Естественный киллер (NK) и метод расширения клеток CAR-NK с использованием мембранно-связанной IL-21-модифицированной В-клеточной линии

Естественные клетки-киллеры (NK) являются важным подмножеством лимфоцитов, которые экспрессируют CD56 и не экспрессируют маркер Т-клеток, CD3 ^1,2. Обычные NK-клетки классифицируются как врожденные иммунные клетки, ответственные за иммунонадзор вирусно инфицированных клеток и раковых клеток. В отличие от Т-клеток, NK-клетки распознают инфицированные или злокачественные клетки с помощью CD16 или других активирующих рецепторов и не требуют образования комплекса между антигенными пептидами и основным комплексом гистосовместимости (MHC) класса I молекул ^3,4. Недавние клинические исследования с использованием рецепторов химерного антигена (CAR)-NK-клеток для лечения рецидивирующих или рефрактерных CD19-положительных раковых заболеваний (неходжкинская лимфома или хронический лимфоцитарный лейкоз [CLL]) показали выдающиеся преимущества безопасности CAR-NK-клеток⁵. Например, инфузия клеток CAR-NK связана с минимальным или незначительным трансплантатом по сравнению с болезнью хозяина (GVHD), нейротоксичностью, кардиотоксичностью и синдромом высвобождения цитокинов (CRS)6,7,8,9,10. Однако традиционные методы расширения NK-клеток человека показали исчерпывающие фенотипы с сильным братоубийственным уничтожением и нехваткой теломер, что представляет собой серьезную проблему в получении достаточного количества функциональных NK-клеток для приемной иммунотерапии¹¹.

Для преодоления этих проблем был разработан метод расширения первичных NK-клеток непосредственно из нефракционированных мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs) или пуповинной крови (CB) с использованием облученной и генетически модифицированной клеточной линии 721.221 (далее 221), линии В-лимфобластоидных клеток человека с низкой экспрессией молекул MHC класса I³. Предыдущие исследования показали важность IL-21 в расширении NK-клеток; поэтому генетически модифицированный мембранно-связанный IL-21, экспрессирующий версию клеточной линии 721.221 (начиная с настоящего времени, 221-mIL-21), был разработан ^{11,12,13,14,15}. Результаты показали, что 221-mIL-21 питательно-клеточные расширенные первичные NK-клетки были расширены в среднем до >40 000 раз с персистирующей высокой чистотой NK-клеток в течение примерно 2-3 недель. Дополнительную информацию о применении этого протокола можно найти в Yang et ^al.16.

Этот протокол направлен на демонстрацию пошаговой процедуры нового расширения PBNK, CBNK, тканевых NK и CAR-NK клеток ex vivo.

Ткани человека и работа, связанная с кровью, в этом протоколе соответствует руководящим принципам Совета по институциональному обзору Университета Рутгерса (IRB).

1. Расширение NK-клеток из тканей печени (день 0), как показано на рисунке 1.

ПРИМЕЧАНИЕ: Начальное количество клеток и жизнеспособность сильно коррелируют со временем с момента удаления органа и начальным количеством образца ткани. Однако, если ткани поместить в 30 мл сбалансированного соляного раствора Хэнка (HBSS) и хранить на льду или в холодильнике при 4 °C в течение ночи, NK-клетки все еще могут быть расширены с высокой чистотой и жизнеспособностью до 24 ч спустя.

1. Идентификация жизнеспособных участков тканей для получения лимфоцитов из тканей и срезов с помощью стерильного хирургического оборудования.
2. Поместите ткани в 30 мл HBSS (без кальция или магния) и держите на льду до готовности к выделению.
3. Измельчите ткань на кубики <0,5 см с помощью стерильных бритвенных лезвий или ножниц и щипцов внутри шкафа для биобезопасности.
4. Приготовьте 1x раствор коллагеназы IV (1 мг/мл), разбавив 10x бульон в HBSS (10x Collagenase IV: 10 мг/мл или ~200 Ед/мл).
5. Поместите измельченные кусочки ткани в тканевые диссоциаторные трубки. Заполните пробирки не более чем 4 г ткани и погрузите кусочки ткани в ~10 мл 1x коллагеназы IV.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование ДНКазы I не рекомендуется, так как это может немного снизить жизнеспособность и выход NK. Пожалуйста, обратитесь к Таблице материалов для конкретных используемых тканевых диссоциаторных трубок.
6. Поместите трубки тканевого диссоциатора в тканевой диссоциатор и смешайте при 37 °C, чтобы тщательно измельчить ткань.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для ткани печени это может занять более 30 минут. Для более рыхлой ткани может быть достаточно около 15 минут. Пожалуйста, обратитесь к Таблице материалов для конкретных тканевых диссоциаторных трубок и используемого тканевого диссоциатора.
7. Удалите тканевые диссоциаторные трубки и тритурируйте через ситечко нейлоновых клеток 40 мкм, используя заднюю часть шприца объемом 5 мл. Соберите элюент и выбросьте крупные непереваренные фрагменты.
8. Открутите элюент при 400 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Аспирировать супернатанта.
9. Повторное суспендирование клеточных гранул в 30% покрытом поливинилпирролидоном (PVP) кремнеземом для удаления жировых клеток, которые в противном случае загрязнят конечную фракцию лимфоцитов.
   1. Чтобы приготовить 1 кремнезем с PVP-покрытием, используйте разбавление кремнезема с PVP-покрытием 9:1 в 10x PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к Таблице материалов для конкретного используемого кремнезема с PVP-покрытием.
   2. Для получения 30% кремнезема с PVP-покрытием разбавьте 1 кремнезем с PVP-покрытием PBS/HBSS.
10. Открутите ячейку гранулы при 400 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Аспирировать супернатанта.
11. Повторно суспендируют гранулу ячейки в 9 мл среды R-10.
    ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для состава сред R-10
12. Осторожно нанесите клеточную суспензию на 4 мл Ficoll или среды разделения лимфоцитов, чтобы отделить лимфоциты от эритроцитов и полиморфноядерных клеток.
13. Отделите слои центрифугированием при 400 х g в течение 23 мин при комнатной температуре с выключенным ускорением и торможением или при самой низкой настройке. Тщательно декантируйте верхний средний слой и собирайте межфазные, содержащие инфильтрирующие ткань лимфоциты.
14. Промыть клетки 10 мл среды и приступить к подсчету клеток, проточной цитометрии, аликотированию и замораживанию клеток или первичному протоколу расширения NK.

2. Первичное расширение NK-клеток из НБМК (или CB или тканей органов) (День 0), как показано на рисунке 2.

1. Разморозьте замороженный PBMC и замороженные, облученные питательные клетки на водяной бане с температурой 37 °C.
2. Промыть PBMC и 100 гамма-облученных (Gy-облученных) 221-mIL-21 клеток центрифугированием при 400 х г в течение 5 мин с 10 мл среды R-10 отдельно.
3. Сохраните 1 x 10⁶ клеток PBMC для проточной цитометрии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Начальная чистота NK-ячейки является важным фактором при расчете скорости расширения NK-ячейки.
4. Повторное суспендирование клеток в 1 мл среды R-10. Подсчитайте ячейки с помощью Trypan Blue.
5. Смешайте 5x 10⁶ клеток PBMC с 10 x 10⁶ ячейками 100 Gy-облученными 221-mIL-21 ячейками в специальной 6-луночной пластине (см. Таблицу материалов).
6. Добавить 30 мл среды R-10, дополненной человеческим IL-2 (200 ЕД/мл) и человеческим IL-15 (5 нг/мл) (см. Таблицу материалов).
7. Инкубируйте специальную плиту из 6 скважин при 37 °C с 5% CO₂.
8. Замените среду средой R-10, дополненной человеческим IL-2 (200 Ед / мл) и человеческим IL-15 (5 нг / мл) для поддержания NK-клеток каждые 3-4 дня.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте менее 20 x 10⁶ ячеек на лунку для дальнейшего расширения при каждом изменении среды. Для лучшей жизнеспособности убедитесь, что общее количество клеток в каждой лунке не превышает 100 х 10⁶ клеток.
9. Записывайте общее количество клеток, жизнеспособность и выполняйте проточную цитометрию каждые 3-4 дня, чтобы рассчитать скорость расширения NK-клеток.

3. Прикрепление клеток 293T (День 2), как показано на рисунке 2.

1. Разделение 1,8 x 10⁶ 293T клеток в 11 мл среды D-10 на обработанную пластину 100 мм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для состава сред Д-10
2. Инкубировать клетки 293T при 37 °C с 5% CO₂.

4. Ретровирусная трансфекция (День 3)

1. В пробирке объемом 1,7 мл смешайте 470 мкл восстановленной сывороточной среды с 30 мкл трансфекционного реагента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к Таблице материалов для конкретных восстановленных сывороточных сред и трансфекционных реагентов, используемых.
2. В отдельной пробирке объемом 1,7 мл добавьте 2,5 мкг плазмиды pRDF, 3,75 мкг плазмиды Pegpam3 и 2,5 мкг конструкции CAR в векторе SFG в восстановленную сывороточную среду, чтобы конечный объем составлял 500 мкл.
3. Смешайте растворы на шагах 4.1 и 4.2 по каплям.
4. Инкубировать пробирку при комнатной температуре в течение 15 мин.
5. Добавьте 1 мл смеси со стадии 4,4 до 293T клеточной пластины на 1-й день по каплям.
6. Инкубировать пластину (пластины) при 37 °C с 5% CO₂ в течение 48-72 ч.

5. Ретронектиновое покрытие пластин (День 3)

1. Разбавить белок ретронектина фосфатным буферизованным физиологическим раствором (PBS) до конечной концентрации 50-100 мкг/мл.
2. Добавьте 500 мкл разбавленного ретронектина в каждую скважину необработанной плиты из 24 скважин (5 скважин на конструкцию CAR). Запечатайте пластину с помощью парапленки и инкубируйте пластину при 4 °C в течение ночи.

6. Трансдукция (День 4)

1. Центрифугировать ретронектиновую пластину при 2103 х г в течение 30 мин при 4 °C. Выбросьте супернатант.
2. Заблокируйте каждую скважину 24-луночной плиты 1 мл среды R-10.
3. Инкубировать пластину при 37 °C с 5% CO₂ в течение 1 ч.
4. Предварительно нагрейте центрифугу до 32 °C, пока ретронектиновая пластина блокируется.
5. Соберите супернатант ретровируса, фильтруя трансфектированные клетки 293T с помощью фильтра 0,45 мкм.
6. Aliquot 2 мл фильтрованного супернатанта ретровируса в каждую лунку.
7. Центрифугировать 24-луночную пластину при 2103 х г в течение 2 ч при 32 °C.
8. Во время пластинчатого центрифугирования соберите расширенные ячейки PBNK с дня 0 и подсчитайте клетки с помощью Trypan Blue.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжайте расширять ячейки PBNK путем добавления среды R-10, дополненной IL-2 (200 ЕД/мл) и IL-15 (5 нг/мл).
9. Разбавляйте расширенные ячейки ПБНК средой R-10, дополненной IL-2 (200 Ед/мл) и IL-15 (5 нг/мл) до 2,5 х 10^5-5 х 10⁵ клеток/мл (0,5 х 10^6-1 х 10⁶ ячеек на лунку).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Запишите общее количество клеток, жизнеспособность и сохраните 5 x 10⁵ расширенных PBNK клеток для проточной цитометрии, поскольку эти значения важны для определения скорости расширения NK-клеток.
10. После центрифугирования частично аспирируют супернатант ретровируса из каждой лунки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не следует полностью аспирировать, т.е. оставлять примерно 100 мкл ретровирусного супернатанта на лунку, так как это снизит эффективность трансдукции.
11. Аликвота 2 мл разбавленных расширенных ПБНК клеток от стадии 6,8 до каждой лунки.
12. Центрифугировать пластину при 600 х г в течение 10 мин при 32 °C. Инкубировать пластину при 37 °C с 5% CO₂ в течение 48-72 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не парафильмируйте пластину.

7. Сбор клеток CAR-NK (день 6 или 7), как показано на рисунке 2.

1. Аккуратно соберите ячейки с 24-луночной пластины и перенесите ячейки в центрифужную трубку объемом 50 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Старайтесь не генерировать пузырьки, так как это приведет к снижению жизнеспособности клеток.
2. Центрифугируйте трубку при 400 х г в течение 5 мин.
3. Повторно суспендируйте гранулу 1 мл среды R-10 и подсчитайте клетки с помощью Trypan Blue.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраните 5 x 10⁵ клеток для проточной цитометрии для определения эффективности трансдукции.
4. Переложите повторно суспендированные ячейки на специальную 6-луночную пластину, содержащую 30 мл среды R-10, дополненную IL-2 (200 Ед/мл) и IL-15 (5 нг/мл).
5. Инкубируйте специальную плиту из 6 скважин при 37 °C с 5% CO₂.
6. Замените носители R-10, дополненные IL-2 (200 Ед/мл) и IL-15 (5 нг/мл) для поддержания NK-клеток каждые 3 - 4 дня.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте менее 20 x 10⁶ ячеек на скважину для дальнейшего расширения при каждом изменении. Для лучшей жизнеспособности убедитесь, что общее количество клеток в каждой лунке не превышает 100 х 10⁶ клеток.
7. Записывайте общее количество клеток, жизнеспособность и выполняйте проточную цитометрию каждые 3-4 дня, чтобы рассчитать скорость расширения NK-клеток.
8. Используйте клетки для соответствующих анализов in vitro или in vivo .
   ПРИМЕЧАНИЕ: Расширенный PBNK ex vivo и CAR-NK клетки можно культивировать в инкубаторе с температурой 37 °C в течение примерно 4 недель.
9. Исследуйте количество и чистоту NK-клеток на 7-й день, 11-й день, 14-й день, 18-й день и 21-й день с помощью проточной цитометрии.

Схематический рабочий процесс изоляции NK-клеток, инфильтрирующих ткани, и расширения клеток PBNK с использованием методологии 221-mIL-21 фидерных клеток показан на рисунке 1 и рисунке 2. Расширенные PBNK-клетки собирали каждые 3 или 4 дня для проточной цитометрии для определения чистоты NK-клеток путем окрашивания клеток античеловеческим CD56 и античеловеческим CD3. Эксперимент был повторен с использованием двух разных доноров, чтобы показать воспроизводимость системы расширения (рисунок 3). Было показано, что клетки PBNK, расширенные на 221-mIL-21, расширяются почти в 5 × 104 раза (рисунок 3A). Кроме того, чистота NK-клеток поддерживалась высоко, около 85% на протяжении всего 21-дневного расширения (рисунок 3B). Используя систему расширения фидерных клеток 221-mIL-21, чистота NK-клеток постоянно колебалась в пределах 85-95%, независимо от доноров (данные не показаны). Чтобы продемонстрировать надежность системы расширения 221-mIL-21, NBMC были окрашены для анти-CD56 и анти-CD3 перед расширением, что показало чистоту клеток 7,09% для NK-клеток и высокий процент Т-клеток (рисунок 4A). PBMC кокультурировали с 221-mIL-21 для расширения NK-клеток; чистота NK была проверена перед трансдукцией CAR-NK на 4-й день (рисунок 4A). CAR-NK-клетки были собраны и окрашены для анти-CD56, анти-CD3 и анти-hIgG(H+L) F(ab')2, которые показали высокую популяцию NK-клеток (86,9% на 7-й день) и высокую эффективность трансдукции CAR примерно 70% (Рисунок 4). Более высокая эффективность трансдукции (до 95%) также наблюдалась с использованием системы упаковки ретровирусов. В целом, эти данные показывают, что фидерные клетки 221-mIL-21 могут успешно расширять NK-клетки и сохранять чистоту NK-клеток ex vivo.

Рисунок 1: Диаграмма расширения NK-клеток из твердых образцов органов человека. Вкратце, полученные образцы печени человека измельчают в небольшие кубики для механического пищеварения. Диссоциированные клетки затем изолируют с использованием кремнезема, покрытого PVP, и среды разделения лимфоцитов. Далее NK-клетки расширяются с использованием протокола расширения, описанного на рисунке 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Схематический рабочий процесс генерации клеток CAR-NK из НБМК. Вкратце, 221-mIL21 фидерные клетки были облучены при 100 Гр перед кокультурированием с ПОМОЩЬЮ PBMCs, дополненных IL-2 и IL-15 на 0-й день. Параллельно 293T-клетки были трансфектированы системой упаковки ретровируса для получения ретровируса CAR, который затем трансдуцировался в расширенные клетки PBNK в присутствии IL-2 и IL-15. Первичные клетки CAR-NK были собраны на 7-й день и продолжали расширяться в течение 21 дня. Эта цифра была изменена по сравнению с Yang et al.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Динамическое повременное расширение ячеек ПБНК. (А) Складное расширение ПБНК в течение 22-дневного времени. Клетки окрашивали анти-CD56 и анти-CD3 в указанные дни для проточной цитометрии. Общее количество NK-клеток определяли путем умножения чистоты NK-клеток на общее количество клеток. Скорость расширения была сгенерирована следующим образом: (Количество NK-клеток)Tn/(Число NK-клеток)T0, где Число NK-клеток = (процент чистоты NK-клеток) × (общее количество клеток),T0 - количество NK-клеток в момент 0-го дня, а Tn - количество NK-клеток в момент времени дня n. (B) Чистота NK-клеток в течение 22-дневного временного курса. Расширение NK-клеток повторялось два раза с двумя разными донорами. Полосы ошибок представляют ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Репрезентативный цитометрический анализ цитометрических клеток CAR-NK. (A) Репрезентативные точечные графики, показывающие динамическую покадровую четкость NK-клеток CAR-NK клеток в течение 18-дневного курса. Анализ проточной цитометрии оценивали путем окрашивания клеток анти-CD56 и анти-CD3 в указанные моменты времени. День 0 указывает на предварительное расширение ПБНК. День 4 указывает на пострасширение ПБНК и претрансдукцию CAR-NK клеток. День 7 указывает на посттрансдукцию CAR-NK клеток. (B) Репрезентативные точечные графики, показывающие эффективность трансдукции клеток CAR-NK с использованием системы упаковки ретровирусов. Клетки окрашивали анти-CD56, анти-CD3 и анти-hIgG(H+L) F(ab')2 для проточной цитометрии. (C) Репрезентативные точечные графики, показывающие выражение CAR в различных подмножествах, включая CD56+CD3-, CD56-CD3+, CD56+CD3+ и CD56-CD3- на 18-й день. Клетки окрашивали анти-CD56, анти-CD3 и анти-hIgG(H+L) F(ab')2 (что указывает на экспрессию CAR) для проточной цитометрии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.