Анализ микроокружения печени при раннем прогрессировании неалкогольной жировой болезни печени, связанной с гепатоцеллюлярной карциномой у рыбок данио

Краткое содержание

Здесь мы представляем, как создать модель рыбок данио, связанную с неалкогольной жировой болезнью печени (НАЖБП), связанную с гепатоцеллюлярной карциномой (ГЦК), для изучения влияния избытка холестерина на микроокружение печени и иммунный клеточный ландшафт.

Аннотация

Рак печени в настоящее время является третьей по значимости причиной смерти, связанной с раком, во всем мире, а гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) составляет 75-90% всех случаев рака печени. С внедрением эффективных методов лечения для профилактики и лечения гепатита В / С, неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) и более агрессивная форма, известная как неалкогольный стеатогепатит (НАСГ), быстро становятся факторами риска номер один для развития ГЦК в современных обществах. Чтобы лучше понять роль НАСГ в развитии ГЦК, мы разработали рыбку данио, связанную с НАСГ. Оптическая прозрачность и генетическая податливость личинок рыбок данио делают их привлекательной и мощной моделью для изучения микроокружения печени и состава иммунных клеток с использованием неинвазивной флуоресцентной живой визуализации. Этот протокол описывает, как использовать модель данио, связанную с НАСГ ГЦК, для исследования влияния избытка холестерина в микроокружении печени и его влияния на состав иммунных клеток на ранних стадиях заболевания. Во-первых, мы кормим личинок ГЦК (s704Tg), которые экспрессируют гепатоцит-специфический активированный бета-катенин, диетой с высоким содержанием холестерина 10% в течение 8 дней для разработки модели ГЦК, связанной с НАСГ. Здесь мы описываем, как использовать различные трансгенные линии для оценки нескольких ранних признаков злокачественности в печени с помощью неинвазивной конфокальной микроскопии, таких как область печени, клетка и ядерная морфология (область гепатоцитов, ядерная область, соотношение ядерный: цитоплазматический (отношение N: C), ядерная цикличность, оценка микроядер / ядерной грыжи) и ангиогенез. Затем, используя трансгенные линии с мечеными иммунными клетками (нейтрофилами, макрофагами и Т-клетками), мы показываем, как анализировать состав иммунных клеток печени в личинках ГЦК, связанных с НАСГ. Описанные методы полезны для оценки микроокружения печени и состава иммунных клеток на ранних стадиях гепатокарциногенеза, но они также могут быть модифицированы для изучения таких особенностей в других моделях заболеваний печени.

Введение

Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) является агрессивным раком с ограниченными терапевтическими возможностями. Было обнаружено, что более 30% всех пациентов с ГЦК страдают ожирением и имеют НАСГ, агрессивную форму НАЖБП 1,2,3,4. Потребление богатых калориями диет резко увеличивает доступность жирных кислот, что вызывает местные и системные метаболические сдвиги и вызывает стеатоз, повреждение гепатоцитов, воспаление и фиброз - все ключевые особенности НАСГ. Прогрессирование НАСГ до ГЦК включает накопление липидов в печени, что вызывает воспаление и изменение состава иммунных клеток ^5,6,7. Особый интерес и важность представляет понимание того, как изменяется микроокружение печени и ландшафт иммунных клеток во время прогрессирования заболевания печени, и как оно изменяется из-за определенных этиологических факторов. Чтобы лучше определить влияние, которое избыток холестерина оказывает на микроокружение печени и иммунный клеточный ландшафт, мы разработали уникальную модель HCC, связанной с NASH. Использование этой модели дало нам лучшее понимание влияния диеты и переедания на микроокружение печени и прогрессирование заболеваний печени.

Модели млекопитающих, такие как мыши и образцы тканей человека, сыграли важную роль в понимании патогенеза стеатогепатита и стеатоза⁸. Мыши являются предпочтительной моделью для заболеваний печени и рака, но им не хватает оптической ясности на клеточном уровне, в то время как образцам тканей человека часто не хватает 3D-среды, которую могут имитировать животные модели. Эти препятствия сделали рыбок данио мощной моделью в исследовательском сообществе. Рыбки данио имеют замечательное сходство с людьми, по крайней мере, 70% сохранения генов. Они поддерживают микроокружение печени, клеточный состав печени, функцию, передачу сигналов и реакцию на травмы ^9,10. Используя диету с высоким содержанием холестерина (HCD) в сочетании с установленной трансгенной моделью HCC для рыбок данио, мы разработали модель HCC, связанную с NASH.

Здесь мы представляем протокол, объясняющий, как генерировать модель данио, связанную с НАСГ ГЦК, и как изучать микроокружение печени и устранять ранние злокачественные особенности in vivo. Используя неинвазивную конфокальную микроскопию в сочетании с трансгенными линиями рыбок данио с флуоресцентно помеченной мембраной и ядром гепатоцитов, мы можем рассмотреть ранние признаки злокачественности, проанализировав морфологию печени (площадь, объем и площадь поверхности), морфологию клеток и ядер (площадь гепатоцитов, ядерную площадь, соотношение N: C, ядерную циркулярность, оценку микроядер / ядерной грыжи) и ангиогенез (плотность сосудов). Микроокружение иммунных клеток также является важной особенностью гепатокарциногенеза ^11,12,13,14, поэтому мы также показываем, как анализировать состав иммунных клеток печени у личинок ГЦК, связанных с НАСГ, используя трансгенные линии рыбок данио с помеченными иммунными клетками (нейтрофилами, макрофагами и Т-клетками). Описанные методы являются уникальными для модели и чрезвычайно полезны для оценки микроокружения печени и состава иммунных клеток в прогрессировании заболевания печени.

Протокол

Исследования на животных проводятся в соответствии с процедурами, утвержденными институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Медицинского колледжа Альберта Эйнштейна. Рецепты буферов и растворов, используемых в протоколе, приведены в Дополнительной таблице 1.

1. Приготовление 10% обогащенной холестерином диеты при остром избытке холестерина.

1. Взвесьте 2 x 4 г Golden Pearl Diet 5-50 нм Active Spheres (GPAS) в двух стеклянных стаканах по 25 мл - один для нормальной диеты (ND) и другой для диеты с высоким содержанием холестерина (HCD).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать любую коммерческую сухую диету для личинок рыбок данио.
2. Взвесьте 0,4 г холестерина в стеклянном стакане объемом 10 мл. Накройте стакан фольгой.
3. Измерьте 5 мл диэтилового эфира с помощью шприца объемом 10 мл с иглой 20 г. Затем добавьте диэтиловый эфир в стакан ND и сразу же смешайте его с сухим кормом с помощью шпателя.
   ВНИМАНИЕ: Диэтиловый эфир вызывает раздражение глаз, кожи и дыхательных путей. Используйте только в химическом вытяжном шкафу.
4. Отмерьте еще раз 5 мл диэтилового эфира с помощью шприца 10 мл с иглой 20 г и добавьте его в стакан с холестерином объемом 10 мл, сразу же смешайте аспирацию вверх и вниз со шприцем.
5. Быстро добавьте раствор холестерина в стакан HCD и сразу же перемешайте его шпателем, пока раствор не станет однородным.
6. Оставьте стаканы в вытяжке на срок до 24 ч, чтобы полностью испарить диэтиловый эфир. На следующий день измельчите диеты GPAS на мелкие частицы, используя пестик и ступку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Измельчение рациона является решающим шагом, личинки не смогут съесть частицы размером более 50 нм.
7. Переложите каждую диету в небольшой пластиковый пакет с маркировкой или в центрифужную трубку объемом 50 мл и храните при -20 °C.

2. Индукция НАСГ при кратковременной кормлении личинок обогащенной холестерином диетой - статические условия.

1. Установите трансгенные рыбные линии в день -1 (табл. 1). На следующее утро (День 0), после того, как рыба нерестится, соберите икру в сетчатое ситечко.
2. Используя бутылочку для мытья с эмбриональной водой (E3), тщательно промойте яйца и аккуратно перенесите яйца в 10 см чашку Петри со средой E3.
3. Очистите пластины от всего мусора, который мог скопиться в ящиках для размножения, включая любые мертвые или неоплодотворенные яйца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Промывание яиц и очистка пластин имеет решающее значение для предотвращения неконтролируемого роста микроорганизмов и последующих дефектов развития личинок.
4. Разделить яйца на плотность 70/80 на 10 см чашки Петри (в 25 мл Е3). На 1-й день под рассечением, оснащенным трансиллюминационной базой, проверяют и очищают мертвые эмбрионы или эмбрионы с дефектами развития.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте режим трансиллюминации основания темного поля для идентификации эмбрионов с эффектами развития и для проверки роста микроорганизмов в пластинах. Различные объекты имеют разный выход микроорганизмов в своих системах. При необходимости измените среду E3 и/или посуду, чтобы избежать негативных последствий.
5. На 5-й день смешайте личинок со всех блюд в чашке Петри 15 см, добавьте Е3 без метиленового синего. Далее разделите личинок в кормовых ящиках следующим образом (таблица 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В контрольных условиях, чтобы генерировать здоровых личинок, не вызывая системного хронического воспаления, личинок следует кормить примерно 0,1 мг пищи на личинок в день. Обратите внимание, что общее количество пищи (таблица 2) делится поровну на два кормления в день.
6. Держите личинок в инкубаторе при 28 °C, в цикле темного света (например, 14-часовой светлый / 10-часовой темный цикл) и кормите личинок два раза в день с 5-го по 12-й день.
7. Аспирируйте ежедневно любой пищевой мусор, а также 90-95% среды с помощью вакуумной системы, прикрепленной к наконечнику пипетки объемом 1 мл. Затем аккуратно налейте новый Е3 без метиленового синего в один угол кормовой коробки, чтобы не повредить личинок.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ежедневная уборка ящиков для кормления имеет решающее значение, чтобы избежать неконтролируемого роста микроорганизмов.

3. Сбор 13 дней после оплодотворения личинок из кормовых ящиков.

1. На 13-й день приготовьте коллекционные блюда в соответствии с количеством экспериментальных условий, которые были созданы. С помощью перманентной маркерной ручки сделайте отметку на стороне посуды (крышка и дно), чтобы избежать переключения образцов, например, одна черная полоса для обычного рациона (ND) и две черные полосы для HCD.
2. Налейте достаточно Е3 без метиленового синего, чтобы покрыть дно каждого блюда. Осторожно используя вакуумную систему, аспирируйте воду из кормовых ящиков, постарайтесь аспирировать любой мусор или мертвые личинки со дна, чтобы избежать переноса этих материалов в коллекционную посуду.
3. Когда уровень воды начнет снижаться, медленно поднимите кормовой ящик, чтобы личинки заплыли к одному из углов, затем аспирируют в обратном направлении.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте пипетку 1 мл с режущими наконечниками на разной высоте, чтобы обеспечить различные диаметры при аспирации воды. Чередуйте различные размеры, начинайте с большего диаметра и меняйте на меньший по мере уменьшения объема воды и увеличения плотности личинок.
4. Как только останется всего около 20-30 мл жидкости, тщательно отфильтруйте личинки в чашку Петри, приготовленную на этапе 1. Поместите маркированную ленту из коробки для кормления на крышку тарелки.
5. Повторите шаги 3.2-3.4 для всех ящиков для кормления.

4. Контрольный анализ для диетического стеатоза печени - окрашивание, визуализация и оценка Oil Red O (ORO).

1. Используя стеклянную пипетку Пастера, переложите 15-20 личинок в трубку круглого дна объемом 2 мл и поместите на лед примерно на 15-30 мин. Извлеките большую часть среды из трубки.
2. Добавьте 2 мл 4% параформальдегида (PFA) для фиксации личинок и инкубируйте при 4 °C в течение ночи.
3. На следующее утро удалите 4% раствор PFA и трижды промойте личинки 2 мл 1x PBS.
4. Подготовьте пластину из 12 скважин (рисунок 2А) для каждого состояния с одной сетчатой вставкой.
5. Используя стеклянную пипетку, перенесите личинку из трубки 2 мл на вставку, предварительно помещенную в лунку, добавьте 5 мл 1x PBS. Сохраните пробирки по 2 мл для хранения образцов после окрашивания.
   ВНИМАНИЕ: Личинки чрезвычайно липкие на этом этапе не используйте пластиковые пипетки.
6. Переложить вставку с личинками в другую лунку с 5 мл 60% раствора изопропанола. Инкубировать личинок в течение 30 мин комнатной температуры (RT).
7. Тем временем приготовьте 0,3% Oil Red O в 60% растворе изопропанола. Дважды процедите 0,3% раствор Oil Red с помощью шприцевого фильтра 0,45 мкм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте 5 мл раствора на скважину, смешав 3 мл 0,5% Oil Red O в изопропаноле с 2 мл дистиллированной воды. 0,3% Oil Red O в 60% растворе изопропанола необходимо приготовить в свежеприготовленном виде.
8. Далее перекладывают сетчатую вставку с личинками в другую лунку с 5 мл свежеприготовленного 0,3% масла Red O в 60% растворе изопропанола. Насиживают личинки в течение 3 ч на РТ с нежным раскачиванием.
9. После окрашивания ОРО промыть личинок, перенеся вставку в другую лунку с 60% изопропанолом. Промывайте личинки дважды в 60% изопропаноле в течение 30 мин каждый раз, последовательно перенося вставку в лунки с 60% изопропанолом.
10. Промыть личинки три раза в течение 5 мин в 1x PBS-0,1% анимации, последовательно перенося вставку в лунки с 1x PBS-0,1% Tween.
11. Перенесите личинок в трубки по 2 мл. Удалите PBST, добавьте 1 мл 80% глицерина и храните при температуре 4 °C до получения изображения.
12. Для лучшей визуализации перенесите личинки в 1x PBS-0,1% Tween и под рассеченной областью рассекайте печень, тщательно вытягивая ткани с помощью двух щипцов #55.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании Casper фоновая визуализация может быть выполнена с использованием целых личинок.
13. Используя стеклянную пипетку, аккуратно переложите печень в лунку фарфоровой пластины с 50% глицерином. Позиционируйте печень с помощью небольшого инструмента для манипулирования личинками (например, инструмент для ресниц - рисунок 2B). Изображение печени в стереомикроскопе, оснащенном цветной камерой.
14. Оценка стеатоза печени (нет окрашивания ORO = нет; светло-красное окрашивание ORO = мягкое; красно-темно-красное окрашивание ORO = умеренное/тяжелое).

5. Неинвазивная конфокальная визуализация с использованием устройства для ранирования и захвата рыбок данио для роста и визуализации (zWEDGI).

1. Приготовьте 10 см чашку Петри с 15-20 мл 1x Tricaine-E3, ровно столько, чтобы покрыть дно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 1x рабочий раствор трикаина-Е3 (0,16 мг/мл) может быть получен путем разбавления 2 мл 25-кратного раствора трикаина (4 мг/мл) в 48 мл E3. Концентрация трикаина не должна превышать 0,16 мг/мл, так как личинки чрезвычайно чувствительны к анестезии на этой стадии развития.
2. Переложите 15-20 личинок пластиковой пипеткой Пастера в чашку Петри, содержащую 1x Tricaine-E3, и обезболивайте личинок в течение 5 мин.
3. Приготовьте 6-луночную пластину с 2-3 мл Е3 без метиленового синего на лунку.
4. На флуоресцентном стереомикроскопе проведите скрининг анестезированных личинок на наличие желаемых флуоресцентных маркеров (таблица 1). Перенесите экранированных личинок в минимальном количестве трикаина в Е3 и дайте им восстановиться в 6-луночной пластине, пока не придет время для изображения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Скрининг двойных, тройных и четверных трансгенных личинок требует времени, помещает личинок в E3 и часто меняет среду с пластины 6 лунок, чтобы уменьшить ненужное воздействие трицина. Кроме того, личинки на этой стадии развития плавают, поэтому используйте инструмент для ресниц, чтобы позиционировать личинок для скрининга, не вызывая повреждения тканей.
5. После скрининга приготовьте чашку Петри 10 см с 25 мл 1x Трикаина-Е3. Переложите 15-20 личинок пластиковой пипеткой Пастера в чашку Петри, содержащую 1x Tricaine-E3, и обезболивайте личинок в течение 5 мин.
6. Между тем, под стереомикроскопом добавляют 1x Трикаин-Е3 в камеры ранящего и улавливающего устройства (например, zWEDGI)^15,16. Удалите пузырьки воздуха из камер и удерживающего туннеля с помощью микропипетки P200. Удалите все излишки 1x Трикаина-Е3, оставив только достаточный объем для заполнения камер.
7. Перенесите обезболенную личинку в загрузочную камеру zWEDGI и расположите ее с помощью инструмента для ресниц под стереомикроскопом. Осторожно постучите по голове личинок и толкните ее так, чтобы хвост вошел в удерживающий туннель. Кроме того, с помощью микропипетки удалите 1x Tricaine-E3 из камеры ранения, чтобы помочь личинке войти в туннель. Убедитесь, что личинка расположена соответствующим образом для визуализации левой доли - Инвертированный микроскоп: левая сторона обращена вниз; Вертикальный микроскоп: левая сторона обращена вверх.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если zWEDGI недоступен, рыба может быть установлена и позиционирована в агарозе с низкой температурой плавления 1% в 1x Tricaine-E3, однако погружение в агарозу можно использовать только для быстрой визуализации (до 15 мин).
8. Для анализа гепатоцитов и ядерной морфологии визуализируйте печень с помощью конфокального микроскопа с использованием 40-кратного воздушного объектива и z-стеков оптических сечений 2 мкм. Для анализа морфологии печени, ангиогенеза и рекрутирования иммунных клеток изображения печени с использованием 20-кратного воздушного объектива и z-стеков оптических сечений 5 мкм. Для личинок с большой печенью следует сделать 2 х 2 изображения плитки, чтобы обеспечить визуализацию всей печени и прилегающей области 75 мкм.
9. После визуализации используйте пластиковую пипетку Пастера с 1x Tricaine-E3, чтобы вытащить личинку из удерживающего туннеля и перейти в чашку Петри с E3 без метиленового синего.

6. Анализ морфологических вариаций печени.

ПРИМЕЧАНИЕ: Перечисленные ниже этапы выполняются для количественной оценки площади поверхности и объема печени:

1. Откройте программное обеспечение для обработки изображений. Добавьте папку, содержащую файлы изображений для анализа, в Arena , выбрав значок папки Observe . Затем, щелкнув правой кнопкой мыши по миниатюрам, выберите Конвертировать в родной формат файла Imaris для преобразования файлов в формат (.ims).
2. В подменю Surpass отрегулируйте яркость и контрастность для каждого канала. Затем создайте поверхность из печени, нажав на синюю кнопку Добавить новые поверхности .
3. Затем на панели создания поверхности выберите Сегментировать только область, представляющую интерес , чтобы вручную создать поверхность печени.
4. Нажмите Пропустить автоматическое создание | Редактировать вручную . Выберите «Контур» и снимите флажок «Громкость» на панели сцены.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Опция просмотра тома должна быть не выбрана, иначе выбор интересующей области в разных z-стеках не будет возможен.
5. Перемещайтесь по z-стекам и рисуйте интересующую область в каждой плоскости, выбрав Режим, выберите предпочитаемый режим рисования. Чтобы начать рисование, измените указатель на Режим выбора , а не Навигатор, нажмите «Нарисовать» и начните перетаскивать указатель через печень, чтобы нарисовать рентабельность инвестиций.
6. После выбора ROI в различных фокальных плоскостях выберите Создать поверхность , чтобы объединить все выбранные ROI и создать поверхность печени.
7. Далее с помощью вновь созданной поверхности создают маску сигнала гепатоцитов. Нажмите на поверхность и под вкладкой Правка (карандаш) выберите «Маскировать все». В появившемся окне выберите канал, который вы хотите замаскировать, который будет использоваться для количественной оценки объема печени и площади поверхности. Затем установите для параметра вокселы на внешней поверхности значение 0 и установите флажок Дублировать канал перед применением маски.
8. Для анализа используйте значения площади поверхности печени и объема печени из меню статистического анализа.

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие шаги для количественной оценки области печени.

9. Откройте программное обеспечение Фиджи. В меню Плагины выберите Биоформаты , за которыми следует Импортер биоформатов, установите флажок Разделить каналы, чтобы открыть файл изображения.
10. В меню Изображение выберите пункт Свойства , чтобы убедиться, что изображение имеет правильный размер пикселя и глубину вокселя, если не правильные значения. Затем перейдите в меню изображений, нажмите « Настроить », а затем «Яркость и контрастность», отрегулируйте яркость и контрастность изображения.
11. Далее с помощью канала гепатоцитов создают максимальную интенсивность проекции печени. Перейдите в меню «Изображения», нажмите « Стеки», а затем «Z Project». Выберите Проекция максимальной интенсивности.
12. Используя инструмент свободного выбора, вручную создайте область интереса (ROI), окружающую личиночную печень. Далее в меню Анализ нажмите на Измерить , чтобы получить область печени. Сохраните результаты в виде электронной таблицы для дальнейшего анализа.

7. Гепатоцитарный и ядерный морфологический анализ.

1. Откройте программное обеспечение Фиджи. В меню Плагины выберите Биоформаты , а затем установите флажок Импортер биоформатов на Разделенных каналах, чтобы открыть файл изображения.
2. В меню Изображение выберите пункт Свойства , чтобы убедиться, что изображение имеет правильный размер пикселя и глубину вокселя, если не правильные значения. Затем перейдите в меню «Изображения», нажмите « Настроить », а затем «Яркость и контрастность», отрегулируйте яркость и контрастность изображения.
3. В меню Анализ выберите галочку Установить измерения для всех параметров, которые вы хотите проанализировать (например, дескрипторы области, периметра и формы). Выделяют флуоресцентный канал мембраны гепатоцитов. Перемещаясь по Z, используйте инструмент свободного выбора, чтобы нарисовать идеальную рентабельность инвестиций вокруг одного гепатоцита. Далее в меню Анализ нажмите на Измерить , чтобы рассчитать площадь гепатоцитов.
4. Повторите шаг 7.3 на 15-30 гепатоцитов. Сохраните результаты в виде электронной таблицы для дальнейшего анализа.
5. Далее выбираем ядро флуоресцентного канала. Перемещаясь по Z, используйте инструмент свободного выбора, чтобы нарисовать идеальную рентабельность инвестиций вокруг ядра гепатоцита. Затем в меню Анализ нажмите на Измерение , чтобы рассчитать ядерную площадь и цикличность.
6. Повторите шаг 7.5 на 15-30 гепатоцитов. Сохраните результаты в виде электронной таблицы для дальнейшего анализа, включая количественную оценку соотношения ядерный/цитоплазматический.
7. Оценка образцов на наличие микроядер и грыж выглядит следующим образом (таблица 3).

8. Анализ ангиогенеза.

1. Вручную создайте поверхность для печени, как описано в разделе 6 этого протокола. Назовите эту поверхность «Поверхность печени».
2. Создайте маску для сигнала эндотелиальных клеток внутри печени. Нажмите на поверхность и под вкладкой редактирования (карандашом) выберите «Маскировать все». В появившемся окне выберите канал эндотелиальных клеток, чтобы изолировать сигналы сосудов только от печени. Установите для параметра внешней поверхности вокселей значение 0 и установите флажок Дублировать канал перед применением маски.
3. Переименуйте новый замаскированный канал эндотелиальных клеток в Сосудистую систему печени.
4. Для измерения объема сосуда и площади поверхности создайте вторую поверхность. Нажмите на синюю кнопку Добавить новые поверхности . На первом этапе создания поверхности убедитесь, что все параметры не выбраны, чтобы автоматически создать поверхность.
5. На втором шаге выберите сосудистый канал печени, чтобы создать поверхность. Снимите флажок сглаживания, чтобы обнаружить как можно больше деталей с судов и включить вычитание фона в параметре пороговых значений.
6. Отрегулируйте пороговое значение, гарантируя, что обнаруженная поверхность колокализуется с сигналом сосудистой системы печени. Используйте значения площади поверхности и объема из меню статистического анализа. Рассчитайте индекс плотности судна, используя следующие уравнения:
   Индекс плотности сосудов (по печени²) = (Площадь поверхности сосуда (мкм²)) / (Площадь поверхности печени (мкм²))
   Индекс плотности сосудов (по печени³) = (Объем сосуда (мкм³)) / (Объем печени (мкм³))

9. Анализ рекрутирования иммунных клеток.

1. Откройте программное обеспечение Фиджи. В меню Плагины выберите Биоформаты , а затем установите флажок Импортер биоформатов на Разделенных каналах, чтобы открыть файл изображения.
2. В меню Изображение выберите пункт Свойства , чтобы убедиться, что изображение имеет правильный размер пикселя и глубину вокселя, если не правильные значения. Затем перейдите в меню «Изображения », нажмите « Настроить », затем «Яркость и контрастность», отрегулируйте яркость и контрастность изображения (например, макрофаги - mCherry или dTomato; нейтрофилы - BFP; Т-клетки - EGFP; гепатоциты – EGFP или mCherry).
3. Затем создайте проекции максимальной интенсивности для каждого канала.
4. Как описано в разделе 6 (Шаги 6.9-6.12), создайте ROI, окружающий личиночную печень, и измерьте площадь печени. Создайте вторую рентабельность инвестиций, включая область печени и окружающую область 75 мкм («Область набора»).
5. Далее в меню Правка выберите опцию Выбрать , а затем Добавить в менеджер. Выбрав проекцию максимальной интенсивности канала врожденных иммунных клеток, нажмите на ROI печени в окне ROI Manager, чтобы задать область набора.
6. В меню Плагины выберите опцию Анализ , за которой следует Счетчик клеток и подсчитайте иммунные клетки в области Рекрутинг. Запишите количество рекрутированных иммунных клеток в область печени в электронной таблице.
7. Рассчитайте плотность нейтрофилов, макрофагов и Т-клеток путем нормализации количества иммунных клеток на площадь печени.

Результаты

Путем введения кратковременной диеты с высоким содержанием холестерина в модель рыбок данио с гепатоцеллюлярной карциномой (ГЦК), которая чрезмерно экспрессирует гепатоцитную специфическую конститутивно активную форму бета-катенина (s704Tg; Tg(fabp10a:pt-B-cat, cryaa:Venus)¹⁷, мы можем создать модель позвоночных, не относящуюся к млекопитающим, с НАСГ-ассоциированным ГЦК. Прогрессирование заболевания печени можно контролировать на ранней стадии путем измерения стеатоза печени, размера печени, гепатоцитов, ядерной морфологии, ангиогенеза и инфильтрации иммунных клеток (рисунок 1).

Личинки ГЦК, питающиеся нормальной диетой, не показывают легкого стеатоза печени, измеренного окрашиванием Oil Red O. Однако личинки ГЦК, которых кормили диетой с высоким содержанием холестерина, показывают значительное увеличение стеатоза печени (рисунок 2).

Известным маркером заболевания печени является гепатомегалия¹⁷. Чтобы оценить размер печени, личинки ГЦК могут быть скрещены трансгенной линией, специально экспрессирующей флуоресцентный маркер на гепатоцитах, таких как Tg(fabp10a: H2BmCherry). Для оценки гепатомегалии проводится оценка области печени (2D), площади поверхности печени и объема печени (3D). После 8 дней воздействия избытка холестерина у личинок ГЦК наблюдалось увеличение печени (рисунок 3).

Используя неинвазивную живую визуализацию, трансгенные линии рыб, экспрессирующие флуоресцентные белки в мембранах гепатоцитов (таких как Tg(fabp10a:Life-actin-EGFPP) и в ядрах гепатоцитов (таких как Tg(Fabp10a:H2B-mCherry), могут быть использованы для оценки изменений клеточной и ядерной морфологии, связанных со злокачественностью в гепатоцитах. Площадь гепатоцитов была увеличена в НАСГ-ассоциированном ГЦК (Рисунок 4A,B,D), а также в ядерной области (Рисунок 4C,E) и соотношении ядерный:цитоплазматический (Рисунок 4F). Значительное снижение ядерной циркулярности наблюдалось также в группе HCD+HCC (рисунок 4G). Липотоксичность провоцирует повреждение ДНК, особенность канцерогенеза в присутствии микроядер. Используя маркер H2B-mCherry, мы наблюдали большую частоту микроядер у личинок ГЦК, которых кормили диетой с высоким содержанием холестерина (рисунок 4H).

Печеночная сосудистая система может быть легко оценена в моделях рыбок данио с использованием трансгенной помеченной линии, такой как Tg (kdrl: mCherry или Tg (fli: EGFP), которые маркируют сосудистую систему. Значительное увеличение плотности сосудов наблюдалось у личинок ГЦК+HCD (рисунок 5).

Чтобы наблюдать воспалительную реакцию, вызванную рано при НАСГ-ассоциированном ГЦК, трансгенная рыбья линия, экспрессирующая флуоресцентные белки в макрофагах и нейтрофилах, таких как Tg(mfap4: tdTomato-CAAX; lyz: BFP), была перекрещена трансгенной линией HCC. Инфильтрация нейтрофилов и макрофагов происходит как в ГЦК, так и в ГЦК, питаемых HCD, что оценивалось путем количественной оценки количества и плотности нейтрофилов/макрофагов в печени и окрестностях (окружающая область до 75 мкм) (Рисунок 6A-H). Тем не менее, ГЦК+HCD показал значительное увеличение числа и плотности нейтрофилов (рис. 6F-H). Через 13 дней после оплодотворения адаптивная иммунная система уже функционирует. Использование трансгенной рыбьей линии, экспрессирующей флуоресцентный белок в Т-клетках, таких как Tg(lck: EGFP), и в сочетании с трансгенной линией HCC; мы оценили влияние избытка холестерина на рекрутирование Т-клеток в печень. Значительное снижение плотности Т-клеток и общего количества наблюдалось у личинок ГЦК, питавшихся HCD (рисунок 6I-K).

Трансгенные линии рыбок данио	Справочник ZFIN	Проба
Каспер	ройа9; митфаw2	Стеатоз печени
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Венера / fabp10a:H2B-mCherry )	s704Tg / uwm41Tg	Морфология печени
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Венера; fabp10a:H2B-mCherry; fabp10a:LIFEACT-EGFP)	s704Tg / uwm41Tg / uwm42Tg	Гепатоциты и ядерная морфология
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_ cryaa:Venus; fli:EGFP)	s704Tg / y1Tg	Ангиогенез
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Венера;  mfap4: Помидор-CAAX; lyzC:BFP)	s704Tg / xt6Tg / zf2171Tg	Рекрутирование макрофагов и нейтрофилов
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Венера; lck:EGFP)	s704Tg / cz1Tg	Набор Т-клеток

Таблица 1: Трансгенные линии рыбок данио для использования в различных анализах.

Количество личинок	Размер ящика для кормления	Количество пищи в сутки (мг)	E3 Объем (мл)
30-40	Маленькая гнездовая коробка	3-4	200
60-80	Маленькая/Большая племенная коробка	6-8	400
100-150	Большая племенная коробка	10-15	500

Таблица 2: Настройка условий кормовых ящиков.

Фенотип	Метод подсчета очков
Никакой	Нормальные ядра, без микроядер или грыжи
Легкая	Низкое количество микроядер (менее 5 на поле зрения) и/или грыжи
Умеренный/ Тяжелый	Умеренное или высокое количество микроядер (более 5 на поле зрения) и/или грыжи

Таблица 3: Оценка микроядер и ядерных грыж.

Рисунок 1: Диаграмма протокола, обобщающая основные экспериментальные шаги и подход к анализу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Контрольный анализ на стеатоз печени - окрашивание ORO. Личинок ГЦК кормили нормальной или высокой холестериновой диетой, а окрашивание Oil Red O (ORO) проводили для оценки стеатоза печени. (A) Схема пластины из 12 скважин для выполнения последовательного окрашивания ORO с использованием сетчатых вставок скважины. (B) Изображение инструмента для ресниц, используемого для манипулирования личинками. (C) Репрезентативные изображения печени, окрашенной масляным красным цветом; Личинки HCC и HCC+HCD. (D) График хи-квадрата, показывающий процент личинок с различной оценкой стеатоза печени. Шкала bar= 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Репрезентативные изображения из размера печени. Трансгенные личинки HCC, экспрессирующие маркер печени (Tg(fabp10a: H2B-mCherry)), были визуализированы живыми и неинвазивными, на конфокальном микроскопе с перевернутым вращающимся диском с использованием zWEDGI. (A) Репрезентативные 3D-реконструкции печени у личинок ГЦК и ГЦК+HCD. (Б-Д) График, показывающий морфологические изменения печени, включая площадь печени (B), площадь поверхности печени (C) и объем печени (D) в личинках HCC и HCC + HCD. Шкала = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Репрезентативные изображения из гепатоцитов и морфологии ядер. Были изображены трансгенные линии ГЦК, экспрессирующие флуоресцентные белки в мембранах гепатоцитов (Tg(fabp10a:Life-actin-EGFP) и в ядрах гепатоцитов (Tg(fabp10a:H2B-mCherry). (А-С) Репрезентативные 3D-реконструкции F-актина и ядер гепатоцитов личинок ГЦК и ГЦК+HCD. Открытые наконечники стрел показывают увеличенные ядра; белые наконечники стрелок показывают ядро с измененной формой; а красные стрелки показывают микроядра и ядерные грыжи. (Д-Г) Графики, показывающие средние параметры клеток и ядер в 13-дневных личинках ГЦК и ГЦК+HCD. (D) Область гепатоцитов. e) Ядерная зона. (F) Соотношение ядерных к цитоплазме. G) Ядерный циркуляр. Каждая точка представляет собой среднее значение на личинку. Точечные графики показывают графики среднего ±SEM (H) Хи-квадрата, показывающие процент личинок с различной оценкой микроядер и ядерной грыжи. Шкала = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Репрезентативные изображения из печеночной сосудистой системы. Трансгенные линии ГЦК, экспрессирующие флуоресцентные белки в ядрах гепатоцитов (Tg(Fabp10a:H2B-mCherry) и в эндотелиальных клетках (Tg)fli:EGFP)). (A) Репрезентативные 3D-реконструкции печеночной сосудистой системы у личинок ГЦК и ГЦК+HCD. (Б-С) График, показывающий индекс плотности сосудов по площади поверхности печени (B) объем (C) в личинках HCC и HCC+HFCD. Точечные графики показывают среднее ±SEM. Шкала = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Репрезентативные изображения из ландшафта иммунных клеток печени. Трансгенная линия HCC, экспрессирующая флуоресцентные белки в макрофагах и нейтрофилах (Tg(mfap4:tdTomato-CAAX; lyz:BFP) или в Т-клетках (Tg(lck-EGFP). (А,С,Ф) Репрезентативные 3D-реконструкции печени и рекрутирование лейкоцитов в область печени у 13-дневных личинок ГЦК и ГЦК+HCD. (B) Диаграмма изображенной области печени. (Д-Е) График, показывающий плотность макрофагов (D) и количество (E) в области печени у личинок ГЦК и ГЦК+HCD. (Г-Н) График, показывающий плотность нейтрофилов (G) и количество (H) в области печени у личинок ГЦК и ГЦК+HCD. (G) Репрезентативные 3D-реконструкции рекрутирования Т-клеток в область печени у личинок ГЦК и ГЦК+HCD. (Н-И) График, показывающий плотность Т-клеток (H) и количество (I) в области печени у личинок ГЦК и ГЦК+HCD. Точечные графики показывают среднее значение ±SEM. Шкала = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительная таблица 1: Таблица буферов и решений Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Обсуждение

С увеличением заболеваемости ГЦК, в частности ГЦК, индуцированного НАСГ, очень важно иметь более эффективные модели для изучения клеточных и молекулярных механизмов, участвующих в НАСГ-ассоциированном ГЦК. Деконволюция клеточно-клеточных взаимодействий в печени имеет решающее значение для лучшего понимания прогрессирования заболевания печени и гепатокарциногенеза. Подход, описанный в этом протоколе, предлагает уникальный способ анализа прогрессирования заболевания печени in vivo и неинвазивно.

Подготовка диеты имеет решающее значение для успеха создания модели ГЦК, связанной с НАСГ. Важно, чтобы диэтиловый эфир полностью испарился внутри вытяжного шкафа, чтобы избежать вредного воздействия, при подготовке диет для рыбок данио. Чтобы использовать эти диеты с личинками (через 5-12 дней после оплодотворения), крайне важно измельчить рацион на мелкие частицы, чтобы обеспечить потребление пищи личинками. Использование флуоресцентно помеченных аналогов жирных кислот может быть использовано для оценки потребления пищи личинками.

Прежде чем помещать личинок в гнездовые ящики и начинать процедуру кормления, крайне важно убедиться, что экспериментальный отбор проб униформирован путем смешивания личинок с разных пластин. Этот шаг важен, так как различные микросреды, начиная с дня 0, продвигаются в каждой из пластин и могут влиять на воспалительную реакцию.

Еще одним важным шагом является подсчет личинок, чтобы знать, сколько пищи необходимо для каждой кормовой коробки. Если количество пищи не соответствует количеству личинок, присутствующих в каждой коробке, произойдет один из двух сценариев: 1) личинки будут недокормлены; 2) личинки будут перекормлены. Неточное кормление приведет к нездоровым состояниям, связанным с недоеданием или перееданием, таким как воспаление, которое резко повлияет на микросреду печени. Если происходит неточное кормление, личинки будут демонстрировать проблемы с движением. На этом этапе развития личинки должны интенсивно плавать, поэтому, если замечены проблемы с движением, личинки были подняты в нездоровых условиях (недоедание или воздействие токсичных доз холестерина из-за перекорма). По этой причине процедуры кормления необходимо жестко контролировать как для рациона, так и для обогащенного холестерином. Некоторые анализы могут быть выполнены для быстрого определения точности кормления и здоровья личинок, включая наличие гепатомегалии (размер печени) и воспаление тканей и органов, особенно печени и кишечника (видимая повышенная инфильтрация нейтрофилов и макрофагов).

Ежедневная очистка и замена 95% E3 имеет решающее значение для уменьшения роста микроорганизмов в кормовых ящиках и улучшения здоровья и выживания личинок. В качестве альтернативы, личинки могут быть помещены в автономную стоечную систему. Для достижения наилучших результатов поместите 60-80 личинок в 3-литровый бак. Поддерживайте поток воды на минимальном уровне, регулируя поток в режим быстрого капания и кормя личинок по 3-4 мг два раза в день (АМ и ПМ). Поток воды следует регулярно проверять, чтобы обеспечить правильный поток в каждом резервуаре. В нашей лаборатории этот метод дает нам 95-100% выживаемость при кратковременном кормлении 10% HCD. Кроме того, этот метод значительно снизил нагрузку, присущую ежедневной уборке и водообмену, необходимым в описанном статическом протоколе кормления.

В то время как мы использовали 10% обогащенную холестерином диету, чтобы вызвать НАСГ при краткосрочном воздействии (5 дней достаточно, чтобы вызвать стеатогепатит), изменения в диете могут быть выполнены и расширены для использования фруктозы ¹⁸, жирных кислот (таких как пальмитиновая кислота) ¹⁹ или протоколов кормления, которые могут быть расширены с использованием диеты, обогащенной холестерином⁴%. В настоящее время существует несколько успешных терапевтических целей для ГЦК и ни одной для НАСГ. Использование моделей рыбок данио дает уникальную возможность расширить наши знания о гепатокарциногенезе, а также беспрецедентную систему позвоночных для проведения скрининга лекарств с большой пропускной способностью. Методы, описанные в этом протоколе, облегчат будущие результаты и терапевтические цели для заболеваний печени и гепатокарциногенеза.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Холестерин	Sigma	C8667-25G	легко разлагается. Хранение -20°С.
Комплект носителей Corning Netwells 15 мм	Fisher	07-200-223
Вкладыши Corning Netwells	Fisher	07-200-212
Диэтиловый эфир	Fisher	60-046-380	Высоколетучий.
Щипцы Dumont #55 dumostar	Fisher	NC9504088
Fisherbrand Pasteur Pipets 5.75in	Fisher	22-183624
4% параформальдегид (PFA)	Электронная микроскопия	Наука 15710
Золотая жемчужина Диета 5– 50 нм Active Spheres	Brine Shrimp Direct	-	Можно использовать любой коммерческий сухой порошковый корм для личинок.
Дифференцированные трансферные пипетки	Fisher	22-170-404
изопропанол	Fisher	BP26181
PBS, pH7.4, 10X, 10 Pack	Crystalgen	221-1422-10
Чашки Петри 100X20MM	Fisher	08-747D
Трикаин	Sigma	A-5040
Tween 20	Fisher	BP337-500
Масло красное O раствор 0,5% изопропанол	Sigma	O1391-500ML
Трикейн	Sigma	A-5040
Tween 20	Fisher	BP337-500
Vactrap	VWR	76207-630	Вакуумная система для сбора личинок
<сильно>микроскопы
флуоресцентный стереомикроскоп	Leica	M205 FCA THUNDER Imager Модель организма Большой
вращающийся диск Конфокальный микроскоп	Nikon	CSU-W1
Стереомикроскоп	Leica	S9i с транслюминированным основанием
Software
Fiji	Программа обработки изображений Java с открытым исходным кодом.
Imaris 9.6	Bitplane; Оксфорд Инструментс.