Здесь приведено подробное описание реализованного в лаборатории протокола для сбора и анализа профилей релаксационной дисперсии 15Н методом ямР-спектроскопии раствора.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
15 15 N CPMG Релаксационная дисперсия для исследования конформационной динамики белка на шкале времени мкс-мс
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Конформационная динамика белка играет фундаментальную роль в регуляции ферментативного катализа, связывания лигандов, аллостерии и сигнализации, которые являются важными биологическими процессами. Понимание того, как баланс между структурой и динамикой управляет биологической функцией, является новым рубежом в современной структурной биологии и привело к нескольким техническим и методологическим разработкам. Среди них методы ЯМР релаксационного дисперсионного раствора CPMG предоставляют уникальную информацию с атомным разрешением о структуре, кинетике и термодинамике конформационных равновесий белка, возникающих на шкале мкс-мс времени. Здесь в исследовании представлены подробные протоколы для получения и анализа эксперимента по дисперсии релаксации 15Н. В качестве примера показан конвейер для анализа динамики мкс-мс в С-концевом домене бактерий Enzyme I.
Введение
Эксперименты Карра-Перселла Мейбума-Гилла (CPMG) по релаксационной дисперсии (RD) используются на рутинной основе для характеристики конформационных равновесий, возникающих на временной шкале μs-ms с помощью растворной ЯМР-спектроскопии1,2,3,4,5. По сравнению с другими методами исследования конформационной динамики, методы CPMG относительно просты в реализации на современных ЯМР-спектрометрах, не требуют специализированных этапов подготовки образцов (т.е. кристаллизаци....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка образца ЯМР
- Экспрессируйте и очистите 2H,15N-лаблед образец интересуемого белка.
ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как образец белка с маркировкой 15N может быть использован для получения эксперимента CPMG RD, пердеутерация (где это возможно) резко повышает качество полученных данных. Протоколы получения пердевтерированных белков имеются в литературе13. - Буферный обмен очищенного образца белка на дегазированный буфер ЯМР.
- Перенесите образец ЯМР в ЯМР-трубку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация образца ЯМР должна быть тщательно оптимизирована, чтобы максимизировать отношение сигнал/шум ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Протокол, описанный здесь, приводит к получению профилей RD для каждого пика в спектре 1H-15N TROSY(рисунок 3A). По полученным профилям RD можно оценить обменный вклад в поперечную релаксацию 15Н каждой амидной группы позвоночника(рис. 3А,3В). Построив Rex на 3D-структуре исследуемого белка, можно идентифицировать структурные области, подвергающиеся конформационному обмену по шкале времени μs-ms
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В данной рукописи описан реализованный в лаборатории протокол для сбора и анализа 15N RD данных о белках. В частности, рассматриваются важнейшие этапы подготовки образца ЯМР, измерения данных ЯМР и анализа профилей РД. Ниже обсуждаются некоторые важные аспекты, касающиеся приобретения и анализа экспериментов RD. Однако для более глубокого описания эксперимента и анализа данных, тщательного изучения оригинальной литературы настоятельно рекомендуется3,8,.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Все авторы прочитали и одобрили рукопись. Мы заявляем об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана средствами NIGMS R35GM133488 и благотворительного фонда Роя Дж.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Криозонд | Bruker | 5mm TCI 800 H-C/N-D криозонд | Повышение чувствительности |
| Оксид дейтерия | Sigma Aldrich | 756822-1 | >99,8% чистоты, используется при подготовке образцов ЯМР и дейтерированных культур |
| Центрифуга с ручным приводом | United Scientific | Supply CENTFG1 | Используется для удаления любых пузырьков воздуха или остаточной жидкости, застрявших на стенках ЯМР-трубки. |
| Высокопольный ЯМР-спектрометр | Bruker | Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800 | Получение данных ЯМР |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Моделирование данных ЯМР ЯМР |
| Пастер Пипетка | Corning Incorporation | 7095D-NMR | Pyrex стеклянная пастуерная пипетка для переноса жидкого образца в ЯМР-пробирку |
| ЯМР пробирка | Willmad Precision | 535-PP-7 | 5 мм тонкостенная 7'' цилиндрическая стеклянная трубка |
| NMRPipe | Институт бионаук и биотехнологических исследований | https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html | обработки данных ЯМР |
| SPARKY | Калифорнийский университет, Сан-Франциско | https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ | Анализ данных ЯМР |
| Tospin 3.2 (или новее) | Bruker | Программное обеспечение для | сбора https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html |
Ссылки
- Anthis, N. J., Clore, G. M. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).
- Lisi, G. P., Loria, J. P. Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery. Chemical Reviews. 116 (11)....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
