В этой статье описывается подробный протокол использования датчиков натяжения на основе ДНК для визуализации рецепторных сил, приложенных иммунными клетками. Этот подход может отображать рецепторные силы >4,7 пН в режиме реального времени и может интегрировать силы с течением времени.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Зонды натяжения ДНК для картирования переходных сил рецептора пиконьютона иммунными клетками
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Механические силы, передаваемые на стыке между двумя соседними клетками и на стыке между клетками и внеклеточным матриксом, имеют решающее значение для регуляции многих процессов, начиная от развития и заканчивая иммунологией. Поэтому разработка инструментов для изучения этих сил на молекулярном уровне имеет решающее значение. Наша группа разработала набор датчиков молекулярного натяжения для количественной оценки и визуализации сил, генерируемых клетками и передаваемых конкретным лигандам. Наиболее чувствительный класс датчиков молекулярного натяжения состоит из шпилек со стволовыми петлями нуклеиновых кислот. Эти датчики используют пары флуорофор-гаситель, чтобы сообщать о механическом расширении и разворачивании шпилек ДНК под действием силы. Одна из проблем, связанных с датчиками натяжения шпилек ДНК, заключается в том, что они обратимы с быстрым складыванием шпильки после прекращения натяжения, и, таким образом, переходные силы трудно зарегистрировать. В этой статье мы описываем протоколы подготовки датчиков натяжения ДНК, которые можно «заблокировать» и предотвратить повторное складывание, чтобы обеспечить «хранение» механической информации. Это позволяет регистрировать высокопереходные пиконетонные силы, которые впоследствии могут быть «стерты» добавлением комплементарных нуклеиновых кислот, снимающих блокировку. Эта способность переключаться между картированием напряжения в реальном времени и механическим хранением информации выявляет слабые, кратковременные и менее обильные силы, которые обычно используются Т-клетками как часть их иммунных функций.
Введение
Иммунные клетки защищаются от патогенов и раковых клеток, непрерывно ползая и сканируя поверхности клеток-мишеней на наличие антигенов, усеивая их поверхность 1,2. Распознавание антигена инициируется при связывании между Т-клеточным рецептором (TCR) и комплексом пептидно-главной гистосовместимости MHC (pMHC), экспрессируемым на поверхности клеток-мишеней. Поскольку распознавание TCR-pMHC происходит на стыке между двумя подвижными клетками, долгое время подозревалось, что он испытывает механические силы. Более того, это привело к механосенсорной модели активации TCR, которая предполагает, что силы TCR способств....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Трансгенные мыши OT-1 размещены в Отделе ресурсов животных в Университете Эмори. Все эксперименты были одобрены и выполнены в соответствии с протоколом Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC).
1. Олигонуклеотидный препарат
- Растворите ДНК цепи лиганда в воде (удельное сопротивление 18,2 МОм, используемое во всем протоколе). Закрутите и раскрутите раствор с помощью настольной центрифуги. Отрегулируйте объем воды таким образом, чтобы конечная концентрация составляла 1 мМ. Проверьте концентрацию с помощью нанокапельного спектрофотометра для измерения поглощения на длине волны 260 нм и определения к....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Здесь мы показываем репрезентативные изображения контроля качества поверхности (рис. 4). Высококачественная поверхность должна иметь чистый фон в канале RICM (рис. 4B) и равномерную интенсивность флуоресценции в канале Cy3B (рис. 4C). При одинаковом оборудовании для визуализации и идентичных условиях получения флуоресцентной визуализации фоновая интенсивность флуоресценции должна быть постоянной и воспроизводимой каждый раз при пров.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
С помощью подробных процедур, представленных здесь, можно подготовить субстраты зонда натяжения шпильки ДНК для картирования и количественной оценки напряжения рецепторов, продуцируемого иммунными клетками. Когда клетки наносятся на подложку зонда натяжения шпильки ДНК, они приземляются, прикрепляются и распространяются по мере того, как рецепторы ощущают лиганды как химически, так и механически, последний из которых обнаруживается нашими зондами. Однако в некоторых случаях клетки могут не распространяться (
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантами NIH R01GM131099, NIH R01GM124472 и NSF CAREER 1350829. Мы благодарим Центр тетрамеров NIH за лиганды pMHC. Это исследование было частично поддержано Emory Comprehensive Glycomics Core.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 3-гидроксипиколиновая кислота (3-HPA) | Sigma | 56197 | maldi-TOF-MS matrix |
| mPEG-SC | Biochempeg | MF001023-2K | поверхностный препар |
| (3-аминопропил)триэтоксисилан | Акрос | AC430941000 | поверхностный преп |
| 10x Буфер для лизиса эритроцитов | Biolegend | 00-4333-57 | буфер |
| 8,8 нм наночастицы золота, дубильная кислота | Nanocomposix | индивидуальный порядок | подготовки поверхности |
| Atto647N NHS эфир | Sigma | 18373-1MG-F | флуорофор, олиго преп |
| Attofluor Cell Chamber, для микроскопии | Thermo Fisher Scientific | A7816 | визуализация |
| BD Шприцы только с Luer-Lok | BD bioscience | 309657 | клетки |
| биотинилированные антимышиные CD3e | ebioscience | 13-0031-82 | антитело/лиганд |
| Биотинилированный pMHC овальбумин (SIINFEKL) | NIH Tetramer Core Facility в Университете Эмори | NA | антитела/лиганд |
| бычий сывороточный альбумин | Sigma | 735078001 | блокируют неспецифические взаимодействия |
| Клеточные фильтры | Biologix | 15-1100 | cells |
| Coverslip Mini-Rack, тефлон | Thermo Fisher Scientific | C14784 | подготовка поверхности |
| Cy3B NHS ester | GE Healthcare | PA63101 | флуорофор, олигоподготовка |
| Фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS) | Corning | 21-031-CM | буферный |
| этанол | Sigma | 459836 | подготовка поверхности |
| Hank' s сбалансированные соли (HBSS) | Sigma | H8264 | буфер |
| перекись водорода | Sigma | H1009 | подготовка поверхности |
| LA-PEG-SC | Biochempeg | HE039023-3.4K | подготовка поверхности |
| Midi MACS (LS) стартовый набор | Miltenyi Biotec | 130-042-301 | клетки |
| мыши CD8+ Т-клетки набор для изоляции | Miltenyi Biotec | 130-104-075 | |
| Центробежные приборы Nanosep MF | Pall laboratory | ODM02C35 | oligo prep |
| No. 2 круглые стеклянные покровные стекла | VWR | 48382-085 | surface prep |
| NTA-SAM | Dojindo Molecular Technologies | N475-10 | surface prep |
| P2 gel | Bio-rad | 1504118 | oligo prep |
| sufuric acid | EMD Millipore Corporation | SX1244-6 | surface prep |
| Sulfo-NHS ацетат | Thermo Fisher Scientific | 26777 | подготовка поверхности |
| Equipment | |||
| Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 колонка, 4,6 x 150 мм, 2,7 μ m | 653950-702 | олигонуклеотидный препарат | |
| Barnstead Nanopure система очистки воды | Thermo Fisher | water | |
| CFI Apo 100× NA 1.49 объектив | Nikon | Микроскопия | |
| Cy5 куб | CHROMA | Микроскопия | |
| эволюционирующего электронного устройства с зарядовой связью (EMCCD) | Фотометрическая | микроскопия | |
| Высокопроизводительная жидкостная хроматография | Agilent 1100 | олигонуклеотидный препарат | |
| Интенсивный свет Источник эпифлуоресценции | Nikon | Микроскопия | |
| Матричный лазерный десорбционный/ионизационный времяпролетный масс-спектрометр (MALDI-TOF-MS) | Вояджер STR | олигонуклеотидный препарат | |
| Nanodrop 2000 UV-Vis Спектрофотометр | Thermo Fisher | олигонуклеотидный препарат | |
| Nikon Eclipse Ti инвертированный микроскоп | Nikon | Микроскопия | |
| Nikon Perfect Focus System Nikon | микроскопии | ||
| NIS Elements | Четырехдиапазонная | микроскопия | |
| 405/488/561/647 куб | CHROMA | Микроскопия | |
| RICM куб | CHROMA | Микроскопия | |
| TIRF с длиной волны 488 нм (50 мВт), 561 нм (50 мВт) и 640 нм | Когерентная | микроскопия | |
| TRITC куб | CHROMA | Микроскопия | |
| oligo название< | strong>5' модификация / 3' модификация | sequence (от 5' до 3') | Use |
| >15mer аминовая блокирующая нить | 5' модификация: без модификации 3' модификация: /3AmMO/ | AAA AAA cat tta tac cct acc ta | блокировка сигнал натяжения в реальном времени |
| 15мер Atto647N блокировка прядь | 5' модификация: Atto647N 3' модификация: /3AmMO/ | AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA | блокировка сигнал натяжения в реальном времени |
| 15mer нефлуоресцентная блокирующая прядь | 5' модификация: без модификации 3' модификация: без модификации | A AAA AAC ATT TAT AC | блокировка сигнала натяжения в реальном времени для количественного анализа |
| 4,7 пН шпилька прядь | 5' модификация: без модификации 3' модификация: без модификации | GTGAAATACCGCACAGATGCGT TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC CAGC | шпилечный зонд |
| амин лиганд нить | 5' модификация: /5AmMC6/ 3' модификация: /3Bio/ | CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT | шпилька щупочный щуп |
| BHQ2 якорная прядь | 5' модификация: /5ThiolMC6-D/ 3' модификация: /3BHQ_2/ | TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTT& | nbsp; шпилечный зонд |
| Cy3B ligand strand | 5' модификация: Cy3B 3' модификация: /3Bio/ | CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT | шпилька щупочный зонд |
| разблокировка нить | 5' модификация: без модификации 3' модификация: без модификации | TAG GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT C | разблокировка сигнала накопленного натяжения |
Ссылки
- Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunological Reviews. 221 (1), 77-89 (2008).
- Spillane, K. M., Tolar, P. B cell antigen extraction is regulated by physical properties of antigen-presenting cells.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
