Быстрое тестирование чувствительности к противомикробным препаратам методом стимулированной рамановской рассеянной визуализации включения дейтерия в одну бактерию

Устойчивость к противомикробным препаратам (УПП) представляет собой растущую глобальную угрозу для эффективного лечения инфекционных заболеваний¹. Прогнозируется, что УПП приведет к дополнительным 10 миллионам смертей в год и потере мирового ВВП в размере 100 триллионов долларов к 2050 году, если не будут приняты меры по борьбе с устойчивыми к антибиотикам бактериями ^1,2. Это подчеркивает настоятельную необходимость в быстрых и инновационных методах диагностики для тестирования чувствительности к антибиотикам (АСТ) инфекционных бактерий, чтобы замедлить появление устойчивых к антибиотикам бактерий и снизить связанный с этим уровень смертности³. Чтобы обеспечить наилучший возможный клинический результат, крайне важно ввести эффективную терапию в течение 24 ч. Однако современный метод золотого стандарта, такой как диффузия диска или метод разбавления бульона, обычно требует не менее 24 ч для процедуры предварительной инкубации для клинических образцов и дополнительных 16-24 ч для получения результатов минимальной ингибирующей концентрации (MIC). В целом, эти методы отнимают слишком много времени, чтобы направлять немедленное решение о лечении инфекционных заболеваний в клинике, что приводит к появлению и распространению устойчивости к противомикробным препаратам⁴.

Генотипические методы АСТ, такие как методы полимеразной цепной реакции (ПЦР)⁵, были разработаны для быстрого обнаружения. Такие методы измеряют специфические генетические последовательности резистентности, чтобы обеспечить быстрые результаты АСТ. Они не полагаются на трудоемкую клеточную культуру; однако тестируются только конкретные известные генетические последовательности с резистентностью. Поэтому его применение ограничивается различными видами бактерий или различными механизмами резистентности. Кроме того, они не могут предоставить результаты MIC для решений^{терапии 6,7}. Кроме того, для преодоления этих ограничений разрабатываются новые фенотипические методы быстрого АСТ⁸, в том числе микрофлюидные устройства ^{9,10,11,12,13}, оптические приборы 14,15,16, фенотипические АСТ, количественно оценивающие число копий нуклеиновых кислот ^17,18, и рамановские спектроскопические методы^19, 20,21,22,23,24. Эти методы сокращают время для получения результатов АСТ, однако большинство из них применимы только к бактериальным изолятам, а не непосредственно к клиническим образцам, и по-прежнему требуют длительной преинкубации.

В данной работе представлен метод быстрого определения восприимчивости бактерий в моче и цельной крови посредством мониторинга клеточной метаболической активности методом SRS-визуализации. Вода (_H2O) принимает участие в подавляющем большинстве основных процессов биомолекулярного синтеза в живых клетках. В качестве изотополога воды, посредством катализируемой ферментами реакции обмена H/D между окислительно-восстановительным активным атомом водорода в NADPH и атомом D в_D2O, дейтерий может быть включен в биомассу внутри ячейки^25,26. Реакция синтеза дейтерированных жирных кислот опосредована дейтерием, меченым NADPH. Включение_D2O в реакции аминокислот (АА) приводит к получению дейтерированного белка²⁶ (фиг.1). Таким образом, вновь синтезированные биомолекулы, содержащие связь C-D, в отдельных микробных клетках могут быть использованы в качестве общего маркера метаболической активности для обнаружения. Для считывания de novo синтезированных C-D связей рамановская спектроскопия, универсальный аналитический инструмент, предоставляющий специфическую и количественную химическую информацию биомолекул, широко используется для определения чувствительности к противомикробным препаратам и значительно сокращает время тестирования до нескольких часов 27,28,29,30 . Однако из-за присущей ему низкой эффективности процесса рамановского рассеяния спонтанная рамановская спектроскопия обладает низкой чувствительностью обнаружения. Поэтому трудно получить результаты изображения в режиме реального времени с помощью спонтанной рамановской спектроскопии. Когерентное рамановское рассеяние (CRS), включая когерентное анти-Стоксовское рамановское рассеяние (CARS) и стимулированное рамановское рассеяние (SRS), достигло высокой чувствительности обнаружения из-за когерентного светового поля, генерирующего порядки величины больше, чем у спонтанной рамановской спектроскопии, тем самым обеспечивая высокоскоростную, специфическую и количественную химическую визуализацию на уровне одной клетки ^{31,32,33,34,35 ,}36,37,38,39.

Здесь, основываясь на нашей последней работе⁴⁰, мы представляем протокол для быстрого определения метаболической активности и чувствительности к противомикробным препаратам путем фемтосекундной визуализации SRS C-D включения D₂O бактерий в нормальную среду, мочу и цельную среду крови на уровне одной клетки. Фемтосекундная визуализация SRS облегчает мониторинг концентрации инактивации внутриклеточного метаболизма (SC-MIC) против антибиотиков на уровне одной бактерии в течение 2,5 ч. Результаты SC-MIC подтверждаются стандартным тестом MIC путем микроразбавления бульона. Наш метод применим для определения антимикробной восприимчивости бактерий к инфекции мочевыводящих путей (ИМП) и инфекции кровотока (БСИ) возбудителей с значительно уменьшенным временем анализа по сравнению с обычным методом, что открывает возможность быстрого фенотипического АСТ в клинике на одноклеточном уровне.

Использование образцов крови человека соответствует руководящим принципам IRB Бостонского университета и Национальных институтов здравоохранения (NIH). В частности, образцы взяты из банка и полностью деидентифицированы. Эти образцы не считаются человеческими субъектами офисом институционального наблюдательного совета (IRB) в Бостонском университете.

1. Приготовление раствора бактерий и антибиотиков

1. Готовят раствор антибиотиков (гентамицина сульфата или амоксициллина) в концентрации 1 мг/мл, растворенный в стерильном 1x фосфат-буферном физиологическом растворе (PBS) или диметилсульфоксиде (DMSO) в микропробирках объемом 1,5 мл. Растворить гентамицина сульфат в стерильном растворе PBS и амоксициллин в стерильном растворителе DMSO. После этого храните раствор антибиотиков при температуре 2-8 °C, как предлагается.
2. Чтобы получить D₂O, содержащую катионную среду бульона Мюллера-Хинтона (MHB), добавьте 220 мг основания отвара MHB к 10 мл_D2O, чтобы получить 100%_D2O-содержащую среду. Стерилизуют раствор путем фильтрации фильтрами с размером пор 200 нм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте этот протокол для изготовления и стерилизации растворов среды на последующих этапах.
3. Чтобы подготовить бактериальные образцы для визуализации SRS, добавьте 2 мл нормальной среды MHB, которая не содержит дейтерия, в стерильную культуральную трубку с круглым дном, а затем предварительно прогрейте ее при 37 °C.
4. Используйте стерильную петлю, чтобы выбрать одну бактериальную (Escherichia coli BW 25113 или Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085) колонию из свежей культуры на триптической соевой агаровой пластине. Затем суспендируйте его в предварительной культуральной среде и осторожно вихрь, чтобы приготовить суспензию бактерий.
5. Инкубируйте бактерии при 37 °C в шейкере со скоростью 200 оборотов в минуту (об/мин) до тех пор, пока они не достигнут логарифмической фазы.

2. D₂O инкорпорированное лечение в присутствии антибиотиков (рисунок 2а)

1. Проверьте концентрацию бактерий, измерив оптическую плотность (OD) с помощью фотометра на длине волны 600 нм.
2. Разбавьте бактериальный раствор, используя нормальную среду MHB, которая не содержит дейтерия, чтобы достичь конечной концентрации клеток 8 х 10⁵ КОЕ/мл. Вихрь осторожно, чтобы смешать бактериальные клетки.
3. Готовят 300 мкл аликвот бактериального раствора в семи микропробирках по 1,5 мл и 600 мкл аликвот бактериального раствора в одной микропробирке объемом 1,5 мл.
4. Добавьте 4,8 мкл исходного раствора антибиотика (гентамицина или амоксициллина) (1 мг/мл) в микропробирку, содержащую 600 мкл бактериального раствора, чтобы получить конечную концентрацию антибиотика до 8 мкг/мл.
5. Возьмите 300 мкл раствора из 8 мкг/мл раствора бактерий, содержащего антибиотики, и добавьте еще 300 мкл бактериального раствора, чтобы получить двукратно разбавленный раствор антибиотика (4 мкг/мл), содержащий бактерии.
6. Повторяют двукратное последовательное разведение исследуемых антибиотиков, гентамицина или амоксициллина, до тех пор, пока не будет достигнута микропробирка с самой низкой концентрацией (0,25 мкг/мл), и выбросьте из пробирки 300 мкл. Как для гентамицина, так и для амоксициллина серийные концентрации варьируются от 0,25 мкг/мл до 8 мкг/мл.
   1. Оставьте один тюбик без антибиотиков для пустого контроля. Это будет положительный контроль для проверки метаболической активности бактерий без лечения антибиотиками, но с лечением_D2O.
   2. Оставьте один пробирок без антибиотиков и без_D2O для отрицательного контроля.
7. Инкубируют бактериальную аликвоту определенным антибиотиком (гентамицином или амоксициллином), содержащим MHB-среду, в течение 1 ч.
8. Во время инкубации готовят серийное разведение антибиотиков со 100%_D2O, содержащей среду с таким же градиентом концентрации антибиотиков, приготовленных на стадии 2.6. Как для гентамицина, так и для амоксициллина серийные концентрации варьируются от 0,25 мкг/мл до 8 мкг/мл.
9. После 1 ч лечения антибиотиками добавляют 700 мкл последовательно разбавленного антибиотика и 100%_D2O-содержащей MHB среды к 300 мкл бактерий, предварительно обработанных антибиотиками, в той же концентрации антибиотика (полученной на стадии 2.6), соответственно.
   1. Например, добавляют 700 мкл 100%_D2O-содержащей MHB среды (содержащей 8 мкг/мл антибиотика) к 300 мкл 8 мкг/мл бактерий, предварительно обработанных антибиотиками. Таким же образом перекладывают в соответствующие трубки следующую концентрацию, и гомогенизируют путем пипетки вверх и вниз несколько раз.
   2. Добавьте 700 мкл безантибиотиков 100%_D2O-содержащей MHB среды к 300 мкл бактерий без антибиотиков (приготовленных на стадии 2.6.1) в качестве пустого контроля.
   3. Инкубировать при 37 °C в инкубационном шейкере при 200 об/мин в течение дополнительных 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе конечная концентрация_D2Oв среде для испытания составляет 70%.
10. Сначала центрифугируют 1 мл антибиотика и_D2O-обработанного бактериальным образцом при 6200 х г в течение 5 мин при 4 °C, а затем дважды промывают очищенной водой. Наконец, зафиксируйте образцы в 10% растворе формалина и храните их при 4 °C.

3. Подготовка бактерий в мочевой среде (Рисунок 2б)

1. Чтобы приготовить E. coli BW 25113 на логарифмической фазе, выполните действия, описанные в пунктах 1.4 и 1.5.
2. Проверьте концентрацию бактерий, измерив OD фотометром на длине волны 600 нм.
3. Чтобы имитировать клинические образцы ИМП 14,18,41, увеличьте раствор E. coli в 10 мл деидентифицированной мочи, чтобы достичь конечной концентрации клеток 10 6 КОЕ/мл.
4. Отфильтруйте шипованную мочу E. coli с помощью фильтра 5 мкм, а затем разделите бактериальный раствор на 300 мкл аликвот на семь микропробирок 1,5 мл и 600 мкл аликвот бактериального раствора в одной микропробирке 1,5 мл.
5. Проводят инкорпорацию_D2Oв присутствии антибиотиков и забор образцов, как описано в предыдущих шагах от 2.4 до 2.10.

4. Подготовка бактерий в среде крови (рисунок 2с)

1. Чтобы приготовить Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 на логарифмической фазе, выполните действия 1.4 и 1.5.
2. Для имитации клинических инфекций кровотока образцы ^42,43, всплеск P. aeruginosa в 1 мл деидентифицированной крови человека достигает концентрации 10 7 КОЕ/мл.
3. Добавьте 9 мл стерильной очищенной воды для лизирования крови.
4. Фильтруйте P. aeruginosa с шипованной кровью с помощью фильтра 5 мкм. Затем собирают бактерии до объема 1 мл путем центрифугирования при 6200 х г в течение 5 мин при 4 °C.  Добавьте 9 мл предварительно подогретого нормального MHB в раствор бактерий и осторожно вихрь. Конечная концентрация бактерий составляет 10⁶ КОЕ/мл
5. Разделите шипованный раствор крови P. aeruginosa на 300 мкл аликвот на семь микропробирок по 1,5 мл и 600 мкл аликвот бактериального раствора в одной микропробирке объемом 1,5 мл.
6. Проводят инкорпорацию_D2Oв присутствии антибиотиков и забор образцов, как описано в предыдущих шагах от 2.4 до 2.10.

5. SRS-визуализация метаболического включения_D2O в одну бактерию

1. Промыть 1 мл неподвижного раствора бактерий очищенной водой, а затем центрифугу при 6200 х г в течение 5 мин при 4 °C. Удалите супернатант. Обогатите бактериальный раствор примерно до 20 мкл.
2. Нанесите бактериальный раствор на покрытие с поли-L-лизином. Сэндвич и запечатывание образца для визуализации SRS.
3. Визуализируйте бактерии на вибрационной частоте C-D при 2168 ^см-1 с помощью микроскопа SRS.
   1. Введите и настройте длину волны насоса до 852 нм с помощью управляющего программного обеспечения на компьютере.
   2. Измерьте мощность лазера с помощью измерителя мощности. Установите мощность накачки лазера в образце на ~8 мВт, а мощность лазера Стокса на образце на ~40 мВт, отрегулировав полуволновую пластину перед выходом лазера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В микроскопе SRS перестраиваемый фемтосекундный лазер с частотой повторения 80 МГц обеспечивает возбуждение накачки (от 680 до 1300 нм) и Стокса (1045 нм).
4. Регулируя винты зеркал отражения, пространственно выровняйте накачку и лучи Стокса и направьте два луча в вертикальный микроскоп, оснащенный зеркальной системой 2D galvo для лазерного сканирования.
   1. Используйте 60-кратный объектив погружения в воду, чтобы сфокусировать насос и лазеры Стокса на образце.
   2. Используйте масляный конденсатор для сбора сигналов от образца в прямом направлении.
   3. Используйте полосовой фильтр, чтобы отфильтровать лазер Стокса, прежде чем направить его в фотодиод.
   4. Извлеките стимулированный рамановский сигнал с помощью блокирующего усилителя и определите сигналы с помощью фотодиода.
5. Установите каждое изображение SRS на содержание 200 x 200 пикселей и время ожидания пикселя для 30 мкс на панели управления программного обеспечения. Общее время получения одного изображения составляет ~1,2 с. Установите размер шага на 150 нм, чтобы размер изображения составлял около 30 x 30^мкм2. Изображение не менее трех полей представлений для каждого образца.

6. Обработка изображений и анализ данных (рисунок 3)

1. Чтобы получить среднюю интенсивность сигнала C-D, открывайте и обрабатывайте изображения SRS с помощью программного обеспечения ImageJ.
2. Сначала преобразуйте изображения SRS в изображения 8-битного типа с перевернутым цветом, щелкнув Изображение | Тип | 8-разрядный, а затем Изменить | Инвертируйте кнопки в программном обеспечении ImageJ.
3. Затем отфильтруйте изображения с помощью размытия Гаусса, щелкнув Обработать | фильтры | Гауссовские кнопки размытия и установите для параметра Sigma (Радиус) значение 1.
4. Используйте настройку порога изображения, чтобы выбрать бактериальную область. Нажмите | изображений Отрегулируйте | Пороговое значение для обеспечения того, чтобы выбранные размеры бактерий соответствовали размерам на исходных изображениях SRS. Устраните мелкие частицы, отрегулировав порог размера для определения частиц. Нажмите кнопку Применить.
5. Применение | анализа Кнопки анализа частиц для маркировки и определения площади бактерий.
6. Нажав кнопку «Показать все» в менеджере ROI на исходное необработанное изображение SRS, пометьте ту же область бактерий, определите среднюю интенсивность каждой точки данных, нажав кнопку «Измерить» в диспетчере ROI.
7. Обведите область фона на исходном изображении SRS и измерьте среднюю интенсивность фона. Среднюю интенсивность C-D каждой бактерии получают путем вычета интенсивности фонового сигнала.

7. Количественное определение чувствительности к противомикробным препаратам с помощью SC-MIC

ПРИМЕЧАНИЕ: Пороговое значение на уровне 0,60 для определения SC-MIC установлено в соответствии со статистическим анализом интенсивностей SRS C-D условий активности метаболизма и ингибирования метаболизма для бактерий при различных концентрациях лекарственного воздействия⁴⁰. Интенсивность C-D для групп, чувствительных к антибиотикам, и устойчивых к антибиотикам, была снабжена нормальным распределением.

1. Постройте кривую рабочих характеристик приемника (ROC) и оцените порог отсечки на уровне 0,60. Исходя из этого порогового значения, SC-MIC как показатель эффективности антибиотиков может быть определен для определения метаболически неактивной и метаболически активной группы.
2. Чтобы количественно проанализировать данные визуализации SRS, постройте гистограммы интенсивности сигнала C-D для каждой группы бактерий, получавших последовательно разбавленную концентрацию антибиотиков. Цветные точки данных обозначают разные отдельные бактерии.
3. Нормализовать интенсивность С-D группы, получавшей антибиотики, до средней интенсивности контрольной группы без лечения антибиотиками. Определить результаты SC-MIC различных комбинаций бактерий и антибиотиков путем количественной оценки интенсивности сигнала SRS в области C-D по сравнению с различными концентрациями антибиотиков, используя пороговое значение 0,60.
4. Проверьте и сравните показания SC-MIC с показаниями MIC, определенными с использованием обычного анализа микроразбавления бульона.
5. По данным Института клинических и лабораторных стандартов (CLSI), категория восприимчивости, основанная на результатах метаболической визуализации SRS для каждого тестируемого бактериального штамма, интерпретируется как «восприимчивая», «резистентная» или «промежуточная».

Влияние инкубационного времени на инкорпорацию дейтерия измеряется спонтанной рамановской микроспектроскопией в области C-D (от 2070 до 2250 см-1) и C-H (от 2 800 до 3 100 см-1) (рисунок 4a). Покадровые одноклеточные рамановские спектры P. aeruginosa , культивируемые в среде, содержащей 70%D2O, показывают увеличение интенсивности CD/CH в течение времени инкубации от 0 до 180 мин. (Рисунок 4b) Увеличение содержания C-D в отдельных микробных клетках показывает, чтоD2Oвключен в дейтерированные биомолекулы внутри клетки.

МаркировкаD2O выше 50% существенно влияет на бактериальный метаболизм в течение 23 ч инкубационного периода27. Мы наблюдали ингибирование роста бактерий, когда концентрация маркировкиD2O превышает 70% в течение 25-часового инкубационного периода (рисунок S1). Мы выполнили MIC путем разбавления отвара золотого стандарта и получили результаты SC-MIC в двух штаммах P. aeruginosa (P. aeruginosa ATCC 47085 и P. aeruginosa 1133) (таблица S1). Наши текущие результаты показывают, что 70%D2O не влияет на производительность нашего метода у P. aeruginosa. Соответствие категории нашего метода SC-MIC с традиционным методом на основе культур составляет 100% для всех протестированных комбинаций P. aeruginosa и антибиотиков, как показано в таблице S1. Мы связываем это хорошее согласие с минимальной токсичностью 70% D2O на P. aeruginosa в течение 30-минутного инкубационного периода при определении SC-MIC.

Следуя протоколу, P. aeruginosa инкубировали с последовательно разбавленным гентамицином в течение 1 ч, а затем 70%D2Oв течение дополнительных 30 мин. Проводили метаболическую визуализацию SRS при ~2168 см-1 (рисунок 5a). Интенсивности C-D при лечении антибиотиками делятся на среднее значение контрольной группы, которая находится без лечения антибиотиками. Количественный статистический анализ (рисунок 5b) показал, что C-D сигналы P. aeruginosa были значительно ниже при концентрации гентамицина 2 мкг/мл или выше, чем без лечения гентамицином (0 мкг/мл). Используя порог отсечения при 0,60, P. aeruginosa метаболически ингибировали при 2 мкг/мл и более высоких концентрациях гентамицина. Пунктирная линия показывает определенное значение отсечения на уровне 0,60 на рисунке 5b. Таким образом, SC-MIC для P. aeruginosa против гентамицина в нормальной среде MHB был определен как 2 мкг/мл. Это значение SC-MIC проверяется как находящееся в пределах однократного диапазона разности с MIC (4 мкг/мл), определяемым методом микроразбавления бульона (рисунок 5c). Взятые вместе, SC-MIC, определенные нашей технологией, позволяют количественно оценить восприимчивость к противомикробным препаратам.

Чтобы изучить потенциал быстрого АСТ с помощью SRS-визуализации метаболического включения дейтерия для клинических применений, особенно для наиболее распространенной инфекции ИМП, мы протестировали образец мочи с шипами бактерий с использованием E. coli, наиболее распространенного патогена, вызывающего инфекцию ИМП44. Чтобы имитировать клинические образцы ИМП при относительной бактериальной концентрации, E. coli добавляют в деидентифицированную мочу до конечной концентрации 106 КОЕ/мл. После очистки образцов образцы мочи инкубировали с амоксициллином иD2O. Чистый фон на изображениях SRS показал, что протокол подготовки образца применим для быстрого измерения AST (рисунок 5d). SC-MIC для образца мочи с шипами E. coli против амоксициллина было определено как 4 мкг/мл (рисунок 5e), который имеет такое же считывание восприимчивости с MIC (8 мкг/мл) обычным методом разбавления бульона для чистой кишечной палочки в нормальной среде MHB (рисунок 5f). Эти результаты в совокупности показали, что быстрая визуализация АСТ с помощью SRS метаболического включения дейтерия имеет большой потенциал для клинической диагностики инфекционных патогенов ИМП.

По сравнению с инфекцией ИМП, быстрый АСТ для патогенов BSI гораздо сложнее для изучения in situ бактериальной метаболической активности, так как в крови присутствует много клеток крови. Чтобы исследовать применимость быстрого АСТ с помощью SRS-визуализации метаболического включения D2O для клинических образцов BSI, был обнаружен всплеск P. aeruginosa в деидентифицированной крови человека. Как показано на рисунке 5g, в интенсивности C-D изображения SRS при 2168 см-1 преобладали бактериальные сигналы. Поскольку эритроциты не обладают метаболической активностью для поглощенияD2O для дальнейшего биосинтеза, сигналы C-D возникли из метаболического дейтериевого включения живых бактерий. Кроссфазная модуляция или фототермический сигнал мусора или эритроцитов способствовали слабым фоновым сигналам, не влияя на количественный анализ SC-MIC. Результат SC-MIC для P. aeruginosa в крови был определен как 2 мкг/мл (рисунок 5h), что хорошо согласуется с обычным стандартным результатом MIC для P. aeruginosa в нормальной питательной среде (рисунок 5i). Взятые вместе, эти результаты показали, что метаболическая визуализация SRS метаболического включения дейтерия может быть быстрым методом АСТ для определения SC-MIC для бактерий при инфекциях BIS.

Рисунок 1: Схема включенияD2O в дейтерированные липиды и белки25,26. Дейтерий может быть включен в биомассу внутри клетки посредством катализируемой ферментами реакции обмена H/D между окислительно-активным атомом водорода в NADPH и атомом D вD2O. Реакция синтеза дейтерированных жирных кислот опосредована дейтерием, меченым NADPH. ВключениеD2O в реакции аминокислот приводит к образованию дейтерированных белков. Эта цифра была изменена по сравнению со ссылкой 40. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Рабочий процесс быстрого АСТ с помощью метаболической визуализации SRS дейтерия. (a)D2O инкорпорированное лечение в присутствии антибиотиков в среде MHB и следующие процедуры визуализации SRS. b) подготовка бактерий в среде мочи. c) подготовка бактерий в среде крови. Эта цифра была изменена по сравнению со ссылкой 40. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3. Автоматизированная обработка изображений и интерпретация данных. а) Необработанное изображение СГД. b) изображение после корректировки порога интенсивности для определения площади бактериальных клеток. с) точки данных, выбранные после этапа анализа частиц. d) на необработанном изображении выбираются соответствующие точки данных. e) результаты соответствующих точек данных на необработанном изображении. f) статистические результаты средней интенсивности точек данных после вычитания фона. Шкала: 10 мкм. Эта цифра была изменена по сравнению со ссылкой 40. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4. Влияние инкубационного времени на включение дейтерия в бактерии. а) покадровое измерение в области С-D (2070-2250 см-1) и С-Н (2 800-3 100 см-1) с помощью спонтанной рамановской микроспектроскопии (в среднем от 20 спектров). b) График гистограммы соотношения интенсивности CD/CH за время инкубацииD2O для бактерий в подпункте а). Каждая цветная точка обозначает измерение от одной бактерии. Полосы погрешностей представляют стандартную погрешность среднего значения (SEM). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5. Определение SC-MIC с использованием SRS-визуализации бактериальной метаболической инкорпорацииD2Oпротив антибиотиков в нормальной среде, моче и кровяной среде. (a) визуализация SRS при вибрации C-D (2168 см-1) и соответствующие изображения передачи P. aeruginosa в присутствииD2Oс добавлением последовательно разбавленного гентамицина в нормальной среде MHB. b) Количественный анализ интенсивности С-D СГД P. aeruginosa в подпункте а). Цветные точки данных в гистограмме обозначают различные отдельные бактерии. Пунктирная линия указывает на пороговое значение 0,60. с) сопоставление показаний SC-MIC с показаниями MIC методом микроразбавления бульона и категории восприимчивости для P. aeruginosa в соответствии с CLSI. d) визуализация SRS при вибрации C-D (2168 см-1) и соответствующие изображения передачи кишечной палочки в моче после инкубации вD2Oс последовательно разбавленным амоксициллином. е) Количественный анализ интенсивности С-D СГД в подпункте d). f) сопоставление показаний SC-MIC и категории восприимчивости для E. coli в нормальном MHB и в моче. g) визуализация SRS при вибрации C-D (2168 см-1) и соответствующие изображения передачи P. aeruginosa в крови после инкубации вD2Oс последовательно разбавленным гентамицином. h) Количественный анализ интенсивности С-D СГД в г). i) Сравнение считывания SC-MIC и категории восприимчивости для P. aeruginosa в нормальном MHB и в крови. S: чувствительный. Количество клеток N ≥ 10 на группу. Полосы погрешностей представляют собой SEM. Шкала: 10 мкм. Эта цифра была изменена по сравнению со ссылкой 40. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Таблица устранения неполадок.

Рисунок S1: Испытание токсичностиD2O на P. aeruginosa, культивируемой в среде Лаурии-Бертани (LB) с различными концентрациямиD2O. В строках ошибок указаны значения стандартного отклонения (количество измерений = 5). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот рисунок.

Таблица S1. Сравнение SC-MICs и MIC в нормальном MHB P. aeruginosa при лечении антибиотиками. S: чувствительный; R: устойчивый; I: Промежуточный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.