Цифровая аннотация с автоматизированным рассечением тканей обеспечивает инновационный подход к обогащению опухоли в случаях с низким содержанием опухоли и адаптируется как к парафиновым, так и к замороженным типам тканей. Описанный рабочий процесс повышает точность, воспроизводимость и пропускную способность и может применяться как к исследованиям, так и к клиническим условиям.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Автоматизированный протокол рассечения для обогащения опухоли в тканях с низким содержанием опухоли
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Обогащение опухоли в тканях с низким содержанием опухоли, которые ниже 20% содержания опухоли в зависимости от метода, требуется для воспроизводимой генерации качественных данных со многими последующими анализами, такими как секвенирование следующего поколения. Автоматизированная рассечение тканей - это новая методология, которая автоматизирует и улучшает обогащение опухоли в этих распространенных тканях с низким содержанием опухоли за счет уменьшения зависящей от пользователя неточности традиционной макродиссекции и ограничений времени, стоимости и опыта микродиссекции лазерного захвата с использованием наложения аннотаций цифрового изображения на незапятнанные слайды. Здесь цифровые аннотации гематоксилина и эозина (H & E) используются для нацеливания на небольшие области опухоли с использованием лезвия диаметром 250 мкм2 в неокрашенном фиксированном парафине формалина (FFPE) или свежезамороженных участках толщиной до 20 мкм для автоматизированного обогащения опухоли до экстракции нуклеиновых кислот и секвенирования всего экзома (WES). Автоматизированное рассечение может собирать аннотированные области в тканях с низким содержанием опухоли из одного или нескольких секций для экстракции нуклеиновых кислот. Он также позволяет собирать обширные метрики сбора до и после сбора урожая, одновременно повышая точность, воспроизводимость и увеличивая пропускную способность с использованием меньшего количества слайдов. Описанный протокол обеспечивает цифровую аннотацию с автоматическим рассечением на животных и/или человеческих FFPE или свежезамороженных тканях с низким содержанием опухоли, а также может быть использован для обогащения любой интересующей области для повышения адекватности для последующих приложений секвенирования в клинических или исследовательских рабочих процессах.
Введение
Секвенирование следующего поколения (NGS) все чаще используется как для ухода за пациентами, так и для исследований рака, чтобы помочь в руководстве лечением и облегчить научные открытия. Ткань часто ограничена, и обычно используются небольшие образцы с переменным содержанием опухоли. Таким образом, адекватность и целостность опухоли остаются препятствием для получения значимых данных. Образцы с более низким процентом опухоли могут вызвать трудности в различении истинных вариантов от артефактов секвенирования и часто не имеют права на NGS1. Было показано, что обогащение опухоли в случаях с низким содержанием опухоли, ниже 20%, помогает получить....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
До начала получите соответствующие образцы тканей в соответствии с протоколами Институционального наблюдательного совета (IRB). Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Genentech, Inc.
1. Подготовка тканей и слайдов
- Выберите FFPE или свежезамороженные тканевые блоки и используйте соответствующий метод обработки ниже.
- Нарежьте участки тканевого блока на положительно заряженных стеклянных слайдах нужной толщины. Последовательное сечение ткани FFPE в лентах с первым эталонным сечением разрезается на толщину, подходящую для окрашивания H&E (т.е. 4....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Были отобраны участки печени мышей FFPE и FF, содержащие метастатический колоректальный рак в ксенотрансплантатах. Участки были окрашены H&E (рисунок 1A, E, I) и отсканированы на целом слайд-тепловизоре с 20-кратным увеличением. Патологоанатом цифрово аннотировал интересующие опухолевые области и маску, которая была сгенерирована с использованием коммерческого программного обеспечения и отформатирована как цифровое эталонное изображение png (рисунок .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь представлен протокол применения цифровой аннотации и автоматизированного рассечения для рассечения опухолевых областей от низкоопухолевых FFPE или свежезамороженных тканей для обогащения опухоли и использования в WES. Сочетание цифровой аннотации и создания маски с автоматизированным вскрытием значительно сокращает требуемое практическое время и опыт, общие для классических методов обогащения опухоли, включая ручную макродиссекции и LCM. Протокол демонстрирует потенциально важный вариант обогащения опухоли среднего.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Чарльз А. Хавнар, Оливер Зилл, Джефф Истхэм, Джеффри Хунг, Дженнифер Гилтнан, Николас Лоунсбери, Даниэль Орепер, Сараджан Сатурнио и Эми А Ло являются сотрудниками и акционерами Genentech и Roche, а Мана Джави и Эммануэль Наури являются сотрудниками и акционерами Roche.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить Кармину Эспириту и Робина Э. Тейлора за их поддержку в разработке автоматизированного вскрытия, а также сотрудников Genentech Pathology Core Laboratory, которые поддержали эту работу.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Agilent SureSelectXT | Agilent | G9611A | |
| AVENIO Millisect Заправочная станция | Roche | 8106533001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, база | Roche | 8106568001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, головка | Roche | 8106550001 | |
| AVENIO Millisect Фрезерные наконечники Small | Roche | 8106509001 | |
| AVENIO Millisect PC | Roche | 8106495001 | |
| BioAnalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Eppendorf 5427R | Eppendorf | 22620700 | микроцентрифуга |
| Инкубационный буфер | Promega | D920D | |
| Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | Автоматизированный краситель |
| Молекулярное минеральное масло | Sigma | M5904-500ML | |
| Протеиназа K | Promega | V302B | Буфер для пищеварения |
| Qiagen AllPrep ДНК/РНК Мини-набор | Qiagen | 80284 | |
| RLT Plus Буфер | Qiagen | 80204 | |
| Superfrost Plus положительно заряженный микроскоп | Thermo Scientific | 6776214 |
Ссылки
- Cho, M., et al. Tissue recommendations for precision cancer therapy using next generation sequencing: a comprehensive single cancer center's experiences. Oncotarget. 8 (26), 42478-42486 (2017).
- Smits, A. J. J., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
