Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Частичная гепатэктомия у взрослых рыбок данио

4.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62349

⸱

4 апреля 2021 г.

 , 
1Harvard Medical School, 2Brigham and Women’s Hospital, 3Massachusetts General Hospital

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает процедуру удаления вентральной доли печени у взрослых рыбок данио, чтобы обеспечить возможность изучения регенерации печени.

Аннотация

Печеночная недостаточность является одной из ведущих причин смерти во всем мире, а смертность от хронических заболеваний печени резко возрастает в Соединенных Штатах. Здоровая печень способна регенерировать от токсического повреждения, но при запущенном заболевании печени естественная способность печени к регенерации нарушается. Рыбки данио стали мощной экспериментальной системой для изучения регенерации. Они являются идеальной моделью для изучения регенерации печени после частичной гепатэктомии, процедуры, имеющей прямое клиническое значение, при которой часть печени удаляется хирургическим путем, оставляя остальную часть нетронутой. Не существует стандартного протокола для частичной гепатэктомии; Предыдущие исследования с использованием этой модели использовали несколько разные протоколы и сообщали о несопоставимых результатах. Здесь описан эффективный, воспроизводимый протокол для выполнения частичной гепатэктомии у взрослых рыбок данио. Мы используем эту технику, чтобы продемонстрировать, что рыбки данио способны к эпиморфной регенерации резекционированной доли. Этот протокол может быть использован для дальнейшего опроса механизмов, необходимых для регенерации печени у рыбок данио.

Введение

Среди твердых органов у человека печень является единственным органом, способным к регенерации1. Это имеет решающее значение, так как печень является важным органом, ответственным за ключевые метаболические функции, хранение энергии, детоксикацию крови, секрецию белков плазмы и выработку желчи2. Гепатоциты, потерянные из-за токсического или воспалительного повреждения, заменяются в основном путем деления оставшихся гепатоцитов1. Одной из классических экспериментальных моделей для изучения регенерации печени является частичная гепатэктомия, при которой удаляются отдельные доли печени, оставляя оставшиеся доли нетронутыми3. Эта процедура была первоначально разработана на крысах, у которых удаляется примерно две трети печеночной массы. После частичной гепатэктомии у млекопитающих компенсаторная регенерация происходит в оставшихся долях до тех пор, пока печень не восстановит свою первоначальную массу. Примечательно, что печень млекопитающих не заменяет отсутствующие доли.

Рыбки данио (Danio rerio) представляют собой пригодную модель для изучения регенерации органов взрослыхособей 4. Печень рыбок данио, хотя и структурно отличается от печени млекопитающих, состоит из тех же типов клеток и выполняет ту же функцию, что и у млекопитающих2. Он состоит из трех долей, с двумя дорсальными долями и одной вентральной долей, которые уплощены вдоль кишечника. Частичная гепатэктомия ранее проводилась у рыбок данио, с противоречивыми отчетами о точном способе регенерации. Как правило, одна треть частичной гепатэктомии выполняется путем удаления всей вентральной доли. Первоначальные сообщения указывали, что после удаления вентральной доли она была полностью регенерирована в течениенедели 5,6,7,предполагая, что в отличие от печени млекопитающих, печень рыбок данио способна к эпиморфной регенерации. Последующие исследования показали, что удаление вентральной доли приводило к компенсаторной регенерации в дорсальных долях, а не к регенерации отсутствующей вентральной доли, и в конечном итоге к восстановлению печеночной массы в течение8,9недель. Транскриптомное профилирование дорсальных долей после резекции вентральной доли выявило значительные изменения, связанные с компенсаторной регенерацией10. Учитывая, что режим регенерации печени может варьироваться в зависимости от степени повреждения8,мы предположили, что расхождения в результатах могут быть связаны с техническими вариациями в протоколе частичной гепатэктомии между исследовательскими группами.

Этот протокол описывает процедуру выполнения одной трети частичной гепатэктомии на взрослых рыбках данио путем удаления вентральной доли. Эта методика будет ценна для оценки механизмов регенерации печени.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Рыбок данио выращивали и разводили в соответствии со стандартными процедурами. Эксперименты были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Бригама и женской больницы (2016N000405). Взрослых рыбок данио голодали за 24 часа до начала протокола. Системная вода относится к воде в аквариумах для рыбок данио в водном объекте.

1. Подготовка и обезболивание

  1. Готовят 0,016% раствор трикаина в системной воде.
    ВНИМАНИЕ: Трикаин является раздражителем, если он контактирует с глазами, кожей или дыхательными путями.
  2. Приготовьте губку для хранения анестезированных рыбок данио во время протокола рассечения. Разрежьте полную губку на четвертины. Используя лезвие бритвы, удалите тонкий клин губки, который проходит параллельно длинной оси губчатой четверти.
    1. Щель должна быть достаточно длинной, чтобы вместить взрослую рыбу (это будет варьироваться между разными размерами рыбы). Например, для взрослой рыбы длиной 35 мм длина щели должна составлять 20 мм. Голова и тело плотно удерживаются в губке, но хвост проходит мимо края губки(рисунок 1В).
  3. Замочите губку в 0,016% растворе трикаина.
  4. Поместите взрослых рыбок данио (самцов или самок) в 625 мл 0,016% раствора трикаина.
  5. Инкубировать в течение 6 минут или до тех пор, пока рыба не перестанет реагировать на прикосновения.
  6. Используя щипцы, осторожно извлеките рыбу из аквариума Трикаин и поместите рыбу вентральной стороной вверх в канавку губки(Рисунок 1А - В).
  7. Поместите губку под рассекающий микроскоп с подсветкой сверху вниз.

2. Хирургия

  1. Используя тонкие щипцы, защемляйте кожу и чешуйки медиально, только с задней стороны сердца(рисунок 1B).
  2. Используя подпружиненные ножницы, сделайте разрез под щипцами для создания отверстия в полости тела(рисунок 1С - D). Позаботьтесь о том, чтобы не повредить сердце или крупный кровеносный сосуд, так как это приведет к увеличению смертности.
  3. Используя подпружиненные ножницы, сделайте разрез 3-4 мм вдоль брюшка, обрабатывая с задней стороны до тех пор, пока разрез не поступит на брюшные плавники(рисунок 1D - E). К этому моменту вентральная доля печени может быть видна через разрез.
  4. Сожмите стороны губки одной рукой, чтобы вытеснить висцеральные органы из полости тела. Вентральная доля печени будет видна поверх кишечника(рис. 1F,2A-B). Печень будет выглядеть как розовая или оранжевая структура, разбросанная по золотисто-коричневой кишке. Животные, обозначенные как фиктивные контрольные, восстанавливаются на этом этапе.
  5. Сожмите мелкие щипцы так, чтобы два зубья соприкасались. Сохраняя давление на губку, скользите зубьями тонких щипцов между печенью и кишечником(рисунок 1G). Позаботьтесь о том, чтобы не проколоть кишечник, так как это приведет к повышенной смертности.
  6. Медленно расслабьте давление на щипцы так, чтобы зубья отдаляли друг от друга(рисунок 1H). Это скользящее действие разрывает многочисленные прикрепления воротной вени между вентральной мочкой и кишечником(рисунок 2B)и необходимо для чистого удаления вентральной доли. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока все портальные связи между печенью и кишечником не будут разорваны.
  7. Отшелушить вентральную мочку от кишечника с помощью тонких щипцов и отрезать вентральную мочку свободно от остальной части печени(рисунок 1I).
  8. Эта процедура приводит к одной трети частичной гепатэктомии(рисунок 1J).

3. Восстановление

  1. Осторожно выньте рыбу из губки и поместите ее в резервуар с системной водой.
  2. Пипетная система поливает жабры в течение нескольких минут, пока рыба не заплывет самостоятельно(рисунок 1K).
  3. Контролируйте рыбу в течение 2-4 часов, прежде чем поместить ее обратно в систему. Не кормите рыбу в течение полных 24 ч после операции.
  4. Ежедневно контролируйте рыбу в течение всего эксперимента.
  5. Со временем разрез в стенке тела заживет естественным путем без необходимости наложения швов(рисунок 1L,2C).

4. Анализ доли вентральной доли к кишечнику

  1. Усыпить всех животных, предназначенных для анализа, в ледяной воде в течение 10 минут до тех пор, пока не прекратятся все оперкулярные движения.
  2. Извлеките рыбу из ледяной воды и поместите ее брюшной стороной вверх в паз губки.
  3. С помощью подпружиненные ножницы сделайте разрез в стенке вентрального тела в передне-заднем положении сердца. Затем сделайте еще два разреза, которые проходят вдоль передне-задней оси от первого разреза до брюшных плавников. (Рисунок 2А).
  4. Отшелушивайте кожу и мышцы, чтобы выявить висцеральные органы(рисунок 2А).
  5. Получение ярко-полевых и флуоресцентных изображений висцеральных органов с помощью эпифлуоресцентного микроскопа. Это поле зрения будет включать область, где была резектирована вентральная доля. Поскольку животные подвергаются эвтаназии перед анализом, этот вид анализа исключает долгосрочную визуализацию одной и той же рыбы.

5. Анализ соотношения печени к массе тела

  1. Усыпить всех животных, предназначенных для анализа, в ледяной воде в течение 10 минут до тех пор, пока не прекратятся все оперкулярные движения.
  2. Поместите рыбу в коническую трубку 50 мл.
  3. Добавьте 25 мл 4% параформальдегида в 1x PBS и 0,3% Tween в пробирку.
    ВНИМАНИЕ: Формальдегид токсичен, и растворы, содержащие формальдегид, всегда должны обрабатываться в химической вытяжке.
  4. Нутят в течение 48 ч при 4 °C.
  5. Выполните четыре 10-минутные стирки в 1x PBS и 0,3% анимации.
  6. Достать рыбу щипцами и смахнуть насухо на бумажном полотенце.
  7. Запишите вес всей рыбы.
  8. С помощью подпружиненные ножницы сделайте разрез в стенке вентрального тела в передне-заднем положении сердца. Затем сделайте еще два разреза, которые проходят вдоль передне-задней оси от первого разреза до тазовых плавников. (Рисунок 2А).
  9. Отшелушивайте кожу и мышцы, чтобы выявить висцеральные органы(рисунок 2А).
  10. Получайте изображения печени с ярким полем с помощью эпифлуоресцентного микроскопа.
  11. Рассеките печень, поместив кусочки печени на весовую лодку.
  12. Запишите вес печени.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Чтобы изучить регенеративный потенциал печени взрослой рыбки данио, мы провели частичную гепатэктомию (PHX) у взрослых рыбок данио. В основном отбирались крупные взрослые особи (30-40 мм в длину), начиная от 1,5-2,5 лет. В ходе отдельных экспериментов животные были отобраны из одного аквариума и соответствовали возрасту и размеру. В качестве соответствующего контроля мы использовали фиктивные операции, в которых животное было обезболено и получило большой разрез в стенке вентрального тела, но было восстановлено без удале...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Анатомические различия между моделями регенеративной печени рыбок данио и млекопитающих представляют собой уникальные проблемы для резекции печени. Печень у рыбок данио находится в непосредственной близости от сердца и кишечника; непреднамеренное повреждение любого органа приводит к увеличению смертности. Печень рыбок данио не инкапсулирована, что затрудняет ее отделение от кишечника. Печень получает богатую питательными веществами кровь из кишечника через портальные вены. У млекопитающих вены, выходящие из кишечника, сх...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

I.M.O. поддерживается NIAAA (F32AA027135). W.G. поддерживается R01DK090311, R01DK105198, R24OD017870 и Программой Клаудии Адамс Барр по передовому опыту в исследованиях рака. W.G. является ученым Pew в области биомедицинских наук.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
16% параформальдегидный водный раствор, EM GradeElectron Microscopy Sciences15700
50 мл Falcon Centrifuge Tubes, полипропилен, стерильныйCorning352098
AS 82/220.R2 PLUS Analytical BalanceBay State Scale & Системс, ИНК.WL-104-1051
Dumont #55 ЩипцыFine Science Инструменты11295-51
EMS Kuehne Coverglass/Образец щипцовЭлектронная микроскопия Науки72997-07
Эпифлуоресцентный микроскопZeissDiscovery.V8
Mastertop Целлюлозный скрабГубка AmazonB07CBSM53Z
PBS10X Liquid Conc 4 лEMD Millipore6505-4L
Супертонкие микроножницы, 3 1/4" прямыебиомедицинские исследовательские инструменты11-1020
Трикаин метансульфонатSyndelTRIC-M-GR-0010
Tween 20, Fisher BioReagentsFischer ScientificBP337-500

Ссылки

  1. Michalopoulos, G. K. Principles of liver regeneration and growth homeostasis. Comprehensive Physiology. 3, 485-513 (2013).
  2. Wang, S., Miller, S. R., Ober, E. A., Sadler, K. C. Making it new again: insight into liver development, regeneration, and disease from zebrafish research. Current Topics in Developmental Biology. 124, (2017).
  3. Michalopoulos, G. K., Bhushan, B. Liver regeneration: biological and pathological mechanisms and implications. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. , (2020).
  4. Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
  5. Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator uhrf1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).
  6. Goessling, W., et al. APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development. Developmental Biology. 320, 161-174 (2008).
  7. Dovey, M., et al. Topoisomerase II is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish. Molecular and Cellular Biology. 29, 3746-3753 (2009).
  8. Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy. The FASEB Journal. 23, 3516-3525 (2009).
  9. Zhu, Z., Chen, J., Xiong, J. W., Peng, J. Haploinsufficiency of Def activates p53-dependent TGFβ signalling and causes scar formation after partial hepatectomy. PLoS One. 9, (2014).
  10. Feng, G., Long, Y., Peng, J., Li, Q., Cui, Z. Transcriptomic characterization of the dorsal lobes after hepatectomy of the ventral lobe in zebrafish. BMC Genomics. 16, 979(2015).
  11. Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. Journal of Cellular Physiology. 213, 286-300 (2007).
  12. Grisham, J. W. Organizational principles of the liver. The Liver: Biology and Pathobiology: Fifth Edition. , 1-15 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Регенерация печенимодель на рыбках-зебраудаление вентральной долиотношение массы печени к массе телафлуоресцентная микроскопиядиссекционный микроскопгенетический инструментарийзаболевания печени
Частичная гепатэктомия у взрослых рыбок данио
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.