Методическая статья

Динамическая визуализация Т-клеток рецептора химерного антигена с помощью [18F]Тетрафтороборатно-позитронно-эмиссионной томографии/компьютерной томографии

DOI:

10.3791/62334

⸱

17 февраля 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1T Cell Engineering, Mayo Clinic, 2Division of Hematology, Mayo Clinic, 3Department of Radiology, Mayo Clinic, 4Regenerative Sciences PhD, Mayo Clinic, 5Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, 6Department of Immunology, Mayo Clinic

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает методологию неинвазивного отслеживания Т-клеток, генетически модифицированных для экспрессии рецепторов химерного антигена in vivo с помощью клинически доступной платформы.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Т-клетки, генетически модифицированные для экспрессии рецепторов химерного антигена (CAR), показали беспрецедентные результаты в ключевых клинических испытаниях для пациентов со злокачественными новообразованиями В-клеток или множественной миеломой (ММ). Однако многочисленные препятствия ограничивают эффективность и запрещают широкое использование терапии Т-клетками CAR из-за плохого трафика и инфильтрации в опухолевые участки, а также отсутствия персистенции in vivo. Кроме того, опасные для жизни токсичные вещества, такие как синдром высвобождения цитокинов или нейротоксичность, являются основными проблемами. Эффективная и чувствительная визуализация и отслеживание Т-клеток CAR позволяет оценить трафик, расширение и характеристику Т-клеток in vivo и позволяет разработать стратегии для преодоления текущих ограничений терапии Т-клетками CAR. В данной работе описывается методология включения симпортера йодида натрия (NIS) в Т-клетки CAR и визуализации Т-клеток CAR с использованием [18F]тетрафторборат-позитронно-эмиссионной томографии ([18F]TFB-PET) в доклинических моделях. Методы, описанные в этом протоколе, могут быть применены к другим конструкциям CAR и генам-мишеням в дополнение к тем, которые используются для этого исследования.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клеточная терапия химерным антигенным рецептором Т (CAR T) является быстро развивающимся и потенциально излечительным подходом при гематологических злокачественных новообразованиях1,2,3,4,5,6. Сообщалось о экстраординарных клинических исходах после CD19-направленной CAR T (CART19) или антигена созревания В-клеток (BCMA) CAR T-клеточной терапии2. Это привело к одобрению Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) клеток CART19 для агрессивной В-клеточной лимфомы (axicabtagene ciloleucel (Axi-Cel)4, тизагенлеклюцела (Tisa-Cel)3 и лизокабтагена маралеуцеля)7, острого лимфобластного лейкоза (Tisa-Cel)5,8, лимфомы мантийных клеток (brexucabtagene autoleuce)9 и фолликулярной лимфомы (Axi-Cel)10 . Совсем недавно FDA одобрило BCMA-направленную CAR T-клеточную терапию у пациентов с множественной миеломой (MM) (idecabtagene vicleucel)11. Кроме того, CAR T-клеточная терапия хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ) находится на поздней стадии клинической разработки и, как ожидается, получит одобрение FDA в течение следующих трех лет1.

Несмотря на беспрецедентные результаты ТЕРАПИИ Т-клетками CAR, ее широкое применение ограничено 1) недостаточным расширением Т-клеток CAR in vivo или плохой транспортировкой к опухолевым участкам, что приводит к снижению показателей длительного ответа12,13 и 2) развитием опасных для жизни нежелательных явлений, включая синдром высвобождения цитокинов (CRS)14,15 . Отличительные признаки CRS включают не только иммунную активацию, приводящую к повышенным уровням воспалительных цитокинов / хемокинов, но и массивную пролиферацию Т-клеток после инфузии Т-клеток CAR15,16. Таким образом, разработка валидированной стратегии клинического уровня для изображения Т-клеток CAR in vivo позволит 1) отслеживать Т-клетки CAR в режиме реального времени in vivo для мониторинга их перемещения в опухолевые участки и выявления потенциальных механизмов резистентности и 2) мониторинга расширения Т-клеток CAR и потенциального прогнозирования их токсичности, такой как развитие CRS.

Клиническими особенностями легкой СВК являются высокая температура, усталость, головная боль, сыпь, диарея, артралгия, миалгия и недомогание. При более тяжелой СВК у пациентов может развиться тахикардия/гипотония, капиллярная утечка, сердечная дисфункция, почечная/печеночная недостаточность и диссеминированная внутрисосудистая коагуляция17,18. В целом, было показано, что степень повышения цитокинов, включая интерферон-гамма, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, интерлейкин (IL)-10 и IL-6, коррелирует с тяжестью клинических симптомов17,19. Тем не менее, широкое применение мониторинга цитокинов сыворотки «в режиме реального времени» для прогнозирования CRS затруднено из-за высокой стоимости и ограниченной доступности. Чтобы использовать полезные характеристики ТЕРАПИИ Т-клетками CAR, неинвазивная визуализация приемных Т-клеток может быть потенциально использована для прогнозирования эффективности, токсичности и рецидива после инфузии Т-клеток CAR.

Несколько исследователей разработали стратегии использования радионуклидной визуализации с позитронно-эмиссионной томографией (ПЭТ) или однофотонной эмиссионной компьютерной томографией (ОФЭКТ), которая обеспечивает высокое разрешение и высокую чувствительность20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 для визуализация in vivo и мониторинг незаконного оборота Т-клеток CAR. Среди этих стратегий визуализации на основе радионуклидов был разработан симпортер йодида натрия (NIS) в качестве чувствительного метода к клеткам изображения и вирусам с использованием ПЭТ-сканирования31,32. Визуализация Т-клеток NIS+CAR с помощью [18F]TFB-PET является чувствительной, эффективной и удобной технологией для оценки и диагностики расширения, трафика и токсичности Т-клеток CAR30. Этот протокол описывает 1) разработку Т-клеток NIS+CAR посредством двойной трансдукции с высокой эффективностью и 2) методологию визуализации Т-клеток NIS+CAR с помощью [18F]TFB-ПЭТ-сканирования. Т-клетки BCMA-CAR для MM используются в качестве экспериментальной модели для описания NIS в качестве репортера для визуализации Т-клеток CAR. Однако эти методологии могут быть применены к любой другой терапии Т-клетками CAR.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол следует руководящим принципам Совета по институциональному обзору клиники Майо, Институционального комитета по биобезопасности и Комитета по институциональному уходу за животными и их использованию клиники Майо.

1. Производство Т-клеток NIS+ BCMA-CAR

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол соответствует руководящим принципам Совета по институциональному обзору клиники Майо (IRB 17-008762) и Институционального комитета по биобезопасности (IBC Bios00000006.04).

  1. Производство BCMA-CAR, NIS и люциферазно-зеленого флуоресцентного белка (GFP), кодирующих лентивирусы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конструкция BCMA-CAR второго поколения была синтезирована de novo (см. Таблицу материалов) и клонирована в лентивирусный вектор третьего поколения под контролем промотора фактора удлинения-1 альфа (EF-1α). Конструкция BCMA-CAR (C11D5.3-41BBz) включала костимуляцию 4-1BB и одноцепочечный переменный фрагмент (scFv), полученный из античеловеческого клона антитела BCMA C11D5.333,34. NIS находится под контролем промотора EF-1α и связывается с геном устойчивости к пуромицину через саморасщепляющиеся пептиды (P2A). Лентивирусный вектор, кодирующий люциферазу-GFP (см. Таблицу материалов), используется для трансдукции опухолевых клеток, которые затем экспрессируют GFP и люциферазу.
    1. Получают лентивирусные векторные плазмиды: pLV-EF1α-BCMA-CAR (15 мкг), pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro (15 мкг) и pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro (15 мкг).
      ПРИМЕЧАНИЕ: pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro и pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro содержат ген устойчивости к пуромицину. Таким образом, NIS- или люцифераза-GFP-трансдуцированные клетки могут быть выбраны с 1 мкг/мл или 2 мкг/мл пуромицина дигидрохлорида, как описано ранее14,35.
    2. Семена 20 × 106 из 293T клеток в колбе T175 и инкубируют в течение 24 ч при 37 °C с 5% CO2. Подтвердите, что клетки 293T равномерно распределены по колбе при 70-90% слиянии путем прямой визуализации под микроскопом.
    3. Подготовьте мастер-микс из 15 мкг вектора экспрессии (например, CAR, NIS или линейной ДНК люциферазы-GFP), 7 мкг вектора оболочки (VSV-G) и 18 мкг вектора упаковки (gag, pol, rev и tat). Разводят главную смесь ДНК в 4,5 мл трансфекционной среды, а затем добавляют 111 мкл предварительно комплексообразующего реагента (смесь А).
    4. Приготовьте новую пробирку и разбавьте 129 мкл липосомального трансфекционного реагента в 4,5 мл трансфекционной среды (смесь В).
    5. Соедините смеси А и В и проведите по тюбику, чтобы перемешать содержимое. Инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре (RT).
    6. После инкубации просто аспирируют клеточный супернатант без отрыва клеток и добавляют 16 мл питательной среды, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицин-глутамин. Затем добавьте смесь смесей А и В на ячейки 293T по каплям. Наконец, инкубируют трансфектированные клетки при 37 °C, 5% CO2 в течение 24 ч.
    7. В дни 1 и 2 после трансфекции соберите супернатант 293T, открутите при 900 × г в течение 10 мин и отфильтруйте через нейлоновый фильтр 0,45 мкм. Фильтрат концентрируют через 24 и 48 ч путем ультрацентрифугирования при 112 700 × г в течение 2 ч и замораживают при -80 °C.
  2. Ex-vivo Изоляция Т-клеток (рисунок 1)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните всю работу по посеву клеток в ламинарной проточной камере с использованием асептической техники и средств индивидуальной защиты. Мононуклеарные клетки периферической крови (ПБМК) собирают из здоровой донорской крови добровольцев, собранной во время афереза36. Скрининг патогенов был проведен на клетках человека, используемых в этом исследовании.
    1. Используйте стандартный метод градиента плотности для изоляции PBMC.
      1. Осторожно добавляют 15 мл среды градиента плотности (плотность 1,077 г/мл) (содержащей альфа-D-глюкопиранозид, гомополимер бета-D-фруктофуранозила и 3-(ацетиламино)-5-(ацетилметиламино)-2,4,6-триодбензойную кислоту мононатриевой соли) в трубку разделения градиента плотности 50 мл без образования пузырьков воздуха (см. Таблицу материалов).
      2. Чтобы избежать захвата клеток, разбавьте образец крови фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS, 0,2 г / л хлорида калия, 0,2 г / л моноосновного фосфата калия, 8 г / л хлорида натрия и 1,15 г / л двухосновного фосфата натрия), содержащим 2% FBS при объемном соотношении 1:1. Осторожно перенесите разбавленную кровь поверх среды градиента плотности, не нарушая границу раздела между ними. Открутите при 1 200 × г в течение 10 мин при RT.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для выделения 4-17 мл образца крови может быть использована разделительная трубка с градиентом плотности 50 мл. Разделительная трубка с градиентом плотности 50 мл (см. Таблицу материалов), используемая в этом протоколе, не требует «выключения тормоза» во время центрифугирования. Однако, когда используются стандартные трубки объемом 50 мл, тормоз должен быть выключен и требует 30-минутной центрифугирования.
      3. Переложите супернатант в новую коническую трубку объемом 50 мл, промыть PBS + 2% FBS путем заполнения до 50 мл, а затем открутить вниз при 300 × г в течение 8 мин при RT.
      4. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать гранулированные клетки в 50 мл PBS + 2% FBS. Подсчитайте количество ячеек, а затем открутите вниз при 300 × г в течение 8 мин при RT. Повторите предыдущий шаг в общей сложности 2 промывки.
    2. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать гранулированные клетки до концентрации 50 × 106 клеток/мл с PBS + 2% FBS.
    3. Выполните изоляцию Т-клеток от НБМК с помощью магнитного набора для отрицательного отбора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальный набор для отрицательного отбора включает магнитные шарики, прикрепленные к антителам против антигенов, экспрессируемых на клетках, отличных от Т-клеток. Широко используемый набор содержит антитела, конъюгированные с магнитными шариками против CD15, CD14, CD34, CD36, CD56, CD123, CD235a, CD19 и CD16 (см. Таблицу материалов).
      1. Перенесите НБМК в полистирольную трубку круглого дна объемом 14 мл. Затем поместите PBMCs и коктейль антител отрицательного отбора в полностью автоматизированный клеточный сепаратор и выполните изоляцию Т-клеток в соответствии с протоколом производителя.
  3. Стимуляция Т-клеток и расширение Т-клеток (Рисунок 1)
    1. Для культивирования изолированных Т-клеток готовят среду расширения Т-клеток (ТКМ), изготовленную из бессывороточной кроветвороточной клеточной среды, дополненной 10% сывороточного альбумина человека и 1% пенициллина-стрептомицина-глутамина14. После выделения Т-клеток подсчитайте клетки и культуру в концентрации 2 × 106 клеток/мл с помощью ТКМ.
    2. Промыть анти-CD3/ CD28 шарики три раза с TCM перед культивированием с Т-клетками.
      1. Смешайте флакон, содержащий бусины, закручивая. Затем пипетку необходимого объема бусин (3:1 бусины:ячейка) (например, при стимуляции 1,0 × 106 клеток Т-клеток, используют 3,0 × 106 бусин против CD3/CD28) в стерильную микроцентрифужную трубку (1,5 мл) и повторно суспендируют в 1 мл ТКМ.
    3. Поместите трубку микроцентрифуги с шариками на магнит на 1 мин и аспирируйте супернатант. Извлеките трубку из магнита и повторно суспендируйте вымытые шарики в 1 мл ТКМ. Повторите предыдущие два шага, чтобы выполнить в общей сложности 3 стирки.
    4. Повторно суспендировать шарики в 1 мл ТКМ и перенести их в Т-клетки. Затем разбавляют Т-клетки до конечной концентрации 1,0 × 106 клеток/мл с помощью ТКМ. Переложите Суспензию Т-клеток/шариков на обработанную культурой ткани 6-луночную пластину и поместите ее в инкубатор (37 °C, 5% CO2).
  4. Титрование лентивирусов (рисунок 2)
    1. Подготовьте Т-клетки для титрования. Убедитесь, что приблизительно 1,0 x 106 клеток доступны для титрования одного типа вируса.
    2. Стимулируют Т-клетки, как описано в разделе 1.3.2.
    3. Пластина 1,0 × 105 клеток стимулированных Т-клеток в 96-луночную пластину (титровую пластину) и инкубируют при 37 °C, 5% CO2 в течение 24 ч (рисунок 2A). Изолируют и стимулируют Т-клетки, как описано в разделе 1.2.
    4. Подготовьте разбавляющую пластину (96-луночную плиту) путем добавления 100 мкл ТКМ в скважины обозначенных колонн и непереведенных контрольных скважин (рисунок 2В).
    5. Разморозьте один флакон лентивирусных частиц на льду и аккуратно пипеткой вверх и вниз, чтобы хорошо перемешать. Перенос 50 мкл супернатанта вируса в скважины колонны 6 96-луночной плиты (разбавление 3) (рисунок 2В). Пипетка вверх и вниз, чтобы хорошо перемешать.
    6. Выполнение последовательных разбавлений (2-кратное последовательное разбавление): перенос 50 мкл из скважины А6 в скважину В6 и затем 50 мкл из скважины В6 в скважину С6; повторять до G6. Затем добавьте 50 мкл разбавленного вируса к пластине титра (рисунок 2B).
    7. Инкубируют титрную пластину при 37 °C, 5% CO2 в течение 48 ч и определяют процентное содержание CAR-, NIS- или GFP-положительных клеток методом проточной цитометрии (рисунок 2C).
      1. Промывайте лунки, откручивая пластину титра два раза при 650 × г при 4 °C в течение 3 мин.
      2. Окрашивают трансдуцированные Т-клетки, как описано на этапах 1.5.3-1.5.9.
      3. Определите титры на основе процентов CAR-, NIS- или GFP-положительных клеток с помощью формулы (1):
        Титры = Процентное содержание Т-клеток BCMA-CAR+ или NIS+ × количество Т-клеток при трансдукции × удельном разбавлении/объеме (1)
  5. Трансдукция лентивирусов и ННГ+Расширение Т-ячеек BCMA-CAR
    1. Через двадцать четыре-48 ч после стимуляции Т-клеток выполняют лентивирусную трансдукцию на стимулированных Т-клетках (Т-клетки должны образовывать кластеры).
      1. Разморозьте замороженные лентивирусы, кодирующие CAR или NIS при 4 °C.
      2. Хорошо перемешайте стимулированные Т-клетки, чтобы разбить кластеры, и просто добавьте свежеотмороженный вирус при множественности инфекции (MOI) 5,0 (при преобразовании 1,0 × 106 Т-клеток используйте 5,0 × 106 лентивиронов). Инкубируют трансдуцированные клетки при 37 °C, 5% CO2.
      3. В дни 3, 4 и 5 подсчитайте трансдуцированные Т-клетки с помощью гематоцитометра37 или полностью автоматизированного счетчика клеток38 и отрегулируйте концентрацию клеток до 1,0 × 106 клеток / мл, добавив свежий, предварительно нагретый ТКМ. Для NIS-трансдуцированных Т-клеток, несущих ген устойчивости к пуромицину, обработайте клетки 1 мкг/мл дигидрохлорида пуромицина на 3, 4 и 5 день.
    2. На 6-й день удалите шарики против CD3/CD28 из трансдуцированных Т-клеток (из шага 1.3.4), хорошо перемешав, чтобы разбить кластеры Т-клеток и поместить их в магнит на 1 мин. Затем просто поместите собранные трансдуцированные Т-клетки обратно в культуру в концентрации 1,0 × 106 клеток / мл. После удаления шариков из Т-клеток оцените экспрессию CAR и NIS с помощью проточной цитометрии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку одноцепочечный переменный фрагмент BCMA-CAR получен от мыши, он может быть окрашен козьим антимышевым IgG (H + L), сопряженным с Alexa Fluor 647. NIS может быть обнаружен с использованием античеловеческого ETNL [синтетический пептид, соответствующий aa625-643 (SWTPCVGHDGGRDQQETNL)]. Это антитело распознает цитозольный С-конец NIS. Поэтому Т-клетки должны быть проницаемы перед инкубацией античеловеческим антителом NIS.
    3. Выполните окрашивание поверхности BCMA-CAR с помощью козьего антимышечного IgG (H+L).
      1. Возьмите аликвоту культуры (например, 50 000 Т-клеток) и промыть буфером потока (PBS, 1% FBS и 1% азида натрия). Затем повторно суспендируют клетки с 50 мкл буфера потока и окрашивают клетки 1 мкл козьего антимышьего антитела для обнаружения экспрессии CAR и 0,3 мкл живой мертвой воды для исключения мертвых клеток.
      2. Инкубировать в течение 15 мин в темноте при RT, промыть клетки, добавив 150 мкл буфера потока, и центрифугировать клетки при 650 × г в течение 3 мин при 4 °C.
    4. После поверхностного окрашивания CAR зафиксируют и пронизывают клетки путем добавления 100 мкл фиксирующей среды (PBS с 4,21% формальдегида) и инкубируют в течение 20 мин при 4 °C. Промыть клетки дважды 100 мкл буфера, содержащего клеточно-проникающий агент, такой как сапонин (650 × г в течение 3 мин при 4 °C).
    5. Повторное суспендирование фиксированных/пермеабилизированных клеток в 50 мкл пермеабилизирующего буфера. Затем добавляют 0,3 нг античеловеческого антитела ETNL NIS в 50 мкл проточного буфера и инкубируют в течение 1 ч при 4 °C.
    6. Добавьте 150 мкл буфера потока и центрифугируйте ячейки при 650 × г в течение 3 мин при 4 °C. Инкубируют клетки с 2,5 мкл вторичного антитела против кроликов в 50 мкл буфера потока в течение 30 мин при 4 °C, промывают клетки, добавляя 150 мкл буфера потока, и центрифугу при 650 × г в течение 3 мин при 4 °C.
    7. Наконец, повторно суспендировать в 200 мкл буфера потока и выполнить проточную цитометрию для определения эффективности трансдукции (рисунок 3A,B).
    8. На 8-й день подсчитайте и раскрутите Т-клетки при 300 × г в течение 8 мин при 4 °C. Повторно суспендируют Т-клетки с морозильной средой (90% FBS + 10% диметилсульфоксида [DMSO]) в концентрации 10 × 106/мл, затем переносят по 1 мл на меченые криовиалы.
    9. Поместите флаконы в морозильную камеру при температуре -80 °C на 48 ч. Через 48 ч (и к 10 дню) переведите Т-клетки в жидкий азот.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор производства Т-клеток NIS+ CAR см. на рисунке 1. На рисунке 3D представлены примеры расширения Т-клеток ex vivo от трех разных доноров.

2. Визуализация Т-клеток NIS+ BCMA-CAR с [ 18F] TFB-ПЭТ сканированием

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол соответствует руководящим принципам Институционального комитета по уходу и использованию животных клиники Майо (IACUC A00001767-16), IRB и IBC (Bios00000006.04). OPM-2 представляет собой клеточную линию BCMA+ MM, которая часто используется в качестве линии клеток-мишеней для Т-клеток BCMA-CAR39,40.

  1. Устанавливают люциферазу+ BCMA+ OPM-2 клетки.
    1. Посейте 500 000 клеток OPM-2 в обработанную культурой ткани 24-луночную пластину. Оттаивание лентивируса, кодирующего люциферазу-GFP при 4 °C.
    2. Добавьте свежеотмороженный вирус при MOI 3,0 к клеткам OPM-2 и хорошо перемешайте путем пипетирования. Поместите пластину в инкубатор (37 °C, 5% CO2).
    3. Через сорок восемь часов после трансдукции добавьте 2 мкг/мл пуромицина для отбора трансдуцированных клеток. Через четыре дня после трансдукции оценивают GFP-положительные клетки (люциферазно-положительные) с помощью проточной цитометрии (рисунок 3E).
  2. Установите модели мыши с ксенотрансплантатом BCMA+ OPM-2 (рисунок 4).
    1. Подсчитайте клетки люциферазы + OPM-2 и дважды раскрутите их вниз, чтобы удалить всю клеточную культуральную среду. Повторное суспендирование клеток OPM-2 в концентрации 10 × 106 клеток/мл с PBS.
    2. На -21 день вводят 100 мкл (1,0 × 106 клеток) люциферазы + OPM-2 клеток в хвосты мышей с ослабленным иммунитетом NOD-scid IL2rγnull (NSG) в возрасте от 8 до 12 недель (рисунок 4).
    3. На 20-й день после инъекции клеток OPM-2 (день -1 инъекции Т-клеток CAR) проверьте опухолевую нагрузку с помощью биолюминесцентной визуализации (BLI) (рисунок 4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки OPM-2 образуют медленно растущую опухоль, для приживления которой обычно требуется 2-3 недели.
    4. Вводят 10 мкл/г D-люциферина мышам с ксенотрансплантатом OPM-2 с помощью внутрибрюшинной (IP) инъекции. Через 10 мин выполняют BLI на мышах под 2% газообразным изофлураном (рисунок 5А). После подтверждения приживления опухоли рандомизируйте мышей в соответствии с опухолевой нагрузкой.
    5. На -1 день инъекции Т-клеток CAR разморозьте Т-клетки NIS+BCMA-CAR и удалите замерзающую среду центрифугированием (300 × г, 8 мин, 4 °C). Затем повторно суспендированные клетки с ТКМ при 2,0 × 106 клеток/мл и инкубируются в течение ночи (37 °C, 5% CO2).
    6. На 0 день подсчитайте и центрифугируйте Т-клетки NIS+BCMA-CAR (300 × г, 8 мин, 4 °C). Повторное суспендирование Т-клеток NIS+BCMA-CAR при 50 × 106 клеток/мл с PBS.
    7. Вводят 100 мкл (5,0 × 106 клеток) Т-клеток NIS+BCMA-CAR посредством инъекции в хвостовую вену мышам с ксенотрансплантатом OPM-2. На 7 и 15 днях визуализируйте мышей с помощью ПЭТ-сканирования.
  3. NiS+BCMA-CAR визуализация Т-клеток in vivo с использованием модели мыши BCMA+OPM-2 с использованием ксенотрансплантата.
    1. Взвесьте мышей перед визуализацией и удалите все металлические ушные бирки, чтобы устранить артефакты, связанные с металлом.
    2. Подготовьте [18F]TFB, как описано выше41.
      ПРИМЕЧАНИЕ: [18F]TFB должен быть изготовлен в день его использования. Радиохимическая чистота должна составлять >99%, а молярная активность >5 ГБк/ммоль.
    3. Введите 9,25 МБк [18F]TFB внутривенно через инъекцию в хвостовую вену. Дайте период поглощения ~ 40 мин для радиоиндикатора, чтобы распределиться в организме и очистить кровь.
    4. Обезболить мышь с помощью ингаляции изофлурана (2%).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изофлуран является предпочтительным ингаляционным анестетиком, поскольку он имеет быстрое и надежное начало и восстановление.
    5. Перед обезболиванием мыши очистите все поверхности анестезиологического аппарата дезинфицирующими чистящими средствами.
    6. Поместите мышь внутрь индукционной камеры. Поверните циферблат испарителя на 2% и подождите, пока мышь станет лежачей и неотвечающей в течение 1-2 минут.
    7. Контролируйте мышь, чтобы избежать недостаточной анестезии или чрезмерного угнетения дыхательных функций. Короче говоря, ущипните палец, чтобы подтвердить недостаточную анестезию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нормальная частота дыхания составляет до 180 / мин, а допустимая скорость падения составляет 50%.
    8. Применяют офтальмологическую мазь, чтобы избежать высыхания и травмирования роговицы.
    9. Получение изображений ПЭТ/КТ через 45 минут после инъекции с помощью анестезированной мыши на рабочей станции микро-ПЭТ/КТ (см. Таблицу материалов). Затем получайте статические ПЭТ-изображения в течение 15 минут с последующим получением изображения КТ в течение 5 минут с поворотом на 360 ° и 180 проекциями при экспозиции 500 мкА, 80 кэВ и 200 мс.
  4. Анализ полученных данных изображений
    1. Анализируйте изображения с помощью программного обеспечения для обработки изображений ПЭТ (рисунок 5B и Дополнительное видео S1).
    2. Определите интересующий объем (VOI).
    3. Рассчитайте стандартизированное значение поглощения (SUV), используя формулу (2).
      SUV in VOI = Концентрация активности в VOI (MBq/mL) × массе тела (г) / введенной дозе (MBq) (2)
  5. Подтверждение переноса Т-клеток NIS+BCMA-CAR в опухолевые участки с помощью проточной цитометрии
    1. После [18F]TFB-PET визуализации поместите мышь обратно в клетку. После прекращения анестезии следите за животными до тех пор, пока они не станут способными к целенаправленному движению и убедитесь, что у них есть доступ к пище и воде.
    2. Следите за мышами до распада введенного [18F]TFB. Как только радиоизотоп не будет обнаружен, усыпьте мышей CO2.
    3. Для эвтаназии поместите мышей в клетку (не более 5 мышей на клетку).
    4. Подвергайте мышей воздействию CO2 до полного прекращения дыхания примерно через 5-10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод эвтаназии должен соответствовать Руководству AVMA по эвтаназии животных (издание 2020 года).
    5. Чтобы обеспечить гибель мышей, выполняют вывих шейки матки, захватив затылок и основание хвоста животного, затем раздвинув руки друг от друга.
    6. Соберите костный мозг, чтобы подтвердить, что Т-клетки NIS+ BCMA-CAR эффективно перемещаются к месту опухоли.
    7. Переложите собранные бедренные и большеберцовые кости на 6-луночную пластину, содержащую 5 мл клеточной питательной среды. Удалите мышцы и сухожилия из бедренной и большеберцовой костей и просто обрежьте оба конца (над суставами) бедренной и большеберцовой костей.
    8. Заполните инсулиновый шприц клеточной культуральной средой и смойте костный мозг на 6-луночную пластину. Для бедренных костей используйте иглы 22 г и шприцы 5 мл, потому что диаметр бедренной кости больше, чем у большеберцовой кости.
    9. Используйте плоский конец поршня для измельчения костного мозга. Поместите клеточный ситечко 70 мкм на стерильную коническую трубку объемом 50 мл и отфильтруйте измельченный костный мозг. Затем заполните трубку буфером потока и центрифугируйте трубку при 300 × г в течение 8 мин при 4 °C.
    10. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать костный мозг с 5 мл буфера потока. Переложите 200 мкл костного мозга на 96-луночную пластину. Центрифугировать пластину при 300 × г в течение 3 мин при 4 °C. Декантируйте супернатант и повторно суспендируйте ячейки с 50 мкл буфера потока.
    11. Окрашивают костный мозг проточными антителами против 0,25 мкг мышиного CD45, 0,03 мкг человеческого CD45, 0,06 мкг человеческого CD3, 0,24 мкг человеческого BCMA и 0,3 мкл живой/мертвой воды. Инкубировать пластину в течение 15 мин при RT в темноте.
    12. Центрифугировать пластину при 300 × г в течение 3 мин при 4 °C. Затем добавьте 200 мкл буфера потока и запустите на проточном цитометре (рисунок 5C).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунке 1 показаны этапы генерации Т-клеток NIS+BCMA-CAR. На 0-й день изолируйте НБМК, а затем изолируйте Т-клетки путем отрицательного отбора. Затем стимулируют Т-клетки шариками против CD3/CD28. На 1-й день трансдукция Т-клеток с помощью лентивирусов NIS и BCMA-CAR. В дни 3, 4 и 5 подсчитывайте Т-клетки и кормите средой, чтобы скорректировать концентрацию до 1,0 × 106 / мл. Для NIS-трансдуцированных Т-клеток добавьте 1 мкг/мл пуромицина для выбора клеток NIS+<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной работе описывается методология включения NIS в Т-клетки CAR и визуализации инфузионных CAR T-клеток in vivo через [18F]TFB-PET. В качестве доказательства концепции, Т-клетки NIS + BCMA-CAR были сгенерированы с помощью двойной трансдукции. Недавно мы сообщили, что включение NIS в CAR T-клетки не ухудшает функции и эффективность CAR T-клеток in vivo и позволяет трафик и расширение CAR T-клеток30. Поскольку терапия Т-клетками CAR продолжает расширяться...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SSK является изобретателем патентов в области иммунотерапии CAR, лицензированных Novartis (через соглашение между клиникой Mayo, Университетом Пенсильвании и Novartis) и Mettaforge (через клинику Mayo). RS, MJC и SSK являются изобретателями патентов в области иммунотерапии CAR, которые лицензированы Humanigen. SSK получает финансирование исследований от Kite, Gilead, Juno, Celgene, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis, Leahlabs и Lentigen. Рисунки создавались с помощью BioRender.com.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была частично поддержана через трубопровод Mayo Clinic K2R (SSK), Центр индивидуализированной медицины клиники Майо (SSK) и Фонд Предолина (RS). Рисунки 1, 2 и 4 были созданы с BioRender.com.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Игла 22 калибраCovidien8881250206
инсулиновый шприц 28 калибраBD329461
96 луночный планшетCorning3595
Anti-human (ETNL) NISImanisREA009ETNL антитело связывается с цитозольным С-концом NIS
Anti-human BCMA, клон 19F2, PE-Cy7BioLegend357507антитело Flow
Античеловеческий CD45, клон HI30, BV421BioLegend304032Flow антитело
Anti-mouse CD45, клон 30-F11, APC-Cy7BioLegend103116Flow антитело
Anti-rabbit IgGR& DF0110Вторичное антитело для окрашивания NIS
BCMA-CAR construct, IDT второго поколения, Coralville, IA
BD  Набор растворов для фиксации/пермеабилизации CytopermBD554714
CD3 Моноклональное антитело (OKT3), ПЭ, eBioscienceInvitrogen12-0037-42
CTS (системы клеточной терапии) Dynabeads CD3/CD28Gibco40203D
CytoFLEX System  B5-R3-V5Beckman CoulterC04652проточный цитометр
ДиметилсульфоксидМиллипор SigmaD2650-100ML
Одноразовые шприцы с наконечниками Luer-LokBD309646
D-люциферин, соль калия ЗолотоБиотехнологияLUCK-1G
D-PBS (Буферизованный фосфатом Дульбекко)Gibco14190-144
Буферизованный фосфатом физиологический растворDulbecco Gibco14190-144
Dynabeads MPC-S (концентратор магнитных частиц)Applied BiosystemsA13346
Easy 50 EasySep MagnetSTEMCELL Technologies18002
EasySep Набор для изоляции Т-клеток человекаSTEMCELL Technologies17951магнитные шарики отрицательного отбора; 17951RF включает наконечники и
буфер Фетальная бычья сывороткаMillipore SigmaF8067
Козий антимышиный IgG (H+L) Перекрестно адсорбированное вторичное антитело, Alexa Fluor 647InvitrogenA-21235
Inveon Multiple Modality ПЭТ/КТ сканерSiemens Medical Solutions США, Inc.10506989 VFT 000 03
Изофлуран жидкийPiramal Critical Care66794-017-10
IVIS Lumina S5 Imaging SystemPerkinElmerCLS148588
IVIS® Система визуализации спектра in vivoPerkinElmer 
Lipofectamine 3000 Реагент для трансфекцииInvitrogenL3000075
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Stain Kit, для возбуждения 405 нмInvitrogenL34966
LymphoprepSTEMCELL Technologies07851
Nalgene Rapid-Flow 500 мл Вакуумный фильтр, 0,22 мкм, стерильныйThermo Scientific450-0020
Nalgene Rapid-Flow 500 мл вакуумный фильтр, 0,45 мкМ, стерильныйThermo Scientific450-0045
NOD. Cg-Prkdcscid  Il2rgtm1Wjl/SzJJackson laboratory05557
OPM-2DSMZCRL-3273клеточная линия множественной миеломы
pBMN (CMV-copGFP-Luc2-Puro)Addgene80389лентивирусный вектор, кодирующий люциферазу-GFP
пенициллин-стрептомицин-глутамин (100x), жидкийGibco10378-016
PMOD программное обеспечениеPMOD PBASи P3D
Объединенная сыворотка крови человека AB ИнновационныеисследованияIPLA-SERAB-H-100ML
пуромицина дигидрохлоридаMP Biomedicals, Inc.
RoboSep-SSTEMCELL Technologies21000Полностью автоматизированный сепаратор клеток
RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium)Gibco21870-076
SepMate-50 (IVD)STEMCELL Technologies85450градиент плотности разделительные трубки
Азид натрия, 5% (w/v)Ricca Chemical7144.8-16
T175 колбаCorning353112
Terrell (изофлуран, USP)Piramal Critical Care Inc66794-019-10
Webcol Alcohol PrepCovidien6818
X-VIVO 15 Сыворотка Гемопоэтические клетки MediumLonza04-418Q
1242620210055210

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), (2015).
  2. Raje, N., et al. Anti-BCMA CAR T-cell therapy bb2121 in relapsed or refractory multiple myeloma. New England Journal of Medicine. 380 (18), 1726-1737 (2019).
  3. Schuster, S. J., et al. Tisagenlecleucel in adult relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 380 (1), 45-56 (2019).
  4. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  5. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
  6. Anagnostou, T., Riaz, I. B., Hashmi, S. K., Murad, M. H., Kenderian, S. S. Anti-CD19 chimeric antigen receptor T-cell therapy in acute lymphocytic leukaemia: a systematic review and meta-analysis. Lancet Haematology. 7 (11), 816-826 (2020).
  7. Abramson, J. S., et al. Lisocabtagene maraleucel for patients with relapsed or refractory large B-cell lymphomas (TRANSCEND NHL 001): a multicentre seamless design study. Lancet. 396 (10254), 839-852 (2020).
  8. Shah, B. D., et al. KTE-X19 for relapsed or refractory adult B-cell acute lymphoblastic leukaemia: phase 2 results of the single-arm, open-label, multicentre ZUMA-3 study. Lancet. 398 (10299), 491-502 (2021).
  9. Wang, M., et al. KTE-X19 CAR T-cell therapy in relapsed or refractory mantle-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 382 (14), 1331-1342 (2020).
  10. Jacobson, C. A., et al. Axicabtagene ciloleucel in relapsed or refractory indolent non-Hodgkin lymphoma (ZUMA-5): a single-arm, multicentre, phase 2 trial. Lancet Oncology. 23 (1), 91-103 (2022).
  11. Munshi, N. C., et al. Idecabtagene Vicleucel in Relapsed and Refractory Multiple Myeloma. New England Journal of Medicine. 384 (8), 705-716 (2021).
  12. Sakemura, R., Cox, M. J., Hefazi, M., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Resistance to CART cell therapy: lessons learned from the treatment of hematological malignancies. Leukemia & Lymphoma. , 1-18 (2021).
  13. Cox, M. J., et al. Leukemic extracellular vesicles induce chimeric antigen receptor T cell dysfunction in chronic lymphocytic leukemia. Molecular Therapy. 29 (4), 1529-1540 (2021).
  14. Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. 133 (7), 697-709 (2019).
  15. Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Neurotoxicity and Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy: Insights Into Mechanisms and Novel Therapies. Frontiers in Immunology. 11, 1973(2020).
  16. Khadka, R. H., Sakemura, R., Kenderian, S. S., Johnson, A. J. Management of cytokine release syndrome: an update on emerging antigen-specific T cell engaging immunotherapies. Immunotherapy. 11 (10), 851-857 (2019).
  17. Hay, K. A., et al. Kinetics and biomarkers of severe cytokine release syndrome after CD19 chimeric antigen receptor-modified T-cell therapy. Blood. 130 (21), 2295-2306 (2017).
  18. Lee, D. W., et al. ASTCT consensus grading for cytokine release syndrome and neurologic toxicity associated with immune effector cells. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 25 (4), 625-638 (2019).
  19. Sterner, R. M., Kenderian, S. S. Myeloid cell and cytokine interactions with chimeric antigen receptor-T-cell therapy: implication for future therapies. Current Opinion in Hematology. 27 (1), 41-48 (2020).
  20. Krekorian, M., et al. Imaging of T-cells and their responses during anti-cancer immunotherapy. Theranostics. 9 (25), 7924-7947 (2019).
  21. Wei, W., Jiang, D., Ehlerding, E. B., Luo, Q., Cai, W. Noninvasive PET imaging of T cells. Trends in Cancer. 4 (5), 359-373 (2018).
  22. Volpe, A., et al. Spatiotemporal PET imaging reveals differences in CAR-T tumor retention in triple-negative breast cancer models. Molecular Therapy. 28 (10), 2271-2285 (2020).
  23. Minn, I., et al. Imaging CAR T cell therapy with PSMA-targeted positron emission tomography. Science Advances. 5 (7), (2019).
  24. Keu, K. V., et al. Reporter gene imaging of targeted T cell immunotherapy in recurrent glioma. Science Translational Medicine. 9 (373), (2017).
  25. Moroz, M. A., et al. Comparative analysis of T cell imaging with human nuclear reporter genes. Journal of Nuclear Medicine. 56 (7), 1055-1060 (2015).
  26. Sellmyer, M. A., et al. Imaging CAR T cell trafficking with eDHFR as a PET reporter gene. Molecular Therapy. 28 (1), 42-51 (2019).
  27. Weist, M. R., et al. PET of adoptively transferred chimeric antigen receptor T cells with (89)Zr-oxine. Journal of Nuclear Medicine. 59 (89), 1531-1537 (2018).
  28. Vedvyas, Y., et al. Longitudinal PET imaging demonstrates biphasic CAR T cell responses in survivors. JCI Insight. 1 (19), 90064(2016).
  29. Sakemura, R., Can, I., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. In vivo CART cell imaging: Paving the way for success in CART cell therapy. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 625-633 (2021).
  30. Sakemura, R., et al. Development of a Clinically Relevant Reporter for Chimeric Antigen Receptor T-cell Expansion, Trafficking, and Toxicity. Cancer Immunology Research. 9 (9), 1035-1046 (2021).
  31. Penheiter, A. R., Russell, S. J., Carlson, S. K. The sodium iodide symporter (NIS) as an imaging reporter for gene, viral, and cell-based therapies. Current Gene Therapy. 12 (1), 33-47 (2012).
  32. Msaouel, P., et al. Clinical trials with oncolytic measles virus: current status and future prospects. Current Cancer Drug Targets. 18 (2), 177-187 (2018).
  33. Kalled, S. L., Hsu, Y. -M. Anti-BCMA antibodies. , WO/2010/10949 (2010).
  34. Carpenter, R. O., et al. B-cell maturation antigen is a promising target for adoptive T-cell therapy of multiple myeloma. Clinical Cancer Research. 19 (8), 2048-2060 (2013).
  35. Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. Using CRISPR/Cas9 to knock out GM-CSF in CAR-T cells. Journal of Visualized Experiments. (149), e59629(2019).
  36. Dietz, A. B., et al. A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers. Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).
  37. Absher, M. Tissue Culture: Methods and Applications. Kruse, P. F., Patterson, M. K. , Academic Press Inc. 395-397 (1973).
  38. Janakiraman, V., Forrest, W. F., Chow, B., Seshagiri, S. A rapid method for estimation of baculovirus titer based on viable cell size. Journal of Virological Methods. 132 (1-2), (2006).
  39. Smith, E. L., et al. GPRC5D is a target for the immunotherapy of multiple myeloma with rationally designed CAR T cells. Science Translational Medicine. 11 (485), (2019).
  40. Sakemura, R., et al. Targeting Cancer-Associated Fibroblasts in the Bone Marrow Prevents Resistance to CART-Cell Therapy in Multiple Myeloma. Blood. , (2022).
  41. Jiang, H., et al. Synthesis of 18F-tetrafluoroborate via radiofluorination of boron trifluoride and evaluation in a murine C6-glioma tumor model. Journal of Nuclear Medicine. 57 (9), 1454-1459 (2016).
  42. Dispenzieri, A., et al. Phase I trial of systemic administration of Edmonston strain of measles virus genetically engineered to express the sodium iodide symporter in patients with recurrent or refractory multiple myeloma. Leukemia. 31 (12), 2791-2798 (2017).
  43. Ravera, S., Reyna-Neyra, A., Ferrandino, G., Amzel, L. M., Carrasco, N. The sodium/iodide symporter (NIS): molecular physiology and preclinical and clinical applications. Annual Review of Physiology. 79, 261-289 (2017).
  44. Varettoni, M., et al. Incidence, presenting features and outcome of extramedullary disease in multiple myeloma: a longitudinal study on 1003 consecutive patients. Annals of Oncology. 21 (2), 325-330 (2010).
  45. Bladé, J., et al. Soft-tissue plasmacytomas in multiple myeloma: incidence, mechanisms of extramedullary spread, and treatment approach. Journal of Clinical Oncology. 29 (28), 3805-3812 (2011).
  46. Brunton, B., et al. New transgenic NIS reporter rats for longitudinal tracking of fibrogenesis by high-resolution imaging. Scientific Reports. 8 (1), 14209(2018).
  47. Dohán, O., et al. The sodium/iodide symporter (NIS): characterization, regulation, and medical significance. Endocrine Reviews. 24 (1), 48-77 (2003).
  48. Jiang, H., DeGrado, T. R. 18F]Tetrafluoroborate ([18F]TFB) and its analogs for PET imaging of the sodium/iodide symporter. Theranostics. 8 (14), 3918-3931 (2018).
  49. Ahn, B. -C. Sodium iodide symporter for nuclear molecular imaging and gene therapy: from bedside to bench and back. Theranostics. 2 (4), 392-402 (2012).
  50. Gust, J., et al. Endothelial activation and blood-brain barrier disruption in neurotoxicity after adoptive immunotherapy with CD19 CAR-T cells. Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).
  51. Gofshteyn, J. S., et al. Neurotoxicity after CTL019 in a pediatric and young adult cohort. Annals of Neurology. 84 (4), 537-546 (2018).
  52. Shalabi, H., et al. Systematic evaluation of neurotoxicity in children and young adults undergoing CD22 chimeric antigen receptor T-cell therapy. Journal of Immunotherapy. 41 (7), 350-358 (2018).
  53. Ruff, M. W., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. A Concise Review of Neurologic Complications Associated with Chimeric Antigen Receptor T-cell Immunotherapy. Neurologic Clinics. 38 (4), 953-963 (2020).
  54. Santomasso, B. D., et al. Clinical and biological correlates of neurotoxicity associated with CAR T-cell therapy in patients with B-cell acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discovery. 8 (8), 958-971 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CAR T

Похожие статьи