Методическая статья

Упрощенный метод получения органоидов почек из плюрипотентных стволовых клеток человека

DOI:

10.3791/62452

⸱

13 апреля 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Developmental Biology, University of Pittsburgh, School of Medicine, 2Department of Molecular Medicine and Pathology, School of Medical Sciences, University of Auckland, 3Center for Critical Care Nephrology, University of Pittsburgh, School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем протокол генерации почечных органоидов из плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSCs). Этот протокол генерирует почечные органоиды в течение двух недель. Полученные органоиды почек могут быть культивированы в крупномасштабных колбах спиннера или многолуночных магнитных пластинах перемешивания для параллельных подходов к тестированию лекарств.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Почечные органоиды, полученные из hPSCs, обеспечили неограниченный источник почечной ткани. Органоиды почек человека являются бесценным инструментом для изучения заболеваний и повреждений почек, разработки клеточной терапии и тестирования новых терапевтических средств. Для таких применений необходимо большое количество однородных органоидов и высоковоспроизводимых анализов. Мы опираемся на наш ранее опубликованный протокол органоидов почек для улучшения общего состояния здоровья органоидов. Этот простой, надежный 3D-протокол включает в себя формирование однородных эмбриоидных тел в минимальной компонентной среде, содержащей липиды, добавку инсулин-трансферрин-селен-этаноламин и поливиниловый спирт с ингибитором GSK3 (CHIR99021) в течение 3 дней с последующей культивированием в нокаутирующей сывороточной замещающей среде (KOSR). Кроме того, агитационные анализы позволяют уменьшить слипание эмбриоидных тел и сохранить однородный размер, что важно для снижения изменчивости между органоидами. В целом, протокол обеспечивает быстрый, эффективный и экономически эффективный метод генерации большого количества почечных органоидов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В последние годы разработан ряд протоколов дифференциации плюрипотентных стволовых клеток человека в органоиды почек 1,2,3,4,5. Почечные органоиды предоставили важный инструмент для содействия исследованиям новых подходов к регенеративной медицине, моделированию заболеваний, связанных с почками, проведению исследований токсичности и разработке терапевтических препаратов. Несмотря на их широкую применимость, почечные органоиды имеют такие ограничения, как отсутствие созревания, ограниченная долгосрочная культуральная способность in vitro и нехватка нескольких типов клеток, обнаруженных в почках человека 6,7,8. Недавняя работа была сосредоточена на улучшении уровня созревания органоидов, продлении периодов культивирования и расширении сложности популяций клеток почек путем изменения существующих протоколов 9,10,11,12. В данной итерации нашего установленного протокола 5,13 мы модифицировали компоненты среды на первом этапе протокола в безсывороточную базовую среду, дополненную инсулин-трансферрин-селен-этаноламин (ITSE), липидами, поливиниловым спиртом (E5-ILP) и CHIR99021 (рисунок 1). Эти изменения обеспечивают полностью определенную, не содержащую сыворотки, низкобелковую среду, с меньшим количеством компонентов, чем наша предыдущая средняя композиция 5,13 и без дополнительных факторов роста. В результате, среда первой ступени является менее трудоемкой в приготовлении, чем наша ранее опубликованная версия, и может снизить изменчивость от партии к партии5. Предыдущие исследования показали, что как инсулин, так и трансферрин важны в безсыворочной культуре14,15, однако высокие уровни инсулина могут быть ингибирующими дифференцировку мезодермы16. Мы сохранили низкий уровень инсулина, как это предусмотрено в первоначальном протоколе, и еще больше снизили уровни KOSR (содержащего инсулин) на втором этапе анализа. В соответствии с другими протоколами образования органоидов почек, более низкие уровни KOSR полезны для поддержания баланса между пролиферацией и дифференцировкойпочечной ткани 17. Кроме того, мы снизили концентрацию глюкозы в нашей среде стадии II13.

Наш метод описывает установку для суспензионного анализа почечных органоидов, получая до ~1000 органоидов из исходной ~60% сливающейся hPSC 100 мм культуральной пластины, как описано в оригинальной публикации 5,13. Этот протокол может быть легко масштабирован до начала с нескольких пластин 100 мм или 150 мм для дальнейшего увеличения числа органоидов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты с использованием гПСК проводились в соответствии с институциональными руководящими принципами и проводились в капюшоне биобезопасности класса II с соответствующими средствами индивидуальной защиты. Все реагенты относятся к клеточной культуре, если не указано иное. Все культуры инкубируются при 37 °C, 5% CO2 в атмосфере воздуха. На всех этапах анализа могут быть собраны эмбриоидные тела или почечные органоиды, зафиксированы или подготовлены к анализу. Линии hPSC, используемые для генерации этих данных, были полностью охарактеризованы и опубликованы18.

1. Подготовка культуральных пластин

ПРИМЕЧАНИЕ: Приблизительно за 1 ч до расщепления гПСК покройте 2 х 100 мм пластины культуры тканей экстрактом матрицы базальной мембраны (BME), сертифицированным стволовыми клетками. Можно предварительно покрыть пластины, запечатать их парафиновой пленкой и хранить при 4 °C в соответствии с инструкциями производителя.

  1. Подготовьте 2 пластины, обработанные культурой тканей 100 мм (1 для анализа органоидов почек, 1 для поддержания клеточной линии) и коническую трубку объемом 15 мл в капюшоне биобезопасности класса II.
  2. Aliquot 8 мл холодной, без сыворотки Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) в коническую трубку объемом 15 мл и ~ 4 мл в каждую из 100 мм пластин, достаточно, чтобы покрыть дно каждой пластины средой.
  3. Возьмите из морозильной камеры 100 мкл аликвоту BME (-20 °C). Используя серологическую пипетку объемом 2 мл, возьмите ~1 мл холодного ДМЭМ из конической трубки объемом 15 мл. Медленно размораживайте аликвоту BME, осторожно пипетируя вверх и вниз холодным DMEM, избегая образования пузырьков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте Аликвоте BME сидеть при комнатной температуре. Используйте немедленно.
  4. Переместите размороженный DMEM/BME обратно в коническую трубку объемом 15 мл с оставшимся DMEM. С серологической пипеткой объемом 10 мл осторожно перемешайте разбавленный BME, пипеткой вверх и вниз по крайней мере 8 раз, чтобы равномерно рассеять BME, избегая образования пузырьков.
  5. Переложите 4 мл разбавленного BME в каждую пластину с DMEM и аккуратно закрутите пластину так, чтобы BME равномерно распределился. Инкубировать покрытую пластину в течение 1 ч при комнатной температуре или 30 мин при 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 50 мкл BME на пластину толщиной 100 мм. Использование других культуральных сред и клеточных линий hPSC может потребовать различных концентраций BME.

2. Пропускающие GPS-серверы

ПРИМЕЧАНИЕ: Для рутинной культуры hPSC проходит клеточные линии с 70-80% слиянием.

  1. Аспирируйте культуральную среду из пластины hPSC, подлежащей прохождению. Добавьте ~ 8 мл фосфатно-буферного физиологического раствора Dulbecco (DPBS) в пластину hPSC и осторожно закрутите, чтобы промыть клетки.
  2. Аспирируйте DBPS и добавьте 2 мл мягкого реагента диссоциации клеток (GCDR) на пластину 100 мм, каплю за каплей сверху, чтобы покрыть клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Могут также использоваться другие диссоциационные реагенты. Отрегулируйте соответствующим образом.
  3. Инкубировать при комнатной температуре в течение ~6-8 мин до тех пор, пока колонии не распадутся и клетки не станут рефракционными при фазовом контрасте (рисунок 2А).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время может варьироваться между линиями клеток. Отрегулируйте соответствующим образом.
  4. Во время инкубации подготовьте коническую трубку объемом 50 мл. Добавьте 16 мл среды hPSC (8 мл на пластину 100 мм) и добавьте ингибитор Rho-ассоциированной киназы (ROCKi) до конечной концентрации 5 мкМ.
  5. Аспирируйте DMEM из пластин, покрытых BME, и добавьте 8 мл среды hPSC плюс ROCKi к каждой пластине.
  6. Когда ячейки будут готовы (как описано в пункте 2.3, рисунок 2A), аспирируйте GCDR и наклоните пластину ~ 45 ° в сторону экспериментатора и соскоблите клетки с помощью подъемника клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если ячейки отсоединяются, опустите аспирирующий GCDR и продолжайте.
  7. Поверните пластину ~90° и снова соскоблите, чтобы поднять оставшиеся ячейки. Держите пластину ~45° и промывайте клетки 3 мл среды hPSC с помощью серологической пипетки объемом 10 мл.
  8. Аккуратно пипетку вверх и вниз разбить большие комочки (не более 2-3 раз) и высеять клетки в соответствующем соотношении для интересующей клеточной линии на подготовленные пластины. Поместите пластину с клетками в инкубатор и осторожно переместите пластину в восьмерки, чтобы равномерно распределить клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте линии hPSC были разделены в соотношении 1:5, это может варьироваться для других клеточных линий и условий. Оставьте тарелку нетронутой на ночь.
  9. Через ~ 24 ч осмотрите клетки на предмет прикрепления. Ищите небольшие отдельные колонии, прикрепленные к ним. Аспирировать отработанную среду и пополнить 8 мл свежей среды hPSC (без добавления ROCKi).
  10. Продолжайте наблюдение и кормление ежедневно, пока клетки не достигнут ~ 60% слияния, чтобы начать анализ органоидов почек (обычно достигается от 48 до 72 ч после прохождения). Колонии в идеале должны быть дискретными и не сливающимися (рисунок 2B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно ограничить клетки не более чем 80% сливанием, чтобы сохранить их плюрипотентное состояние. Сливающиеся культуры, грубое обращение или более высокие проходы могут привести к нежелательной спонтанной дифференцировке или низкой эффективности образования органоидов почек.

3. День 0 - Настройка анализа органоидов почек

  1. Перед началом подготовки сред E5-ILP и stage II в соответствии с составами (таблица 1 и таблица 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Носитель может храниться до 14 дней при температуре 4 °C.
  2. Для одного анализа органоидов почек (для одной 6-луночной пластины необходима одна 100-миллиметровая культуральная пластина) приготовьте полную среду E5-ILP в конической трубке объемом 50 мл: 18 мл E5-ILP с добавлением 8 мкМ CHIR99021 (14,4 мкл), 3,3 мкМ ROCKi (6 мкл), 0,1 мМ бета-меркаптоэтанола (32,7 мкл).
  3. Поместите 2 мл полной среды E5-ILP в каждую скважину из 6 скважин сверхнизкой крепежной пластины.
  4. Промывайте HPSC при слиянии ~60 % (рисунок 2B) дважды с ~ 8 мл DPBS. Затем аспират DPBS добавляют 2 мл диспазы на пластину 100 мм, каплю за каплей покрывают клетки и инкубируют в течение 6 мин при 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Через 6 минут края колоний начнут сворачиваться (рисунок 2C, красные стрелки), в то время как остальная часть колонии останется прикрепленной. Если это не получено через 6 мин, поместите клетки обратно в инкубатор еще на 30 с. Другие носители и матрицы hPSC могут быть несовместимы с этим таймингом. Покрытие BME на основе ламинина не совместимо с диспазой. Если BME на основе ламинина являются стандартной матрицей hPSC, покройте одну из пластин в разделе 1 BME, описанным в этом способе, которое будет использоваться для анализа органоидов почек.
  5. Промывочные ячейки 3x с ~10 мл DPBS. Затем аспирируйте DPBS наклоните пластину ~ 45 ° и соскоблите вниз с помощью подъемника ячейки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Диспаза не деактивируется, поэтому ее необходимо тщательно вымыть. Не уменьшайте количество стирок.
  6. Промыть колонии сверху 6 мл полной среды E5-ILP с помощью серологической пипетки объемом 10 мл. Пипетки вверх и вниз осторожно, чтобы разбить любые большие колонии (обычно достаточно 2 или 3 раз).
  7. Распределите кластеры колоний равномерно, добавив 1 мл на лунку в 6-луночную плиту. Поместите пластину на орбитальный шейкер (настройки: орбитальный = 30, обратный = 330°, вибрация = 5° - 2 с), который помещается в инкубатор при температуре 37 °C (рисунок 2D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вибрационная особенность важна для адекватного распределения органоидов и предотвращения слипания.

4. День 2 - Кормление полусредним изменением

ПРИМЕЧАНИЕ: В течение 48 часов кластеры колоний образуют эмбриональные тела.

  1. Подготовьте полную среду: Для одной 6-луночной плиты подготовьте 12 мл среды E5-ILP + 8 мкм CHIR99021 в конической трубке объемом 15 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Бета-меркаптоэтанол и ROCKi не требуются.
  2. Пусть эмбриоидные тела осядут в нижней части пластины, наклоните пластину ~45°, затем медленно аспирируйте среду сверху, оставьте ~1 мл на лунку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбриоидные тела на этой стадии быстро сгущаются. Не оставляйте их на > 5 мин.
  3. Добавить 2 мл подготовленной полной среды (раздел 4.1) на лунку. Верните тарелку обратно на шейкер.

5. День 3 - Перенос эмбриональных тел в среду II стадии

  1. Приготовьте коническую трубку объемом 50 мл и ДМЭМ (низкий уровень глюкозы). Пусть эмбриоидные тела осядут в нижней части пластины. Наклоните пластину ~45° и медленно аспирируйте среду сверху, оставьте ~1 мл на лунку.
  2. Тщательно соберите все эмбриоидные тела из каждой лунки с помощью серологической пипетки объемом 10 мл и перенесите их в коническую трубку объемом 50 мл.
  3. Вымойте каждую лунку, чтобы собрать оставшиеся эмбриональные тела с ~ 1 мл DMEM (низкий уровень глюкозы) и добавьте их в ту же коническую трубку объемом 50 мл.
  4. Оставьте эмбриональные тела оседать на дно трубки, ~5 мин. Во время ожидания добавьте 2 мл среды стадии II к каждой скважине плиты из 6 скважин. Выводите крупные эмбриоидные тела (>300 мкм) с помощью клеточного сетчатого фильтра 200 мкм (рисунок 2E).
    1. Используйте новую коническую трубку объемом 50 мл и поместите сверху клеточный сетчатый фильтр 200 мкм. Пипетка всех эмбриональных тел с помощью серологической пипетки объемом 10 мл осторожно над клеточным ситечком.
    2. Промыть клеточный ситечко дополнительным ~ 5 мл DMEM (низкий уровень глюкозы), чтобы собрать любые эмбриональные тела, застрявшие в клеточном ситечке. Позвольте эмбриоидным телам осесть на дно конической трубки.
  5. Когда эмбриоидные тела осядут, аспирируйте супернатант и промывайте ~ 10 мл DMEM (низкий уровень глюкозы).
  6. Аспирировать ДМЭМ и повторно подвешивать эмбриоидные тела в 6 мл среды II стадии.
  7. Перенесите эмбриоидные тела обратно в 6 лунок сверхнизкой пластины крепления, равномерно распределив их между 6 лунками.
  8. Выполняйте половинные изменения среды, как описано в шагах 4.2 и 4.3, через день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с 3-го дня, эмбриоидные тела будут иметь «золотистый» и гладкий, сферический вид (рисунок 2F). С ~ дня 6 станет очевидным образование канальцев в отдельных эмбриональных телах, причем увеличение числа в течение следующих дней достигнет оптимальных чисел и роста к 14-му дню (рисунок 2G, H). Чтобы устранить случайное образование слипания, при визуальном наблюдении за почечными органоидами или очень маленькими эмбриональными телами без канальцев, отсейте органоиды <200 и крупных >500 мкм с клеточными сетчатыми фильтрами 500 и 200 мкм, как описано в шагах 5.4.1 и 5.4.2.

6. Перенос в колбу спиннера и подача

ПРИМЕЧАНИЕ: Колба спиннера может использоваться в любое время, начиная с 3-го дня, для экспериментов, требующих большого количества органоидов. Рутинная передача органоидов происходит в нашей лаборатории между днями 6-8. Пожалуйста, ознакомьтесь с разделом Обсуждение альтернатив, если оборудование недоступно.

  1. Перенос эмбриоидных тел в колбу спиннера объемом 125 мл с 45 мл среды II стадии. Установите скорость магнитной мешалки на 120 об/мин и поместите в инкубатор (рисунок 2I).
  2. Чтобы питать эмбриональные тела или почечные органоиды, дайте почечным органоидам ненадолго осесть на дно колбы спиннера. Поднимите крышку с одного бокового рычага колбы и поместите аспирационную пипетку внутрь, при этом наконечник коснется противоположной внутренней стенки.
  3. Медленно наклоните аспирационную пипетку вниз и аспирируйте примерно половину среды. Восполняйте 20 мл свежей среды Stage II, пипеткой ее через то же отверстие.

7. Установка 6-луночной магнитной пластины перемешивания (6MSP)

ПРИМЕЧАНИЕ: Формат 6MSP может использоваться вместо колб спиннера, если необходимо протестировать несколько условий. Используйте 6MSP для лечения соединениями или нефротоксинами. Это экономит количество среды, используемой на втором этапе, сохраняя при этом доступность питательных веществ за счет диффузии.

  1. Очистите овальные магнитные перемешивания в конической трубке объемом 50 мл, промыв в культуре ткани подходящее моющее средство ненадолго (если оно никогда не использовалось) или замочите > 1 ч, если предварительно использовалось.
  2. Кратковременно промыть 3x в стерильном DPBS.
  3. Промыть 1 раз в течение 5 мин в 70% этаноле, 1 раз в стерильном DPBS.
  4. Промыть антиадгезионным раствором и промыть 1 раз стерильным DPBS и аспиратом.
  5. Осторожно, используя длинные стерильные щипцы, поместите один магнитный перемешивание в каждую лунку 6-луночной пластины с эмбриональными телами или почечными органоидами.
  6. Поместите пластину на 6MSP и установите скорость на 120 об/мин (рисунок 2J). Поддерживать почечные органоиды с половинным средним изменением в соответствии с разделами 4.2 и 4.3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы магнитные перемешивания защелкнулись и начали вращаться, вам может потребоваться сначала кратковременно поставить уровень мощности до 100, а затем, как только они все вращатся, снизить уровень мощности до 25.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой последней версии нашего протокола дифференциация органоидов почек инициируется в определенной среде с низким содержанием белка. Анализы выполняются полностью в суспензии и основаны на врожденной способности дифференцировки и организации hPSCs для инициирования тубулогенеза. Один анализ, полученный из 100 мм ~ 60% сливающейся культуральной пластины hPSC, обычно дает 500-1000 органоидов почек, как показано в нашей предыдущей публикации5. Из-за такого большого количества генерируемых органоидо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Предыдущие исследования показали, что начальные этапы протокола имеют решающее значение для промежуточной дифференциации мезодермы 5,19,20 и, следовательно, на этом этапе необходимо реализовать строгий состав среды. Удаление неопределенных компонентов, таких как сыворотка, альбумин, безбелковая гибридомная среда II с первой стадии протокола, может помочь улучшить последовательную эффективность дифференциации между анализами

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование финансировалось Национальными институтами здравоохранения R01 DK069403, UC2 DK126122 и P30-DK079307 и ASN Foundation for Kidney Research Fellowship Program to AP.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-МеркаптоэтанолThermo Fisher21-985-023
Раствор для промывки против прилипанияSTEMCELL Technologies7010
CHIR99021STEMCELL Technologies7205410 мМ на складе в DMSO
Corning  одноразовые колбы для спиннераFisher Scientific07-201-152
Corning Ultra-Low Attachment 6-луночные пластиныFisher Scientific07-200-601
Тихоходные мешалки CorningFisher Scientific11-495-03Многопластинчатая магнитная мешалка для спиннера для культуры колб
DispaseSTEMCELL Technologies7923Aliquot и заморозьте
DMEM, с низким содержанием глюкозы, пируват, без глютамина, без фенола красныйThermo Fisher11054020
DPBS 1x, без кальция, без магнияThermo Fisher14-190-250
Яйцо / овальная мешалка2magPI20106
Excelta Пинцет общего назначенияFisher Scientific17-456-103Хранить стерильным в колпаке для клеточных культур
EZBio Одноразовая бутылка для сред, 250 млFoxx Life Sciences138-3211-FLSдля культуры тканей PVA 10%
Falcon (100 мм)Thermo Fisher08-772E
Fisherbrand  Пипетка стерильная аспирационная 2млFisher Scientific14-955-135
Fisherbrand  Клеточные лифтеры - Клеточный лифтерFisher Scientific08-100-240
Fisherbrand  Многофункциональные 3D вращателиFisher Scientific88-861-047Орбитальный шейкер
Geltrex LDEV-Free Сниженный фактор роста Базальная мембранаMatrix Thermo FisherA1413302BME. Аликвот на лед и заморозить. Еще одна подходящая альтернатива матрице – Matrigel или Cultrex.
Щадящий реагент для диссоциации клетокSTEMCELL Technologies7174GCDR
GlutaMAX ДобавкаThermo Fisher35-050-061L-глутамин.
HEPES (1M)Thermo Fisher15-630-080
Инсулин-трансферрин-селен-этаноламинThermo Fisher51-500-056ITSE
KnockOut  Замена сыворотки - многовидоваяThermo FisherA3181502KOSR. Аликвота и
липидная смесь 1, химически определеннаяMillipore-SigmaL0288-100ML
MEM раствор заменимых аминокислотThermo Fisher11140-050
MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Стерильная вакуумная система фильтрации 500 млFisher ScientificS2GPU05RE
MilliporeSigma  Stericup Quick Release-GP Стерильная вакуумная система фильтрации 250 млFisher ScientificS2GPU02RE
MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP Блок управления2magVMF 90250 U
MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP Микропланшетный привод для перемешивания2magVMF 406006MSP
MP Biomedicals  7X Чистящий растворFisher ScientificMP0976670A4Подходит для культуры тканей. Сделайте 5% раствор в воде
mTeSR1STEMCELL Technologies85850hPSC medium.TeSR-E8, NutriStem XF и mTeSR Plus medium также были протестированы и являются подходящими альтернативами. 
Nunc 50 мл конические, стерильные центрифужные пробиркиFisher Scientific12-565-270
Nunc 15 мл конические стерильные центрифужные пробиркиFisher Scientific12-565-268
Пенициллин-стрептомицинThermo Fisher15-140-122Аликвота и заморозка
ПлазмоцинInvivogenant-mpt<strong>Антимикоплазменный реагент. Аликвота и freeze
pluriStrainer® 200 µ mFisher ScientificNC0776417Клеточный фильтр
pluriStrainer® 500 µ mFisher ScientificNC0822591Клеточное ситечко
Поливиниловый спирт 87-90% гидролизуется  (ПВА)Millipore-SigmaP8136-250G10% в DPBS перемешивая при 98 градусах С до растворения, сделать в 138-3211-FLS
ROCK ингибитор Y-27632 (ROCKi)STEMCELL Technologies7230410 мМ запас в DPBS
Стерильные одноразовые серологические пипетки  - 10млFisher Scientific13-678-11E
Стерильные одноразовые серологические пипетки - 25млFisher Scientific13-678-11
Стерильная одноразовая серологическая пипетка - 5 млFisher Scientific13-678-12D
TeSR-E5STEMCELL Technologies5916Бессывороточная, низкобелковая базовая среда для E5-ILP
Variomag distriBOX 2 Distributor2magVMF 90512Если вы используете более одного MIXdrive
Используется для изготовления стандартных тарелок

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  2. Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6, 8715(2015).
  3. Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
  4. Taguchi, A., et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2013).
  5. Przepiorski, A., et al. A simple bioreactor-based method to generate kidney organoids from pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 11 (2), 470-484 (2018).
  6. Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communication. 6, 8715(2015).
  7. Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
  8. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  9. Taguchi, A., Nishinakamura, R. Higher-order kidney organogenesis from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).
  10. Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling. Cell Reports. 33 (11), 108514(2020).
  11. Howden, S. E., Little, M. H. Generating kidney organoids from human pluripotent stem cells using defined conditions. Methods in Molecular Biology. 2155, 183-192 (2020).
  12. Tanigawa, S., et al. Activin is superior to BMP7 for efficient maintenance of human iPSC-derived nephron progenitors. Stem Cell Reports. 13 (2), 322-337 (2019).
  13. Sander, V., et al. Protocol for large-scale production of kidney organoids from human pluripotent stem cells. STAR Protocols. 1 (3), 100150(2020).
  14. Ekblom, P., Thesleff, I., Miettinen, A., Saxen, L. Organogenesis in a defined medium supplemented with transferrin. Cell Differentiation. 10 (5), 281-288 (1981).
  15. Thesleff, I., Ekblom, P. Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 82, 147-161 (1984).
  16. Freund, C., et al. Insulin redirects differentiation from cardiogenic mesoderm and endoderm to neuroectoderm in differentiating human embryonic stem cells. Stem Cells. 26 (3), 724-733 (2008).
  17. Nishikawa, M., et al. An optimal serum-free defined condition for in vitro culture of kidney organoids. Biochemistry and Biophysics Research Communication. 501 (4), 996-1002 (2018).
  18. Oh, J. K., et al. Derivation of induced pluripotent stem cell lines from New Zealand donors. Journal of the Royal Society of New Zealand. , 1-14 (2020).
  19. Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2013).
  20. Lam, A. Q., et al. Rapid and efficient differentiation of human pluripotent stem cells into intermediate mesoderm that forms tubules expressing kidney proximal tubular markers. Journal of American Society of Nephrology. 25 (6), 1211-1225 (2014).
  21. Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).
  22. Imasawa, T., et al. High glucose repatterns human podocyte energy metabolism during differentiation and diabetic nephropathy. FASEB Journal. 31 (1), 294-307 (2017).
  23. Kim, K. A., et al. High glucose condition induces autophagy in endothelial progenitor cells contributing to angiogenic impairment. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (7), 1248-1252 (2014).
  24. Piwkowska, A., Rogacka, D., Audzeyenka, I., Jankowski, M., Angielski, S. High glucose concentration affects the oxidant-antioxidant balance in cultured mouse podocytes. Journal of Cellular Biochemistry. 112 (6), 1661-1672 (2011).
  25. Wu, H., et al. Comparative analysis and refinement of human PSC-derived kidney organoid differentiation with single-cell transcriptomics. Cell Stem Cell. 23 (6), 869-881 (2018).
  26. Lei, X., Deng, Z., Duan, E. Uniform embryoid body production and enhanced mesendoderm differentiation with murine embryonic stem cells in a rotary suspension bioreactor. Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Embryoid BodiesOrganoid DifferentiationSpinner Flask CultureMagnetic Stir PlateRenal TubulesPodocyte ClustersImmunofluorescence StainingEndothelial Cell Expansion

Похожие статьи