CEMiToolComputational Systems Biology Laboratory1.12.2Открытие и анализ модулей коэкспрессии генов в полностью автоматическом режиме, предоставление удобного для пользователя HTML-отчета с высококачественными графиками.
EdgeRBioconductor (Разработчик: Yunshun Chen [yuchen at wehi.edu.au])3.30.3Дифференциальный анализ экспрессии профилей экспрессии РНК-секвенирования с биологической репликацией
EnhancedVolcanoBioconductor (Разработчик: Кевин Благ [kevin at clinicalbioinformatics.co.uk])1.6.0Готовые к публикации графики вулканов с улучшенной раскраской и маркировкой
FastQCBabraham Bioinformatics0.11.9Направлен на обеспечение простого способа выполнения некоторых проверок качества необработанных данных последовательностей, поступающих из высокопроизводительного секвенирования
FeatureCountsBioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research2.0.0Назначение картированных прочтений секвенирования заданным геномным признакам
MDPComputational Systems Biology Laboratory1.8.0Молекулярная степень возмущения Вычисляет баллы для образцов данных транскриптома на основе их возмущения от контрольной
RR Core Group4.0.3Язык программирования и свободная программная среда для статистических вычислений и графики
STARОтдел биоинформатики, Институт медицинских исследований Уолтера и Элизы Холл2.7.6aAligner специально разработан для решения многих проблем картирования данных РНК-секвенирования с использованием стратегии учета сплайсированных выравниваний
Bowtie2Университет Джонса Хопкинса2.4.2Сверхбыстрый и экономичный инструмент для выравнивания считываний секвенирования с длинными референсными последовательностями
TrimmomaticTHE USADEL LAB0.39Задачи обрезки последовательностей адаптера для парных и несимметричных данных Illumina
Получить DockerDocker20.10.2Создание биоинформатической среды, воспроизводимой и предсказуемой (https://docs.docker.com/get-docker/)
WSL2-KernelWindowsNAhttps://docs.microsoft.com/en-us/windows/wsl/wsl2-kernel
Получить Docker LinuxDockerNAhttps://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/
Docker Linux RepositoryDockerNAhttps://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/#install-using-the-repository
Веб-сайт MDPЛаборатория вычислительной системной биологииNAhttps://mdp.sysbio.tools
Веб-сайт EnrichrMaayanLabNAhttps://maayanlab.cloud/Enrichr/
webCEMiToolЛаборатория вычислительной системной биологииNAhttps://cemitool.sysbio.tools/
gProfilerБиоинформатика, алгоритмика и интеллектуальный анализ данных ГруппаNAhttps://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost
goseqBioconductor (Сопровождающий: Мэтью Янг [my4 at sanger.ac.uk])NAhttp://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/goseq.html
SRA NCBI исследованиеNCBINAhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA507472/
группы

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weaver, S. C., Charlier, C., Vasilakis, N., Lecuit, M. Zika, Chikungunya, and Other Emerging Vector-Borne Viral Diseases. Annual Review of Medicine. 69, 395-408 (2018).
  2. Burt, F. J., et al. Chikungunya virus: an update o....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Transcriptome AnalysisHost Pathogen InteractionsRNA SequencingDifferential Gene ExpressionCo Expression AnalysisQuality ControlFunctional EnrichmentMolecular PerturbationBlood TranscriptomeGene Annotation

Похожие статьи