Автоматизированное обнаружение и анализ экзоцитоза

Конструкции VAMP-pHluorin или конструкции рецептора трансферрина (TfR)-pHuji являются отличными маркерами экзоцитарных событий, поскольку эти pH-чувствительные флуорофоры гасятся в просвете кислых езикул и флуоресцируют сразу после открытия пор слияния между везикулой и плазматической мембраной^1. После открытия пор синтеза флуоресценция распадается экспоненциально, с некоторой неоднородностью, которая раскрывает информацию о событии синтеза. Здесь описано приложение графического интерфейса пользователя (GUI), которое автоматически обнаруживает и анализирует экзоцитарные события. Это приложение позволяет пользователю автоматически обнаруживать экзоцитарные события, выявленные чувствительными к pH маркерами^2, и генерировать признаки из каждого события, которые могут быть использованы для целей классификации³ (рисунок 1A). Кроме того, описан анализ кластеризации экзоцитарных событий с использованием K-функции Рипли.

Автоматизированная классификация экзоцитарных событий в различные экзоцитарные режимы была недавно сообщена³. Два режима экзоцитоза, полное везикулярное слияние (FVF) и слияние поцелуев (KNR), ранее были описаны^4,5,6,7. Во время FVF пора слияния расширяется, и везикула включается в плазматическую мембрану. Во время KNR пора плавления временно открывается, а затем повторно засовывает^4,5,8,9,10. Четыре режима экзоцитоза были идентифицированы в развивающихся нейронах, два из которых связаны с FVF и два связаны с KNR. Эта работа демонстрирует, что как FVF, так и KNR могут быть дополнительно подразделены на события синтеза, которые немедленно переходят к флуоресцентному распаду (FVFi и KNRi) после открытия пор синтеза или экзоцитарным событиям, которые проявляют задержку после открытия пор синтеза до начала распада флуоресценции (FVFd и KNRd)(рисунок 1B). Классификатор определяет режим экзоцитоза для каждого события слияния. Здесь этот анализ был включен в графический интерфейс, который может быть установлен в MATLAB в операционных системах windows и Mac. Все файлы анализа можно найти по адресу https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing или
https://github.com/GuptonLab.

1. Выберите наборы данных и каталог

1. Чтобы выбрать наборы данных для анализа, нажмите кнопку Find Datasets (рисунок 2A,красное поле 1),чтобы перейти в папку, в которую депонируются данные (например, папка RawData). Файлы данных автоматически заполняют файлы данных в виде списка. В папке может быть несколько наборов данных.
2. Нажмите кнопку Выбрать каталог и выберите каталог (например, Test), в который будут депонироваться анализируемые файлы(рисунок 2A,красное поле 2). Набор папок и готовых файлов анализа, а также промежуточные временные образы будут созданы в этом каталоге при нажатии кнопки Анализ. Ошибки будут вытекать, если каталог не выбран.

2. Установите размер пикселя и частоту кадров

1. Заполните соответствующую частоту кадров и размер пикселя изображений в соответствующем поле «Частота кадров» или «Размер пикселя»(рисунок 2A,зеленое поле). Если значения не указаны (они установлены на «0» по умолчанию), то программа будет искать метаданные, связанные с файлом, на частоту кадров и размер пикселя. Если эти значения не могут быть найдены, программа по умолчанию будет использовать попиксель для измерения и для кадра для точек времени.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В приведенном примере частота кадров составляет 100, а размер пикселя — 0,08.

3. Выберите или сделайте маски

1. Используйте кнопку Mask Maker для автоматического создания масок ячеек для данных в списке наборов данных файлов(рисунок 2A,синий лист). При использовании кнопки Mask Maker будет создана новая папка в выбранном каталоге с именем MaskFiles. Индикатор «Пробежать» станет желтым во время бега и вернется к зеленому цвету после завершения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Маска для каждого файла в списке Файлы данных будет создана из первых 10 кадров файла изображения (или из всех кадров, если в файле изображения менее 10) и депонирована в папку MaskFiles с использованием правильной схемы именования (описанной ниже).
2. Убедитесь, что маски автоматически заполняют список Файлы масок. Пользователь может перейти непосредственно к анализу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда визуально проверяйте файлы масок и подтверждайте, что они захватывают всю интересуемую область. Первый кадр файла данных и файл маски отображаются в пользовательском интерфейсе при выборе. (Рисунок 2B). Mask Maker может выдавать ошибки в случае низкого уровня шума, поэтому проверка того, что файлы масок соответствуют, имеет решающее значение для контроля качества.
3. В качестве альтернативы использованию Mask Maker, если сигнал к шуму изображений недостаточен, создайте маски вручную в ImageJ.
   1. Сначала откройте файл необработанного изображения в ImageJ(рисунок 3A).
   2. Нажмите кнопку «Выделение полигонов» и нажмите, чтобы нарисовать маску вокруг ячейки. После завершения дважды щелкните последнюю точку, чтобы завершить полигон.
   3. После завершения перейдите в раздел Изменить | | выбора Создать маску (рисунок 3B). Новая перевернутая маска будет создана на основе полигональной чертежи. Сохраняйте маски в указанной папке MaskFiles в выбранном каталоге. Схема именования файлов маски должна соответствовать соответствующим отдельным файлам данных, за которыми следует «_mask_file». Например, если файл данных называется «VAMP2_488_WT_1.tif», соответствующий файл маски должен называться «VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif».
   4. Используйте кнопку Найти файлы масок для перехода к выбранной папке депонированных пользовательских файлов масок. Маски будут заполнять файлы масок в виде списка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно иметь маску для каждого файла данных перед запуском анализа.

4. Анализ и извлечение признаков

1. После того, как каталог выбран и список файлов данных и список файлов mask заполнены, нажмите кнопку Analysis (рисунок 4A). Если требуется классификация экзоцитарных событий, перейдите к шагу 5.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нажатие кнопки Анализ выполнит ряд автоматизированных задач по анализу данных. Он создаст отдельные папки в выбранном каталоге для депонирования проанализированных данных. Во время бега индикатор «пробега» изменится с зеленого на желтый(рисунок 4А,красное поле). После завершения анализа он изменится обратно на зеленый.
2. Найдите папку DataFiles(рисунок 4B)с полным набором файлов анализа (а также файлов извлечения объектов, которые будут использоваться в классификации позже), названных в соответствии с каждым файлом данных(рисунок 4C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Описание этих аналитических файлов приведено ниже в разделе «Репрезентативные результаты».

5. Классификация экзоцитарных событий

1. Чтобы выполнить одновременную классификацию экзоцитарных событий с автоматическим обнаружением, установите флажок Классификация перед нажатием кнопки Анализ. Для каждого экзоцитического события присвойте оценке вероятности от 0 до 1 для каждого класса. Экзоцитическое событие считается классифицированным как один из четырех классов, если оценка вероятности для этого класса составляет > 0,5.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения анализа в выбранном каталоге появится новая папка с файлами данных. Папка будет содержать файлы анализа, соответствующие каждому файлу изображения.

6. Пространственно-временный анализ экзоцитоза с использованием значений K Рипли

1. Создайте отдельный файл маски «нейрит» и «сома». Во-первых, сегментируйте сому от нейрита. Не существует непредвзятого метода сегментации сомы от нейритов, поэтому пользователь должен быть ослеплен экспериментом по обусловливаниям и использовать наилучшее суждение; предлагается эллипсоид без явных расширений нейритов.
2. Открыть ImageJ/Фиджи.
3. Перетащите файл маски или используйте | Откройте и выберите файл маски.
4. Используйте инструмент палитры цветов и нажмите на любой из черных пикселей на фоне маски, чтобы установить черный цвет.
5. Используйте инструмент выделения полигонов или от руки, чтобы нарисовать контур вокруг сомы, отделив ее от нейритов. Это требует ручного принятия решений.
6. Нажмите Изменить | | выбора Сделать маску. Откроется новое изображение с обведенным сомой, сегментированной от остальной части изображения. Это создаст файл маски soma.
7. Не перемещая нарисованную область, щелкните заголовок исходного файла маски.
8. Нажмите Изменить | Заполните, чтобы заполнить обведенные сомы так, чтобы маской оставались только нейриты.
9. После получения отдельных файлов нейритов и масок сохраните оба файла маски.
10. Откройте «neurite_2D_network» в Матлабе.
11. В MATLAB перейдите в каталог со всеми данными анализа.
12. Измените путь "имя маски" на имя нейритной маски, т.е. "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.tif"
13. Измените "csv_file_name" на "fluorescent_traces.csv файл", т.е. "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.csv".
14. Нажмите кнопку Выполнить, чтобы скелетировать файл маски нейрита. При этом создается скелетонизированная версия файла маски нейрита и он депонируется как CSV-файл в папку maskfiles.
15. Затем создайте CSV-файл для soma. Откройте «CSV_mask_creator.m» в Матлабе.
16. Вставьте путь для "имени маски" к имени маски сомы, т.е. "MaskFiles/VAMP2phLuorin_488_wt_4_mask_file_soma.tif
17. Измените "writematrix" на csv имя создаваемого файла, т.е. "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv"
18. Нажмите кнопку Выполнить. При этом будет создастся новый файл VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv.
19. Повторите 6.14 для каждого файла маски.

7. Настройка RStudio

1. Откройте Rstudio и откройте ripleys_k_analysis. R файл.
2. Установите пакет "spatstat" в RStudio, перейдя в Tools | Установите пакеты и введите "spatstat" с последующим нажатием кнопки Установить.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это необходимо выполнить только один раз для установки Rstudio.
3. Запускаем библиотеку spatstat в начале каждого сеанса.
4. Обратите внимание на две основные переменные в этом случае: «neuron_mask» и «neuron_datapoints». Neuron Mask указывает на набор файлов масок для запуска, то есть файлы масок soma».
   ПРИМЕЧАНИЕ: Запустите все файлы масок soma вместе, отдельно от файлов маски Neurite, и наоборот.
5. Прочитайте в .csv файлов масок для каждого из анализируемых нейронов.
6. Запускайте несколько файлов одновременно, копируя дополнительные neuron_mask_n+1. Это позволит агрегировать анализ Рипли вместе, используя скрипт, описанный в разделе 8.
7. Теперь проверьте вторую переменную, "neuron_datapoints".
8. Читайте в». X_fluorescent_traces.csv" файл, сгенерированный программой анализа (по функциям всех extracted_R файл) с позициями x,y,t экзоцитических событий, а также нейрит-специфическим файлом позиций x,y для 2D-сети. Это идет в позиции «neuron_datapoints».
9. В RStudio выберите код | | региона запуска Запустите все. Это генерирует несколько графиков, включая сгруппированные значения K Рипли, а также графики плотности.
10. Сохраните участки, перейдя в Экспорт | Сохранить изображение как | Выберите соответствующий формат изображения и каталог, а затем введите соответствующее имя файла, затем нажмите кнопку Сохранить.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Функция построения тепловых карт вызывается в скрипте с использованием "plot(density(soma_data,0.4))". Число «0,4» здесь показывает, насколько сглаженной должна быть функция плотности. Его можно изменить, чтобы он соответствовал пользовательским данным значимым образом, но если сравнение должно выполняться между различными тепловыми картами, число должно быть одинаковым между ними.
11. Экспорт или сохранение изображения из Rstudio. Если тепловая карта требует дальнейшего редактирования, выберите соответствующий тип файла (SVG или EPS).

8. Анализ Рипли

ПРИМЕЧАНИЕ: Ripleys_k_analysis. Файл R также автоматически генерировал графики k значений Рипли. Запуск всего скрипта автоматически запустит функции, упомянутые ниже, но он включен в детали, если кто-то хочет запустить каждую часть скрипта отдельно или внести изменения в анализ.

1. Сначала запустите функцию оболочки для каждой ячейки. Эта функция имитировала полную пространственную случайность (CSR) для проверки значения K Рипли экзоцитарной точки события.
   Data_envelope_1 = конверт (soma_data_1, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE)
   Data_envelope_2 = envelope(soma_data_2, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE)
2. Затем объедините эти конверты вместе и создайте одну оценку КСО для группы:
   Pool_csr = pool(Data_envelope_1, Data_envelop_2,...)
   Затем запустите функцию K Рипли для всех точек данных.
   Data_ripleys_k_1 = Kest(soma_data_1, ratio = TRUE)
   Data_ripleys_k_2 = Kest(soma_data_2, ratio = TRUE)
3. После завершения объедините значения K Рипли вместе и загрузите их доверительные интервалы с помощью следующей команды:
   Data pool = pool(Data_ripleys_k_1, Data_ripleys_k_2,...)
4. Начальная загрузка с помощью следующей команды:
   Final_Ripleys_K = varblock(fun = Kest, Data_pool)
5. Построение данных.
6. Если требуется жесткая статистическая разница, Studentised Permutation Test включается в пакет spatstat для проверки разницы между группами точечных паттернов:
   Test_difference = studpermu.test(all_points_to_test, exocytic_events ~ group, nperm = np).

Здесь графический интерфейс(рисунок 2A)использовался для анализа экзоцитарных событий из трех VAMP2-pHluorin,экспрессирующих нейроны при 3 DIV с использованием микроскопии TIRF (полная флуоресценция внутреннего отражения). Корковые нейроны E15.5 были выделены с последующей трансфекцией VAMP2-pHluorin и покрытием с использованием протоколов, изложенных в Winkle et al., 2016 и Viesselmann et al., 201111,12. Методология параметров визуализации изложена в Urbina et al., 20182. Вкратце, микроскопия TIRF использовалась для изображения базальной плазматической мембраны нейронов каждые 100 мс в течение 2 мин. Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4 показывают пошаговое руководство по анализу экзоцитарных событий. Выбирается папка, в которой расположены изображения нейронов, и выбирается каталог для депонирований файлов данных окончательного анализа(рисунок 2A). С помощью функции MaskMaker для нейронов генерируется маска, которая проверяется в графическом интерфейсе(рисунок 2B). В этом случае клеточная маска хорошего качества, и анализ может продолжаться. Если маска недостаточна, маска может быть создана в ImageJ(рисунок 3). После использования функции MaskMaker или создания маски в ImageJ и выбора каталога, в котором расположены файлы маски, выполняется анализ(рисунок 4A). Результаты генерируются в папке DataFiles после завершения анализа (желтый индикатор меняется обратно на зеленый)(рисунок 4B).

Файлы данных автоматически создаются и именуются в соответствии с предоставленными файлами необработанных данных.

Предполагая, что файл данных называется X:

X_tracking: Этот файл включает в себя положение x, y и номер кадра каждого события, а также ограничителю, которые можно использовать для рисования полей вокруг каждого события. Возраст указывает на количество кадров после первоначального обнаружения, где событие является отдельной гауссовой пунктой. Если классификация проверена, в этом файле появятся результаты классификации, которые указывают на вероятность экзоцитарного события, принадлежащего к одному из четырех классов. Если вероятность больше 0,5 и больше других вероятностей, то был выбран экзоцитический класс.

X_fluorescent следы: Этот файл содержит положение x,y и номер кадра каждого события. Кроме того, он включает измерения интенсивности флуоресцентной лампы в интересующей области вокруг каждого события за 2 секунды до и 10 секунд после пика ΔF / F для каждого события (обозначено столбцами Timepoint).

X_cell_statistics: Этот файл включает в себя площадь ячейки, общее время изображения и автоматически вычисляемую частоту экзоцитарных событий для каждой клетки (в событиях / мм2/ минута).

Файлы извлечения компонентов включают в себя:

X_contrast: Контраст. Мера контраста интенсивности между пикселем и его соседом по всему изображению.

X_correlation: Корреляция. Мера того, насколько коррелирует пиксель со своим соседом по всему изображению.

X_energy Общая энергия. Определяется как квадратная сумма интенсивности пикселей.

X_homogeneity измеряет близость распределения элементов в ROI к диагонали ROI.

X_ring_fluorescence: средняя флуоресценция пограничных пикселей.

X_SD: Стандартное отклонение. Это определяется как стандартное отклонение ROI.

Примеры следов средней флуоресценции ± SEM из каждого экзоцитарного класса были построены из файла X_fluorescent следов(рисунок 5A). Используя файл Cell_statistics, частота экзоцитоза для каждого класса была построена для каждого нейрона(рисунок 5B). При нажатии флажка Классификация программа назначает каждое экзоцитическое событие классу, построенное на рисунке 5C. Следуя классификации, код анализа K Рипли был использован для определения того, являются ли экзоцитарные события случайными, сгруппированными или рассеянными в пространстве и времени. Сгенерированы тепловые карты плотности локализации экзоцитарных событий(рисунок 5D). Они показывают ожидаемые кластеризованные «горячие точки» в отдельных областях нейрона. Затем был выполнен K-анализ Рипли для сомы, нейрита и кластеризации с течениемвремени (рисунок 5E). Значение K Рипли и SEM (черная линия и синяя затененная область соответственно) поднимаются выше линии полной пространственной случайности (красная пунктирная линия), что предполагает статистически значимую кластеризацию.

Рисунок 1:Представление экзоцитарного анализа и классификации. (A) Схема конвейера анализа для графического интерфейса. Клетки сегментируются от фона до того, как экзоцитарные события идентифицируются и отслеживаются. Такие параметры, как пик ΔF/F и t1/2, рассчитываются на основе флуоресцентных следов экзоцитоза в ROI вокруг события до и после синтеза. (B)иллюстрация четырех режимов экзоцитоза и примеры монтажей изображений. После слияния события могут мгновенно переходить в FVF или KNR (FVFi и KNRi), или задержка может присутствовать до наступления судьбы слияния fvf или KNR (FVFd и KNRd). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2:Пошаговый пример анализа. (A) Сначала выбираются наборы данных (1., красное поле), и выбирается каталог для размещения файлов анализа (2., красное поле). Далее указываются частота кадров и размер пикселя (3., зеленое поле). Здесь использовался размер пикселя 0,08 мкм и частота кадров 100 мс. Затем нажимается функциональная кнопка MaskMaker (4., синяя рамка). Папка под названием "MaskFiles" автоматически создается в выбранном каталоге, содержащем файл маски для каждого файла изображения в наборе данных. (B) При загрузке наборов данных при выборе файла данных и/или файла маски будет отображаться первый кадр изображений для удобства сравнения (зеленое поле). Файлы масок могут быть не совсем правильными; этот файл маски может быть исправлен для ошибок, или новый файл маски может быть сделан вручную Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3:Создание файла маски вручную в ImageJ. (A) Сначала откройте файл для создания маски. Кнопка "Выбор полигона" выделена красным цветом. Щелкнув по краю ячейки, создается контур полигона. (B) Как создать маску из контура многоугольника. Выбрав Изменить | | выбора   Create Mask, черно-белая маска будет создана из многоугольника (правое изображение). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4:Анализ экзоцитарных событий. (A) Демонстрация кнопки анализа (оранжевая коробка) и запущенный анализ. Обратите внимание, что индикатор запуска становится желтым во время выполнения анализа. (B) Примеры файлов анализа, которые создаются в выбранном каталоге после завершения анализа. DataFiles содержат все файлы анализа экзоцитического события. (C) Файлы анализа, созданные в папке DataFiles. Цветные поля представляют открытые файлы на последующих изображениях. (D)Три открытых файла: «X_fluorescent_traces.csv» (красный) и «X_Cell_statistics» (зеленый) и «X_tracking» (синий). Флуоресцентные следы содержат положение x, y и номер кадра каждого события, а также интенсивность флуоресценции при каждой рентабельности инвестиций. Cell_statistics содержит сводную информацию о экзоцитарной статистике целых клеток, такую как частота экзоцитоза. X_tracking содержит информацию о положении и времени для каждого экзоцитарного события, а также вероятность каждого класса экзоцитоза для каждого события, представленную в виде числа от 0 до 1 (>0,5 указывает на то, что событие принадлежит к определенному классу). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5:Репрезентативные результаты. (A) Средние следы флуоресценции +/- SEM из каждого экзоцитарного класса. (B) Частота событий, построенная для трех мышиных корковых нейронов для каждого экзоцитарного класса. Эти значения данных были построены из "X_Cell_statistics" с использованием классов, назначенных в "X_tracking". (C)Распределение классов экзоцитоза для тех же трех клеток, которые используются в А). Здесь строится соотношение каждого режима. (D)График плотности, на котором происходят экзоцитарные события, как сгенерировано в части протокола, в которой происходит K-анализ Рипли. Это можно интерпретировать как «тепловую карту» пространственной вероятности того, где происходят события. (E)K-анализ Рипли трех клеток, используемых для A) и B). Красная линия указывает, какое значение будет совершенно пространственно случайное распределение экзоцитарных событий. Черная линия указывает совокупное значение K Рипли для трех ячеек в этом примере, а синяя затененная область представляет доверительный интервал. Здесь затененная область заметно выходит за линию полной пространственной случайности между ~ 0,25-1 мкм, предполагая, что экзоцитарные события сгруппированы на этих расстояниях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Авторы заявляют, что не раскрывают.