Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

15 15 N CPMG Релаксационная дисперсия для исследования конформационной динамики белка на шкале времени мкс-мс

5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62395

⸱

19 апреля 2021 г.

 ,  , 
1Department of Chemistry, Iowa State University, 2Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь приведено подробное описание реализованного в лаборатории протокола для сбора и анализа профилей релаксационной дисперсии 15Н методом ямР-спектроскопии раствора.

Аннотация

Конформационная динамика белка играет фундаментальную роль в регуляции ферментативного катализа, связывания лигандов, аллостерии и сигнализации, которые являются важными биологическими процессами. Понимание того, как баланс между структурой и динамикой управляет биологической функцией, является новым рубежом в современной структурной биологии и привело к нескольким техническим и методологическим разработкам. Среди них методы ЯМР релаксационного дисперсионного раствора CPMG предоставляют уникальную информацию с атомным разрешением о структуре, кинетике и термодинамике конформационных равновесий белка, возникающих на шкале мкс-мс времени. Здесь в исследовании представлены подробные протоколы для получения и анализа эксперимента по дисперсии релаксации 15Н. В качестве примера показан конвейер для анализа динамики мкс-мс в С-концевом домене бактерий Enzyme I.

Введение

Эксперименты Карра-Перселла Мейбума-Гилла (CPMG) по релаксационной дисперсии (RD) используются на рутинной основе для характеристики конформационных равновесий, возникающих на временной шкале μs-ms с помощью растворной ЯМР-спектроскопии1,2,3,4,5. По сравнению с другими методами исследования конформационной динамики, методы CPMG относительно просты в реализации на современных ЯМР-спектрометрах, не требуют специализированных этапов подготовки образцов (т.е. кристаллизации, замораживания или выравнивания образцов и/или ковалентного сопряжения с флуоресцентной или парамагнитной меткой) и обеспечивают всестороннюю характеристику конформационных эквивалентов, возвращающих структурную, кинетическую и термодинамическую информацию о процессах обмена. Для того, чтобы эксперимент CPMG сообщал о конформационном равновесии, должны применяться два условия: (i) наблюдаемые спины ЯМР должны обладать различными химическими сдвигами в состояниях, подвергающихся конформационному обмену (микросостояниях) и (ii) обмен должен происходить в масштабе времени от ~ 50 мкс до ~ 10 мс. В этих условиях наблюдаемая поперечная скорость релаксации ( figure-introduction-1 ) представляет величину внутреннегоR2 (R2, измеренного при отсутствии динамики мкс-мс) и обменного вклада в figure-introduction-2 поперечную релаксацию (Rex). Вклад Rex в R2obs можетбытьпостепенно гаситься путем уменьшения расстояния между импульсами 180°, составляющими блок CPMG последовательности импульсов, а результирующие кривые RD могут быть смоделировано с использованием теории Блоха-Макконнелла для получения разницы химических сдвигов между микросостояниями, дробной популяции каждого микросостояния и скоростей обмена между микросостояниями(Рисунок 1)1,2,3.

Несколько различных последовательностей импульсов и протоколов анализа были описаны в литературе для экспериментов с 15N CPMG. При этом описан протокол, реализованный в лаборатории. В частности, будут представлены важнейшие этапы подготовки образца ЯМР, настройки и получения ЯМР-экспериментов, а также обработки и анализа данных ЯМР(рисунок 2). Чтобы облегчить передачу протокола в другие лаборатории, импульсная программа, сценарии обработки и анализа, а также один пример набора данных предоставляются в виде дополнительных файлов и доступны для загрузки по адресу (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html). Предоставленная импульсная последовательность включает в себя четырехступенчатый фазовый цикл в блоке CPMG для подавления смещенно-зависимых артефактов6 и кодируется для получения нескольких чередующихся экспериментов. Эти чередующиеся эксперименты имеют идентичный период релаксации, но разное количество перефокусировки импульсов для достижения различных полей CPMG7. Также важно отметить, что описанная импульсная программа измеряет 15N R2 компонента TROSY ЯМР-сигнала8. В целом, протокол успешно применяется для характеристики конформационного обмена в белках среднего и крупного размера4,5,9,10. Для небольших систем (<20 кДа) целесообразно использовать гетероядерную последовательность импульсов11, 12наоснове гетеронуклеарной одноквантуковой когерентности (HSQC).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка образца ЯМР

  1. Экспрессируйте и очистите 2H,15N-лаблед образец интересуемого белка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как образец белка с маркировкой 15N может быть использован для получения эксперимента CPMG RD, пердеутерация (где это возможно) резко повышает качество полученных данных. Протоколы получения пердевтерированных белков имеются в литературе13.
  2. Буферный обмен очищенного образца белка на дегазированный буфер ЯМР.
  3. Перенесите образец ЯМР в ЯМР-трубку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация образца ЯМР должна быть тщательно оптимизирована, чтобы максимизировать отношение сигнал/шум и свести к минимуму возникновение белково-белковых взаимодействий. В целом, типичный диапазон концентраций для экспериментов CPMG составляет 0,1-1,0 мМ.

2. Первая настройка ЯМР-эксперимента

  1. Загрузите и распакуйте дополнительные файлы.
  2. Скопируйте файлы bits.vv и trosy_15N_cpmg.vv (расположенные в папке pulseprogram) в каталог пульсовой программы (
  3. Откройте программное обеспечение для сбора и скопируйте ранеезапущенный экспериментH-15N HSQC в новый эксперимент с помощью команды edc.
  4. С помощью команды pulprogзагрузите импульсную программу trosy_15N_cpmg.vv во вновь созданный эксперимент.
  5. Настройте эксперимент CPMG, используя инструкции, приведенные в конце файла импульсной программы (trosy_15N_cpmg.vv).

3. Рутинная настройка ЯМР-эксперимента

  1. Введите образец в магнит и выполните все основные этапы для получения любого ЯМР-эксперимента: зафиксируйте и проведите прокладку образца; сопоставьте и настройте каналы 1H и 15N.
  2. Установите p1 и p7 на длительность 1H и 15N жестких импульсов 90° соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения оптимальных результатов важно с большой осторожностью калибровать импульс 15Н 90°. Калибровка обычно выполняется с использованием образца 100 мМ из 15N-меченой мочевины в ДМСО, как описано в руководстве по спектрометру. Кроме того, можно дважды проверить калибровку непосредственно на рабочем образце ЯМР, получив первый приращение спектра H-15N HSQC, в котором импульс 15N 90° первого блока INEPT переключается на импульс 180°. Если калибровка верна, необходимо получить значение null.
  3. В окне сбора задайте центральную и спектральную ширину для измерений 1H и 15N.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Центр спектра 1 H на частоте сигнала водыдля оптимального подавления воды.
  4. Установите задержку релаксации (d30), равную0,7 Т2,гдеТ2 — ожидаемое поперечное время релаксации вашего белка 15Н.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Значение d30 может быть оптимизировано эмпирически для получения наилучших результатов.
  5. Используйте команду vclist для создания списка целых чисел, соответствующих параметру n на рисунках 1A и 1B. Убедитесь, что каждая запись в списке соответствует отдельному полю CPMG (νcpmg)в соответствии с νcpmg = 4 x n / d30. Убедитесь, что первое число в списке — 0 (это соответствует эталону эксперимента, для которого блок CPMG пропущен и d30 = 0 с) и не используйте числа больше 1000 x d30 / 4. Числа, превышающие это пороговое значение, приводят к тому, что νcpmg > 1 кГц и могут повредить зонд.
  6. Установите l8 на число записей в vclist, l3 на число вещественных точек для косвенной размерности (обычно для l3 устанавливается диапазон 64-200), а 1 td равен l8 x l3 x 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги 3.7-3.11 для оптимизации подавления воды.
  7. Установите коэффициент усиления приемника (rg) на 1; откройте файл программы pulse (edcpul), перейдите к строке 91, удалите точку с запятой, предшествующую goto 999,и сохраните файл.
  8. С помощью команды gs настройте параметры spdb0 (или spdw0) для минимизации интенсивности FID-сигнала.
  9. Повторно вставьте точку с запятой в строке 91 файла программы pulse и сохраните файл.
  10. Повторите шаги 3.7-3.9 для оптимизации spdb11 (строка 168 файла импульсной программы), spdb2 (строка 179 файла импульсной программы) и pldb2 (строка 184 файла импульсной программы).
  11. Выполните команду rga, чтобы оптимизировать коэффициент усиления приемника.
  12. Установите число сканирований(ns)кратное 8.
  13. Выполните команду zg, чтобы начать эксперимент.

4. Обработка и анализ данных ЯМР

  1. Скопируйте папку с именем Process (Дополнительные файлы) в каталог, содержащий файл ser.
  2. Используйте файлы sep_fid.com и ft2D.com для обработки данных ЯМР.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инструкция по редактированию сценариев обработки приведена в sep_fid.com и ft2D.com файлах.
  3. Откройте файлы UCSF, содержащиеся в каталоге, CPMG_Sparky_files в Sparky.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Файлы ucsf создаются скриптами обработки. Для каждой записи в vclist имеется один файл ucsf. Первый файл UCSF (test_1.ucsf) содержит эталонный эксперимент. Последующие файлы UCSF (test_2.ucsf, test_3.ucsf,... test_n.ucsf) упорядочены от самого низкого до наибольшего значения νcpmg.
  4. Выберите перекрестные пики ЯМР в эталонном спектре ЯМР (test_1.ucsf).
  5. Выделите все выбранные перекрестные пики с помощью команды Sparky pa.
  6. Выполните команду Sparky rh. Эта команда открывает диалоговое окно. Выберите параметр высоты в одном и том же положении в каждом спектре. Нажмите «Настройка» и проверьте все спектры ЯМР. Нажмите «Обновить» и сохраните выходной файл в рабочем каталоге. Выходной файл содержит матрицу интенсивности сигнала по всем открытым спектрам ЯМР.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более точные протоколы, которые используют подгонку формы линии для восстановления интенсивностей из чередующихся псевдо-3D-экспериментов, были описаны в литературе14. Свободно доступное программное обеспечение для подгонки линейных изобразов доступно по адресу https://pint-nmr.github.io/PINT/ (PINT), https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/fuda/ (FUDA), а также в NMRPipe (модуль nLinLS) и SPARKY (ИТ-модуль).
  7. Для каждого поля CPMG преобразуйте интенсивность сигнала в скоростиR2, используя формулу figure-protocol-1 , где I0 и Id30 — интенсивность эталонного (vc = 0) и расслабленного (vc > 0) ЯМР-спектров соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнительных файлахприведен шаблон файла электронной таблицы (R2_calc.xls), используемого для преобразования интенсивности сигнала в скоростиR2 и визуализации профилей RD.
  8. Считайте уровень шума в опорном спектре с помощью команды Sparky st и распространяйте ошибку на скорости R2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнительных файлахприведен шаблон файла электронной таблицы (R2_calc.xls), используемого для распространения ошибки на измеренные скоростиR2.

5. Подгонка кривых RD

  1. Скопируйте папку с именем RD_fitting (Дополнительные файлы) в рабочий каталог.
  2. Для каждого назначенного пика ЯМР оцените Rex путем вычисления figure-protocol-2 . и figure-protocol-3 figure-protocol-4 являются скоростиR2, измеренные при самом низком и самом высоком νcpmg в vclist.
  3. Визуально проверьте кривые RD с Rex, превышая в два раза предполагаемую погрешность, и отбросьте все кривые RD, которые слишком шумные для точного моделирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шум на Rex может распространяться от ошибок на figure-protocol-5 и figure-protocol-6 .
  4. Подготовьте входной файл для сценария подгонки, используя все кривые RD с Rex, превышающих в два раза предполагаемую ошибку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная инструкция по подготовке входных файлов приведена в скриптах примерки. Примеры входных файлов предоставляются в виде дополнительных файлов. Обычно данные RD измеряются в двух разных статических полях и подгоняются одновременно. В этом протоколе требуются два разных входных файла(Дополнительные файлы).
  5. Подгонка данных RD с помощью сценариев, предоставленных в дополнительных файлах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для выполнения остаточного или глобального соответствия кривых RD предоставляются два различных сценария соответственно. Оба скрипта соответствуют кривым RD с использованием модели обмена двумя сайтами и уравнения Карвера-Ричардса. Более подробные инструкции приведены в скриптах примерки. Дополнительные программные пакеты, такие как Chemex (https://github.com/gbouvignies/ChemEx) и CATIA (https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/catia/), доступны для выполнения подгонки данных с использованием уравнений Блока-Макконнелла.
  6. Проверьте надежность установленных параметров, оценив редуцированную χ2 как функцию pb и kex.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Уменьшенный χ2 указан в выходном файле. pb и kex могут быть ограничены конкретными значениями с использованием нижней и верхней границ в процедурах установки. В наших сценариях нижней и верхней границами для pb являются lb(2) и ub(2) соответственно. Нижняя и верхняя границы для kex — lb(3) и ub(3) соответственно.
  7. Оцените погрешность по установленным параметрам. Это можно сделать, установив значение MC_fac в скрипте в 1 и повторив подгонку несколько раз (обычно >20 повторов). Погрешность по каждому параметру оценивается как стандартное отклонение распределения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Установка MC_fac на 1 генерирует синтетический набор данных, в котором к экспериментальным данным добавляется распределенная ошибка Гаусса (рассчитанная на основе экспериментальной ошибки).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Протокол, описанный здесь, приводит к получению профилей RD для каждого пика в спектре 1H-15N TROSY(рисунок 3A). По полученным профилям RD можно оценить обменный вклад в поперечную релаксацию 15Н каждой амидной группы позвоночника(рис. 3А,3В). Построив Rex на 3D-структуре исследуемого белка, можно идентифицировать структурные области, подвергающиеся конформационному обмену по шкале времени μs-ms

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В данной рукописи описан реализованный в лаборатории протокол для сбора и анализа 15N RD данных о белках. В частности, рассматриваются важнейшие этапы подготовки образца ЯМР, измерения данных ЯМР и анализа профилей РД. Ниже обсуждаются некоторые важные аспекты, касающиеся приобретения и анализа экспериментов RD. Однако для более глубокого описания эксперимента и анализа данных, тщательного изучения оригинальной литературы настоятельно рекомендуется3,8,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Все авторы прочитали и одобрили рукопись. Мы заявляем об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана средствами NIGMS R35GM133488 и благотворительного фонда Роя Дж.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
КриозондBruker5mm TCI 800 H-C/N-D криозондПовышение чувствительности
Оксид дейтерияSigma Aldrich756822-1>99,8% чистоты, используется при подготовке образцов ЯМР и дейтерированных культур
Центрифуга с ручным приводомUnited ScientificSupply CENTFG1Используется для удаления любых пузырьков воздуха или остаточной жидкости, застрявших на стенках ЯМР-трубки.
Высокопольный ЯМР-спектрометрBrukerBruker Avance II 600, Bruker Avance 800Получение данных ЯМР
MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/products/get-matlab.htmlМоделирование данных ЯМР ЯМР
Пастер ПипеткаCorning Incorporation7095D-NMRPyrex стеклянная пастуерная пипетка для переноса жидкого образца в ЯМР-пробирку
ЯМР пробиркаWillmad Precision535-PP-75 мм тонкостенная 7'' цилиндрическая стеклянная трубка
NMRPipeИнститут бионаук и биотехнологических исследованийhttps://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.htmlобработки данных ЯМР
SPARKYКалифорнийский университет, Сан-Францискоhttps://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/Анализ данных ЯМР
Tospin 3.2 (или новее)BrukerПрограммное обеспечение длясбора https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html

Ссылки

  1. Anthis, N. J., Clore, G. M. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).
  2. Lisi, G. P., Loria, J. P. Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery. Chemical Reviews. 116 (11), 6323-6369 (2016).
  3. Mittermaier, A., Kay, L. E. New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics. Science. 312 (5771), 224-228 (2006).
  4. Venditti, V., Clore, G. M. Conformational selection and substrate binding regulate the monomer/dimer equilibrium of the C-terminal domain of Escherichia coli enzyme I. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26989-26998 (2012).
  5. Venditti, V., et al. Large interdomain rearrangement triggered by suppression of micro- to millisecond dynamics in bacterial Enzyme I. Nature Communications. 6, 5960(2015).
  6. Yip, G. N., Zuiderweg, E. R. A phase cycle scheme that significantly suppresses offset-dependent artifacts in the R2-CPMG 15N relaxation experiment. Journal of Magnetic Resonance. 171 (1), 25-36 (2004).
  7. Mulder, F. A., Skrynnikov, N. R., Hon, B., Dahlquist, F. W., Kay, L. E. Measurement of slow (micros-ms) time scale dynamics in protein side chains by (15)N relaxation dispersion NMR spectroscopy: application to Asn and Gln residues in a cavity mutant of T4 lysozyme. Journal of the American Chemical Society. 123 (5), 967-975 (2001).
  8. Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. 3rd A TROSY CPMG sequence for characterizing chemical exchange in large proteins. Journal of Biomolecular NMR. 15 (2), 151-155 (1999).
  9. Dotas, R. R., et al. Hybrid thermophilic/mesophilic enzymes reveal a role for conformational disorder in regulation of bacterial Enzyme I. Journal of Molecular Biology. 432 (16), 4481-4498 (2020).
  10. Purslow, J. A., et al. Active site breathing of human Alkbh5 revealed by solution NMR and accelerated molecular dynamics. Biophysical Journal. 115, 1895-1905 (2018).
  11. Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. 3rd A relaxation-compensated Carr−Purcell−Meiboom−Gill sequence for characterizing chemical exchange by NMR Spectroscopy. Journal of the American Chemical Society. 121 (10), 2331-2332 (1999).
  12. Hansen, D. F., Vallurupalli, P., Kay, L. E. An improved 15N relaxation dispersion experiment for the measurement of millisecond time-scale dynamics in proteins. Journal of Physical Chemistry B. 112 (19), 5898-5904 (2008).
  13. Tugarinov, V., Kanelis, V., Kay, L. E. Isotope labeling strategies for the study of high-molecular-weight proteins by solution NMR spectroscopy. Nature Protocols. 1 (2), 749-754 (2006).
  14. Niklasson, M., et al. Comprehensive analysis of NMR data using advanced line shape fitting. Journal of Biomolecular NMR. 69, 93-99 (2017).
  15. Palmer, A. G. 3rd, Kroenke, C. D., Loria, J. P. Nuclear magnetic resonance methods for quantifying microsecond-to-millisecond motions in biological macromolecules. Methods in Enzymology. 339, 204-238 (2001).
  16. Tollinger, M., Skrynnikov, N. R., Mulder, F. A., Forman-Kay, J. D., Kay, L. E. Slow dynamics in folded and unfolded states of an SH3 domain. Journal of the American Chemical Society. 123, 11341-11352 (2001).
  17. Carver, J. P., Richards, R. E. A general two-site solution for the chemical exchange produced dependence of T2 upon the Carr-Purcell pulse separation. Journal of Magnetic Resonance. 6 (1), 89-105 (1972).
  18. Egner, T. K., et al. Surface Contrast' NMR Reveals Non-innocent Role of Support in Pd/CeO2 Catalyzed Phenol Hydrogenation. ChemCatChem. 12 (6), 4160-4166 (2020).
  19. Egner, T. K., Naik, P., Nelson, N. C., Slowing, I. I., Venditti, V. Mechanistic Insight into Nanoparticle Surface Adsorption by Solution NMR Spectroscopy in an Aqueous Gel. Angewandte Chemie (International Edition in English). 56, 9802-9806 (2017).
  20. Tugarinov, V., Libich, D. S., Meyer, V., Roche, J., Clore, G. M. The energetics of a three-state protein folding system probed by high-pressure relaxation dispersion NMR spectroscopy. Angewandte Chemie (International Edition in English). 54, 11157-11161 (2015).
  21. Korzhnev, D. M., Kloiber, K., Kanelis, V., Tugarinov, V., Kay, L. E. Probing slow dynamics in high molecular weight proteins by methyl-TROSY NMR spectroscopy: application to a 723-residue enzyme. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3964-3973 (2004).
  22. Mayzel, M., Ahlner, A., Lundstrom, P., Orekhov, V. Y. Measurement of protein backbone (13)CO and (15)N relaxation dispersion at high resolution. Journal of Biomolecular NMR. 69, 1-12 (2017).
  23. Pritchard, R. B., Hansen, D. F. Characterising side chains in large proteins by protonless (13)C-detected NMR spectroscopy. Nature Communications. 10, 1747(2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

ЯМР в раствореЯМР на ядрах азота-15конформационный обменкинетические параметрытермодинамические параметрыструктурная биологияферментативный катализ
15 15 N CPMG Релаксационная дисперсия для исследования конформационной динамики белка на шкале времени мкс-мс
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.