Метод культуры органов типа Троуэлла был использован для разгадки сложных сигнальных сетей, которые управляют развитием зубов, и, в последнее время, для изучения регуляции, связанной со стволовыми клетками постоянно растущего мышиного резца. Флуоресцентно-репортерные животные модели и методы визуализации в реальном времени облегчают углубленный анализ стоматологических стволовых клеток и их конкретной нишевой микросреды.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Использование культуры органов типа Trowell для изучения регуляции стоматологических стволовых клеток
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Развитие, функция и регенерация органов зависят от стволовых клеток, которые находятся в дискретных анатомических пространствах, называемых нишами стволовых клеток. Постоянно растущий мышиный резец обеспечивает отличную модель для изучения тканеспецифических стволовых клеток. Эпителиальные тканеспецифические стволовые клетки резца расположены на проксимальном конце зуба в нише, называемой шейной петлей. Они обеспечивают непрерывный приток клеток для уравновешивания постоянного истирания самозатачивающегося кончика зуба. Здесь представлен подробный протокол выделения и культивирования проксимального конца мышиного резца, в котором находятся стволовые клетки и их ниша. Это модифицированный протокол посева органов типа Trowell, который позволяет выращивать in vitro кусочки ткани (экспланты), а также толстые срезы ткани на границе раздела жидкость/воздух на фильтре, поддерживаемом металлической сеткой. Протокол посева органов, описанный здесь, позволяет проводить манипуляции с тканями, невозможные in vivo, и в сочетании с использованием флуоресцентного репортера (репортеров) он обеспечивает платформу для идентификации и отслеживания дискретных популяций клеток в живых тканях с течением времени, включая стволовые клетки. Различные регуляторные молекулы и фармакологические соединения могут быть протестированы в этой системе на предмет их влияния на стволовые клетки и их ниши. Это в конечном итоге обеспечивает ценный инструмент для изучения регуляции и поддержания стволовых клеток.
Введение
Мышиные резцы непрерывно растут благодаря пожизненному сохранению стволовых клеток (SC), которые поддерживают непрерывное производство компонентов зуба. К ним относятся эпителиальные СК, которые генерируют эмал-продуцирующие амелобласты, и мезенхимальные стволовые клетки (МСК), которые генерируют дентин-продуцирующие одонтобласты, среди других клеток1. Эпителиальные СК в непрерывно растущих резцах были первоначально идентифицированы как клетки, удерживающие метку 2,3, и с тех пор было показано, что они экспрессируют ряд хорошо известных генов стволовости, включая Sox24. Эти клетки имеют общие черты с эпителиальными СК в других органах и находятся в нише SC, называемой шейной петлей, расположенной на губной стороне резца. Ниша представляет собой динамическую сущность, состоящую из клеток и внеклеточного матрикса, которые контролируют активность SC5. Исследования по отслеживанию линии показали, что эпителиальные СК Sox2+ могут регенерировать весь эпителиальный компартмент зуба и что они имеют решающее значение для формирования сукцессионного зуба 6,7. МСК с репаративным или регенеративным потенциалом дентина в значительной степени набираются извне органа через кровеносные сосуды и нервы 8,9,10,11, что обеспечивает подходящую модель для изучения вербовки, миграции и жилья популяции MSC.
Изучить СК in vivo не всегда возможно, так как многие генетические и/или фармакологические манипуляции могут влиять на гомеостаз органов и/или иметь летальные последствия. Поэтому органная культура является отличным инструментом для изучения регуляции СК и их ниш in vitro. Система культуры органов, которая использует металлическую сетку, была первоначально разработана Trowell12 для изучения развития органов и была дополнительно модифицирована Saxen13 для изучения индуктивных сигналов в развитии почек. С тех пор этот метод культивирования всего или части органа in vitro успешно применяется в разных областях. В области развития зубов этот метод широко используется для изучения эпителиально-мезенхимальных взаимодействий, которые управляют развитием зуба14 и сукцессионным формированием зубов15. Работа лаборатории Thesleff продемонстрировала полезность этой системы для временного анализа роста и морфогенеза зубов, для анализа влияния различных молекул и факторов роста на рост зубов, а также для покадровой живой визуализации развития зубов16,17. Совсем недавно этот метод был использован для изучения регулирования резцовых СК и их ниши18,19, которая подробно описана здесь.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Этот протокол включает в себя использование животных, и все процедуры были одобрены Этическими комитетами по использованию и уходу за животными и Учреждением по защите животных в Университете Хельсинки.
1. Приготовление блюда для органной культуры
- Выполняйте все процедуры в ламинарной вытяжке. Очищайте рабочие поверхности 70% этанолом и используйте инструменты и растворы из автоклавного стекла. Стерилизуйте ножницы и другое металлическое оборудование в стерилизаторе из стеклянных шариков.
- Подготовьте фильтры, обычно хранящиеся в 70% этаноле, промыв их три раза в 1x PBS для удаления этанола (рисунок 1). Нарежьте фильтры на прямоугольные куски (3 x 3-5 x 5 мм).
ПРИМЕЧАНИЕ: Промытые части фильтра могут храниться в течение нескольких дней в 1x PBS при 4 °C. - Готовят культуральную среду (1:1 DMEM:F12 с добавлением 1% [v/v] 200 мМ L-аланил-L-глутамина дипептида в 0,85% NaCl, 10% [v/v] FBS, 150 мкг/мл аскорбиновой кислоты и 0,2% [v/v] пенициллина [10 000 I.U./мл] и стрептомицина [10 000 мкг/мл]). Хранить при температуре 4 °C.
- Поместите металлические сетки диаметром 30 мм (с отверстиями диаметром 1-2 мм, которые позволяют визуализировать ткани) в чашку Петри толщиной 35 мм. Добавьте достаточное количество среды, чтобы достичь поверхности сетки без образования пузырьков воздуха. Предварительно разогрейте приготовленную чашку для культивирования при 37 °C до тех пор, пока ткань не будет выделена и готова к культивированию (в стандартном инкубаторе с 5%CO2 и влажностью 90%-95%).
2. Рассечение резца и изоляция проксимального конца
- Приносите в жертву животных в соответствии с утвержденным протоколом ухода за животными.
- Обезглавить мышь и рассечь нижнюю челюсть. Для этого сначала удалите кожу, чтобы обнажить нижнюю челюсть и прорежьте мышцы массажера, чтобы отделить ее от верхней челюсти и остальной части головы.
- Как только нижняя челюсть выделена, удалите язык и как можно больше мягких тканей.
- Соберите все нижние челюсти и храните их в чашке Петри, содержащей PBS на льду, так как это повышает жизнеспособность тканей.
- Переложите одну нижнюю челюсть в стеклянную чашку Петри и используйте одноразовые иглы для подкожных инъекций 20/26 г для рассечения резца под стереомикроскопом. Расколите нижнюю челюсть по средней линии, разрезав симфиз. Очистите мягкую и мышечную ткань от поверхности кости для лучшей визуализации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стеклянная чашка Петри необходима, так как это не притупит иглы. - Нижние челюсти, полученные от животных моложе 10 дней, мягче и хрупче, поэтому используйте одноразовые иглы для подкожных инъекций 20/26 г, чтобы открыть каждую половину нижней челюсти продольно, чтобы обнажить резцовый зуб. Для мышей старше 10 дней используйте пинцет, чтобы схватить нижнюю челюсть и сломать кость, чтобы обнажить зуб.
- Аккуратно отсоедините резец от окружающей кости и отрежьте проксимальный конец, в котором находится шейная петля.
- Вырежьте проксимальный конец и удалите минерализованную эмаль и дентиновый матрикс.
- Храните собранные проксимальные концы в PBS Дульбекко на льду до тех пор, пока они не будут готовы к культуре.
3. Культура
- Аккуратно поместите прямоугольник фильтра поверх сетки в предварительно подогретую культурную посуду.
- Используйте стереомикроскоп, чтобы правильно сориентировать кусочки ткани.
- Поместите в стандартный инкубатор при температуре 37 °C с влажностью 5% CO2 и влажностью 90-95%.
- Меняйте среду через день и заменяйте свежей средой, тщательно избегая образования пузырьков воздуха. Следите за ростом тканей и ежедневно фотографируйте с помощью камеры, прикрепленной к стереомикроскопу.
4. Добавление растворимых факторов в культуру
- Дополнить питательную среду растворимыми факторами и молекулами, представляющими интерес, для изучения их влияния на регуляцию СК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол введения для любой молекулы (факторы роста, сигнальные молекулы, блокирующие антитела, фармакологические соединения, такие как ингибиторы или активаторы, векторы и т.д.) зависит от ее периода полувыведения и растворимости. Эти параметры также определяют соответствующий элемент управления, который будет использоваться.
5. Молекулярный и гистологический анализ
- Удалите культуральную среду.
- Осторожно добавляйте ледяной метанол в ткани, чтобы предотвратить отслоение от фильтров.
- Оставить метанол на 5 мин.
- Перенос фильтров, несущих тканевые экспланты, в пробоотборные пробирки.
- Зафиксируйте экспланты в 4% параформальдегиде в PBS в течение 10-24 ч при 4 °C.
- Приступают к установленным протоколам гистологической обработки (парафин, замороженность и т.д.) или иммуноокрашениям.
6. Культивирование срезов тканей
ПРИМЕЧАНИЕ: Существует несколько вариантов этого протокола, которые все одинаково успешны и являются вопросом личного выбора, в зависимости от скорости и мастерства пользователя. Они относятся к буферу, используемому для сбора и поддержания жизнеспособности тканей. Для этого можно использовать буфер Кребса, PBS, дополненный 2% глюкозой и антибиотиками, или PBS. Если используется буфер Кребса, его следует сделать за 1 день и держать при 4 °C.
- Перед экспериментом готовят 4%-5% агарозу с низкой температурой плавления путем растворения 2-2,5 г агарозы с низкой температурой плавления в 50 мл кипячения 2% глюкозы/ПБС, после чего раствор следует поместить на водяную баню при температуре 45 °С.
- Установите вибратом, промыть 70% этанолом и наполнить ледяным холодом 2% глюкозы / PBS, дополненным антибиотиками (100 ЕД / мл пенициллина, 100 мг / мл стрептомицина).
- Рассекните проксимальные концы резца и соберите их в ледяной 2% глюкозы / PBS, дополненной антибиотиками.
- Поместите один проксимальный конец резца в форму, содержащую 4%-5% агарозу с низкой температурой плавления. Под стереомикроскопом сориентируйте кусок в нужном направлении и оставьте на льду, чтобы агароза затвердела.
- Обрежьте затвердевший блок агарозы и поместите его в вибратом. Нарезать толстыми ломтиками (150-300 мкм).
- Соберите ломтики в чашку Петри, содержащую холодные 2% глюкозы / PBS, дополненные антибиотиками.
- Используйте шпатель для переноса толстых ломтиков на фильтрующий прямоугольник, помещенный на предварительно нагретую сетку, подготовленную, как в разделе 1.3.
- Инкубируйте толстые срезы в инкубаторе и приступайте к визуализации (рисунок 2).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Эпителиальные СК находятся в нише, называемой шейной петлей, которая расположена на проксимальном конце резца (рисунок 3А). Шейные петли представляют собой морфологически различные структуры, состоящие из внутреннего и наружного эпителия эмали, которые заключают в себе звездчатый ретикулум, ядро слабо расположенных эпителиальных клеток (рисунок 3B, C). В каждом резце есть две шейные петли (рисунок 3A), но только лаб...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Культура органов in vitro широко используется для изучения индуктивного потенциала и эпителиально-мезенхимальных взаимодействий, которые управляют ростом органов и морфогенезом. Лаборатория Thesleff продемонстрировала, как адаптировать саксенскую модификацию культуры органов типа Троуэлла и использовать ее для изучения развития зубов14. Воспроизводимые условия и достижения в области флуоресцентных репортеров сделали это полезным методом для мониторинга морфогенеза зубов и различных клеточ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Это исследование было поддержано Фондом Джейн и Аатоса Эркко.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Пластиковые шприцы | |||
| Одноразовые иглы для подкожных инъекций 20/26 калибра | Terumo | ||
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt | Gibco | 14287 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T. | 14084-08 | |
| F-12 | Gibco | 31765-027 | |
| FBS Южная Америка (CE) | LifeTechn. | 10270106 | делите на алициты, храните при -20°Д; C |
| Стерилизатор для стеклянных шариков, стерилизатор Steri 250 Seconds-Sterilizer | Simon Keller Ltd | 4AJ-6285884 | |
| GlutaMAX-1 (200 мМ L-аланил-L-глутамин дипептид) | Gibco | 35050-038 | |
| Isopore Polycarb.Фильтры, 0,1 мкм диаметром 25 мм | MerckMillipore | VCTP02500 | хранить в 70% этаноле при комнатной температуре. |
| L-аскобиновая кислота | Sigma | A4544-25g | разведенная на 100 мг/мл в MilliQ, фильтр стерилизованный и разделенный на 20&мкм; l Алициты, хранить в темноте, -20°С; C |
| Легкоплавкая агарозная | сетка TopVision | R0801 | |
| Металлические сетки | Коммерчески доступны, или самостоятельно изготовленные из сетки из нержавеющей стали (коррозионностойкая, размер ячейки 0,7 мм). Отрежьте диск диаметром примерно 30 мм и загните края, чтобы получить высоту 3 мм. С помощью гвоздей сделайте отверстия. | ||
| Микрощипцы | Medicon | 07.60.03 | |
| Параформальдегид | Сигма-Олдрич | ||
| Пенициллин-Стрептомицин (10 000 ед/мл) зол. | Gibco | 15140-148 | |
| Чашки Петри, Содово-Известковое стекло | DWK Life Sciences | 9170442 | |
| Петридиш 35 мм, с вентиляционным отверстием | Duran | 237554008 | |
| Petridish 90 мм, без вентиляционного отверстия классические | Thermo Fisher | 101RT/C | |
| Маленькие ножницы |
Ссылки
- Balic, A. Biology explaining tooth repair and regeneration: A mini-review. Gerontology. 64 (4), 382-388 (2018).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
- Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).
- Balic, A., Thesleff, I. Tissue interactions regulating tooth development and renewal. Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).
- Scadden, D. T. The stem-cell niche as an entity of action. Nature. 441 (7097), 1075-1079 (2006).
- Juuri, E., et al. Sox2 marks epithelial competence to generate teeth in mammals and reptiles. Development. 140 (7), 1424-1432 (2013).
- Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).
- Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).
- Kaukua, N., et al. Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system. Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).
- Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
- Vidovic, I., et al. alphaSMA-expressing perivascular cells represent dental pulp progenitors in vivo. Journal of Dental Research. 96 (3), 323-330 (2017).
- Trowell, O. A. A modified technique for organ culture in vitro. Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).
- Saxen, L., Vainio, T., Toivonen, S. Effect of polyoma virus on mouse kidney rudiment in vitro. Journal of the National Cancer Institute. 29, 597-631 (1962).
- Thesleff, I., Sahlberg, C. Organ culture in the analysis of tissue interactions. Methods in Molecular Biology. 461, 23-30 (2008).
- Jarvinen, E., Shimomura-Kuroki, J., Balic, A., Jussila, M., Thesleff, I. Mesenchymal Wnt/beta-catenin signaling limits tooth number. Development. 145 (4), (2018).
- Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).
- Narhi, K., Thesleff, I. Explant culture of embryonic craniofacial tissues: analyzing effects of signaling molecules on gene expression. Methods in Molecular Biology. 666, 253-267 (2010).
- Yang, Z., Balic, A., Michon, F., Juuri, E., Thesleff, I. Mesenchymal Wnt/beta-Catenin signaling controls epithelial stem cell homeostasis in teeth by inhibiting the antiapoptotic effect of Fgf10. Stem Cells. 33 (5), 1670-1681 (2015).
- Binder, M., et al. Functionally distinctive Ptch receptors establish multimodal hedgehog signaling in the tooth epithelial stem cell niche. Stem Cells. 37 (9), 1238-1248 (2019).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
- Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137 (22), 3753-3761 (2010).
- Hadjantonakis, A. K., Nagy, A. FACS for the isolation of individual cells from transgenic mice harboring a fluorescent protein reporter. Genesis. 27 (3), 95-98 (2000).
- Yu, Y. A., Szalay, A. A., Wang, G., Oberg, K. Visualization of molecular and cellular events with green fluorescent proteins in developing embryos: a review. Luminescence. 18 (1), 1-18 (2003).
- D'Amour, K. A., Gage, F. H. Genetic and functional differences between multipotent neural and pluripotent embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, Suppl 1 11866-11872 (2003).
- Chavez, M. G., et al. Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).
- Binder, M., et al. Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation. Science Reports. 10 (1), 4963(2020).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
