Кратковременная индукция гипотермии у крыс с использованием моделей для исследований, изучающих клиническую значимость и механизмы

Summary

В данной статье описаны два метода индукции кратковременная гипотермия всего тела у крыс. Первый, быстрый индукционный метод, использует активное охлаждение с использованием вентиляторов и распыления этанола для быстрого снижения температуры. Второй способ – метод постепенного охлаждения. Это достигается с помощью комбинации изофлурановой анестезии и снижения температурных настроек на гомеотермическом тепловом мате. Это приводит к постепенному снижению температуры тела без использования каких-либо внешних охлаждающих устройств. 

Abstract

Терапевтическая гипотермия (TH) является мощной нейропротекторной стратегией, которая предоставила надежные доказательства нейропротекции в доклинических исследованиях неврологических расстройств. Несмотря на убедительные доклинические доказательства, TH не показал эффективности в клинических испытаниях большинства неврологических расстройств. Единственные успешные испытания, использующие терапевтическую гипотермию, были связаны с остановкой сердца у взрослых и гипоксическим ишемическим повреждением у новорожденных. Необходимы дальнейшие исследования параметров его использования и сравнение дизайна исследований между доклинических и клиническими исследованиями. В данной статье демонстрируются два метода индукции кратковременная гипотермия. Первый метод позволяет быстро индуцирования гипотермии у крыс с помощью этанолового спрея и вентиляторов. Этот метод работает путем охлаждения кожи, что реже используется в клинических испытаниях и может иметь различные физиологические эффекты. Охлаждение происходит гораздо быстрее с помощью этой техники, чем достижимо у пациентов-людей из-за различий в соотношении площади поверхности к объему. Наряду с этим представлен и второй метод, который позволяет обеспечить клинически достижимую скорость охлаждения при кратковременная гипотермия. Этот метод прост в реализации, воспроизводим и не требует активного охлаждения кожи.

Introduction

TH - это практика охлаждения температуры тела или мозга с целью сохранения жизнеспособности и функции органа/системы^1,2. Роль гипотермии в нейропротекции была исследована и показала преимущества в ряде доклинических моделей неврологических заболеваний, таких как инсульт^3,субарахноидальное кровоизлияние⁴и черепно-мозговая травма^5. С точки зрения клинического применения, TH показал эффективность у пациентов после остановки сердца и при гипоксически-ишемическом повреждении новорожденных^6.

Индукция TH достигается с использованием поверхностных или эндоваскулярных методов охлаждения. Большинство доклинических исследований гипотермии выполняют поверхностное охлаждение путем нанесения воды или этанола на шерсть животного или с использованием охлаждающего одеяла для достижения целевой температуры^1. У человека системное охлаждение поверхности достигается за счет использования пакетов со льдом и охлаждающих одеял^7,8. Более быстрое охлаждение было показано у пациентов, использующих эндоваскулярные методы, которые соединяют индукционную инфузию холодного физиологического раствора через внутривенный или внутриартериальный катетер с размещением эндоваскулярного охлаждающего устройства в пределах нижней полой вены^9,10. Например, умеренная целевая температура 33 °C может быть достигнута через 1,5 ч при эндоваскулярном охлаждении по сравнению с 3-4 ч при поверхностном охлаждении у пациентов^11. Эндоваскулярный подход также стал более популярным в последние годы, потому что, как сообщается, он уменьшает некоторые побочные эффекты, наблюдаемые при системном охлаждении поверхности, такие как^{дрожь 12,13.} Европейское многоцентровое рандомизированное клиническое исследование III фазы гипотермии при ишемическом инсульте (EUROHYP-1) использовало в основном поверхностное охлаждение^14. Результаты, недавно опубликованные в этом исследовании, показали, что дрожь была серьезным осложнением и, возможно, ограничивала способность достигать целевой температуры^10. Известно, что реакция на дрожь в основном обусловлена температурой кожи. Были предприняты некоторые усилия для разработки метода эндоваскулярного охлаждения грызунов^15,но высокоинвазивный характер метода по сравнению с тем, который используется у людей, рискует спутать любые результаты, полученные из этой модели.

Температура является ключевым модулятором биологических процессов в организме и жестко регулируется гомеостазом. Поэтому любые манипуляции с температурой тела могут иметь сопутствующие риски. Продолжительность охлаждения является фактором, который, возможно, ограничил успех клинических испытаний гипотермии. В этих испытаниях используется длительный метод охлаждения, при этом многие из них сохраняют гипотермию от 24-72 ч^11. Эта увеличенная продолжительность создает риск заражения во время протокола охлаждения. Пневмония является наиболее распространенным осложнением от переохлаждения, затрагивающим между 40-50% пациентов, которые проходят процедуру^13. Это контрастирует с тем, что обычно наблюдается в исследованиях гипотермии на животных, где используется кратковременная парадигма (1-6 ч)^3. Успех этих доклинических исследований на животных, вероятно, приведет к адаптации кратковременной гипотермии для использования в клинических испытаниях. В результате необходимо иметь на животных модель кратковременье гипотермии, которая напоминает скорость охлаждения будущих клинических испытаний. Дополнительные подробности, относящиеся к другим температурным параметрам и обоснованности кратковременным переохлаждениям, обсуждались в нескольких обзорных статьях^1,16,17,18.

Здесь демонстрируется постепенная модель охлаждения, которая более клинически достижима, чем современные экспериментальные модели гипотермии. Этот новый метод имеет гораздо более медленную скорость охлаждения и, следовательно, время до целевой температуры ближе к диапазону тех, которые наблюдаются в клинических испытаниях гипотермии^11. Он также избегает прямого охлаждения поверхности, которое имеет специфические физиологические эффекты, и, следовательно, может быть более сопоставимым с эндоваскулярным охлаждением, которое было наиболее часто используемым методом охлаждения в клинических испытаниях^9,12. Эта модель позволяет постепенно охлаждать животных в течение 2 ч с последующим коротким периодом поддержания при целевой температуре. Кроме того, также продемонстрирована быстрая охлаждение метода кратковременная гипотермия^19. Метод быстрого охлаждения позволяет быстро достичь целевой температуры после начала гипотермии. Хотя этот подход не так клинически актуален, как метод постепенного охлаждения, он полезен для исследований, направленных на изучение механизмов нейропротекции гипотермии, чтобы потенциально имитировать ее мощные нейропротекторные эффекты фармакологически. Этот метод также имеет потенциальное применение за пределами нейробиологии и может быть адаптирован к любому количеству доклинических исследований. Еще одним преимуществом обоих методов по сравнению с другими подходами является то, что они недороги и не требуют специального оборудования. Наконец, этот протокол также демонстрирует имплантацию регистраторов температурных данных, поскольку послеоперационное потепление и его мониторинг важны для предотвращения непреднамеренного послеоперационного переохлаждения, поскольку оно может спутать результаты исследования^20.

Protocol

Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с Австралийским кодексом практики по уходу за животными и их использованию в научных целях и были одобрены Комитетом по уходу за животными и этике Университета Ньюкасла (A-2013-343 и A-2020-003). В дополнение к методам индукции гипотермии, описанным ниже, следующие протоколы обычно выполняются в сочетании с гипотермией: канюляция бедренной кости для мониторинга артериального давления и частоты сердечных сокращений²¹и экспериментальный инсульт^22.

1. Имплантация регистратора данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Устройство регистратора данных, используемое в этом протоколе, не было способно обеспечить считывание температуры тела в режиме реального времени. Считывание возможно после того, как регистратор данных был удален из животного и подключен обратно к компьютеру. В результате датчик ректальной температуры используется для предоставления информации в режиме реального времени во время процесса охлаждения и повторного согрева. Кроме того, ректальный зонд также жизненно важен для этого метода, потому что хирургический тепловой мат, на который помещается животное во время процедуры, регулируется ректальной зондовой системой. Регистратор данных также служит ценной цели предоставления данных о температуре у свободно движущихся, бодрствующих крыс и важен для обеспечения поддержания нормальной температуры тела после повторного согрева. Поэтому оба устройства контроля температуры важны для этого протокола.

1. Обезболить 10-12-недельного самца перекровной крысы Wistar изофлураном (5% для индукции и 2-2,5% для поддержания) в смеси 50%_N2 и 50% O_2.
2. После индукции поместите крысу в положение лежа на хирургическом тепловом коврике.
3. Расположите крысу так, чтобы нос сидел в носовом конусе. Закрепите нос хирургической лентой, чтобы гарантировать, что газы не выходят.
4. Сбрить мех с нижней правой части живота и ввести в участок подкожно местный анестетик, бупивакаин 0,2 мл, 0,05%.
5. Нанесите антисептический раствор на свежевыбритую область.
6. Используя стерилизованные хирургические инструменты, сделайте продольный разрез 2 см вдоль правой области живота, проксимально к правому бедру. Сделайте разрез достаточно глубоким, чтобы обнажить пространство в вентральной складке бедра.
7. Используйте гемостаты и щипцы, чтобы создать «карман» под кожей, который достаточно велик, чтобы удерживать устройство.
8. Вставьте устройство регистратора данных для контроля температуры в карман и закройте мышцы и кожу с помощью 5-0 шелковых швов. Описанный здесь подкожный метод предпочтительнее внутриперитонеального метода, поскольку он менее инвазивный и позволяет лучше восстанавливаться после процедуры.
9. Убедитесь, что регистратор данных и ректальный зонд перекалиброваны для мониторинга температуры (см. Обсуждение).
10. Убедитесь, что регистратор данных не упирается в тепловой коврик животного после установки, так как это повлияет на показания температуры.

Рисунок 1:Имплантация устройства регистратора данных. (A) Панели слева направо показывают разрез примерно 2 см, сделанный на правой стороне нижней части живота крысы. (B) Регистратор данных мониторинга температуры был вставлен подкожно в карманный разрез. (C) Разрез был закрыт нейлоновыми швами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Индукция активной (быстрой) гипотермии для механистических исследований

1. Настроен на переохлаждения (см. рисунок 2). Поместите две стойки реторт с зажимами по обе стороны тела крысы.
2. Прикрепите вентилятор 60 мм 12 в/130 мА к каждой подставке для реторты, гарантируя, что вентиляторы направлены в нижнюю часть спины крысы. Расстояние между зажимом и крысой составляет примерно 20 см. Используемый вентилятор должен иметь скорость 4 000 об/мин.
3. Подготовьте тепловую лампу животного либо сбоку, либо на третьей подставке для реторт.
4. Начните гипотермию, отрегулировав тепловой коврик животного до желаемой целевой температуры. В этом примере 32,5 °C является целевой температурой (3,75 на блоке регулирования температуры).
5. Включите оба вентилятора и нанесите три-четыре спрея 70% этанола (стандартная пластиковая бутылка с распылителем) на нижнюю часть спины крысы. Взъерошивание шерсти животных при распылении для более быстрого охлаждения индукции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этанол используется в качестве предпочтительного раствора по сравнению с водой, поскольку он имеет более высокую скорость испарения и, следовательно, приводит к более быстрой индукции гипотермии.
6. Позаботьтесь о том, чтобы не переутомить мех, так как это может способствовать превышению целевой температуры.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вентиляторы ускорят испарение этанола и процесс охлаждения.
7. Допускать короткие интервалы между применением этанола, внимательно следя за ректальной температурой крысы.
8. Прекратите любое дальнейшее применение этанола, как только ректальная температура достигнет в пределах 1 °C от целевой температуры.
9. Выключите оба вентилятора, как только температура достигнет 0,5 °C от целевой температуры (в данном случае 33 °C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выключение вентиляторов до достижения целевой температуры помогает предотвратить переохлаждение крысы сверх требуемой температуры.
10. Дайте температуре упасть до 32.5 °C.
    1. Если переохлаждение действительно происходит, используйте тепловую лампу животного, чтобы слегка согреть животное обратно к цели. Помощь одного вентилятора может быть использована для предотвращения повторного перебора.
11. Как только целевая температура будет достигнута и стабилизируется, продолжайте следить за температурой. Температура обычно остается очень стабильной в течение оставшейся части периода переохлаждения без необходимости распыления, использования вентиляторов или использования тепловой лампы.
12. Чтобы согреть животное в конце гипотермии, отрегулируйте температуру теплового мата обратно до 37 ° C (6 на блоке контроля температуры, используемом в этом примере) и позвольте животному терморегулироваться в течение 30-минутного периода.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Температурные настройки на блоках контроля температуры могут варьироваться, и поэтому может потребоваться определение настроек для целевой гипотермии и нормотермии на отдельных устройствах.

3. Индукция клинически достижимой постепенной гипотермии без активного охлаждения кожи

1. Достижение гипотермии за счет снижения температуры ядра регулируется температурой гомеотермического теплового мата небольшими шагами до требуемой целевой температуры. В проиллюстрированом примере(рисунок 3B)использовался приращение 1 °C каждые 30 мин.
2. Охладите животное до целевой температуры в течение нужного периода (2 ч в описанном примере). После охлаждения выдерживая на целевом уровне нужный интервал. Как правило, никакого дальнейшего вмешательства не требуется, если они поддерживаются на гомеотермическом тепловом мате, установленном для желаемой целевой температуры.
3. При этом протоколе не требуется внешнее охлаждение, так как анестезия препятствует нормальному регулированию температуры тела.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Потребность в изофлуране снижается при переохлаждении. У большинства животных начальная концентрация изофлурана в 2% может быть снижена с шагом 0,1% каждые 20-30 мин до 1,5% для поддержания стабильной частоты дыхания (>50 вдохов/мин), частоты сердечных сокращений и артериального давления, а также сохранения подавления рефлекторных реакций.
4. Чтобы согреть животное после переохлаждения, отрегулируйте тепловой коврик, чтобы животное можно было согреть в течение нужного интервала. В примере повторное согревание с однократной регулировкой до 37 °C (6 на блоке контроля температуры FHC, используемом в примере) достигалось в течение 30-минутного периода.
   1. Для долгосрочных исследований, требующих восстановления животных, держите животных в клетке, которая помещается наполовину над тепловым ковриком, чтобы позволить животному терморегулироваться и избежать непреднамеренного послеоперационного переохлаждения.
   2. Ректальный парацетамол (250 мг/кг) можно вводить для восстановления и облегчения боли в течение дня. Инъекции подкожного физиологического раствора (2 х 1,5 мл) также могут быть даны для предотвращения обезвоживания от анестезии и хирургических процедур.

Results

Рисунок 3А представляет собой представление о том, как крыса Wistar реагирует на переохлаждения с использованием быстрого охлаждения. Индукция гипотермии достигается за счет использования вентиляторов и 70% этанолового спрея. Переохлаждения до мишени 32,5 °С достигается через 15 мин. Необходимо позаботиться о том, чтобы обеспечить деликатное взаимодействие между использованием вентиляторов / тепловой лампы и распыления этанола для поддержания целевой температуры. Как видно из рисунка 3А,наблюдается небольшое превышение температуры, которое может произойти, если охлаждение не прекращается примерно с 0,5 °C выше целевой температуры. Мишень поддерживается и стабилизируется на отметке 30 мин, а повторное согревание начинается через 1,5 ч.

На рисунке 3В показан постепенный протокол, в котором целевая температура до 33 °C достигается через 2 ч и поддерживается в течение 30 мин перед повторным согреванием через 2,5 ч. Здесь температура регулируется с шагом, что продлевает продолжительность, необходимую для достижения целевой температуры. Вертикальные пунктирные линии на обоих графиках представляют продолжительность охлаждения.

Рисунки 3A и 3B получены из устройства регистратора данных. В начале эксперимента регистратор данных запрограммирован на инициирование записи перед имплантацией. В конце эксперимента регистратор данных извлекается из животного и подключается к предоставленному температурному считывателю через USB-порт. Программное обеспечение (например, eTemperature) считывает и генерирует данные, которые затем могут быть экспортированы в программное обеспечение для работы с электронными таблицами.

Рисунок 2:Настройка протокола быстрого охлаждения. (A) Два вентилятора (черная стрелка) были расположены над нижней частью спины крысы. При начале переохлаждения оба вентилятора были включены, а на нижнюю часть спины был нанесен спрей этанола. Комбинация этанола и вентилятора облегчает и ускоряет переохлаждение для быстрого достижения целевой температуры. (B)Тепловая лампа (белая стрелка) использовалась для предотвращения переохлаждения. Как только целевая температура была достигнута, тепловая лампа использовалась, чтобы предотвратить падение температуры ядра крысы ниже. После того, как цель стабилизировалась, тепловая лампа и /или оставшийся вентилятор были выключены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3:Индукция гипотермии с использованием активного (А) и постепенного (В) методов. (А)Целевую температуру достигали через 15 мин с использованием активного процесса охлаждения и поддерживали в течение 60 мин в приведенном выше примере до того, как животное было согреть. (B) Целевая температура достигалась через 2 ч с использованием метода постепенного охлаждения и поддерживалась в течение 30 мин, прежде чем животное было вновь согрето. Затененные области на обоих графиках представляют временные точки, в которых поддерживалась целевая температура. Пунктирные перпендикулярные линии на обоих графиках относятся к общей продолжительности охлаждения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

Процедуры, описанные здесь, легко реализуются, неинвазивны и обеспечивают надежное и воспроизводимое снижение температуры тела до желаемой целевой температуры.

Существует несколько критических этапов в методе быстрого охлаждения, которые включают в себя следующее. Не перенасыщение этаноловым спреем – необходимо соблюдать осторожность, чтобы не замочить животное в этаноле, так как это помешает результатам. Следите за животным во время индукции гипотермии - необходимо тщательно следить за реакцией животных на быструю индукцию гипотермии. Тщательное наблюдение за ректальной температурой важно для обеспечения того, чтобы температура не опускалась ниже желаемой цели - если это произойдет, выключите вентиляторы и позвольте тепловой лампе осторожно согреть животное обратно к требуемой цели.

В обоих методах физиологический мониторинг важен для обеспечения соответствующей корректировки дозы анестетика. При длительном охлаждении неадекватная доза анестетика может продлить продолжительность охлаждения. В этом случае концентрация изофлурана может быть увеличена до тех пор, пока не будет достигнута адекватная скорость охлаждения. Другим важным шагом является перекрестная калибровка температурных устройств. При использовании теплового мата с регулируемым температурным зондом и регистратора данных в одном и том же эксперименте рекомендуется перекрестно калибровать регистратор данных с ректальным зондом in vivo, поскольку могут быть незначительные изменения в зарегистрированной температуре двух устройств.

Эти методы подходят для исследований, которые хотят изучить использование гипотермии в качестве потенциального лечения неврологических расстройств. Конкретная цель исследования должна диктовать, какой метод используется. Оба метода можно классифицировать как системное поверхностное охлаждение, однако второй метод не требует активного охлаждения. Модель постепенного охлаждения, описанная выше, имеет важные потенциальные применения для использования гипотермии в лечении ишемического инсульта. Длительная гипотермия и связанные с ней осложнения представляют собой проблему для пожилых пациентов с инсультом. Кроме того, дрожащая реакция затрудняет достижение целевой температуры у некоторых пациентов^10. В то время как противодрожащие лекарства могут помочь уменьшить реакцию на дрожь, кратковременное постепенное охлаждение может более эффективно облегчить проблему. Наличие более короткого периода охлаждения также, вероятно, снизит заболеваемость пневмонией, о которых часто сообщалось в испытаниях. Еще одним потенциальным преимуществом этого кратковременного метода является то, что скорость согревания может быть не такой важной по сравнению с длительным охлаждением. Очень ранние клинические исследования длительного охлаждения у пациентов с инсультом с большими инфарктами показали, что быстрое согревание приводило к значительному повышению внутричерепного давления (ВЧД), что ухудшало исход и часто приводило к летальному исходу. Это привело к разработке парадигм постепенного сопрея, что еще больше увеличило общую продолжительность охлаждения. Кратковременное охлаждение поддерживает целевую температуру только в течение короткого периода времени и может с меньшей вероятностью привести к отскоку ВЧД. Предыдущая работа, в которой изучалось лечение гипотермии для повышения ВЧД с использованием аналогичного протокола быстрого охлаждения и согревания, как и описанные здесь, не показала отскока повышения ВЧП после повторного сопрея^23,24.

Клинические испытания гипотермии для лечения ишемического инсульта не смогли перевести преимущества гипотермии, о которых сообщалось в экспериментальных исследованиях. Несоответствие скорости охлаждения и продолжительности между экспериментальными моделями и пациентами являются важными переменными, которые могут объяснить это несоответствие. Наличие экспериментальной модели гипотермии, которая лучше напоминает клиническую скорость охлаждения, позволит более обоснованно иследованно иследовать преимущества гипотермии в качестве меры лечения пациентов с инсультом.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Абсолютный этанол	ThermoFisher Scientific/ Ajax Finechem	AJA214-20LPL	разбавленный деионизированной водой с получением 70% этанола
Антисептический раствор (Хлоргексидин)	David Craig	A2957
Анестетик (Маркаин)	Аспен	PS13977
Бесщеточный двигатель вентилятора	Sirocco	YX2505	2 x 12 В/130 мА
Тепловая лампа	Рептилия Одна	грелка AC220	240 В 50/60 Гц
	FHC, Inc	40-90-2
Ректальный зонд	FHC, Inc	40-90-5D-02
Регулятор температуры	FHC, Inc	40-90-8D
Регистратор данных температуры	Maxim	DS1922L-F5