Методическая статья

Экспресс-мультиплексный двойной репортер IgG и IgM SARS-CoV-2 нейтрализуя для мультиплексированной системы анализа потоков на основе шариков

5.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62487

⸱

6 апреля 2021 г.

 ,  ,  , 
1Luminex Corporation, 2Departments of Pathology and Laboratory Medicine, Clinical Microbiology, University of Rochester Medical Center, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

Система анализа потока для мультиплексированных анализов на основе шариков, которая обеспечивает показания с двумя репортерами, была использована для разработки мультиплексных серологических анализов и анализов нейтрализации антител, которые могут одновременно измерять нейтрализующие антитела IgG и IgM для SARS-CoV-2.

Аннотация

Пандемия COVID-19 подчеркнула необходимость быстрых высокопроизводительных методов для чувствительного и специфического серологического выявления инфекции новыми патогенами, такими как SARS-CoV-2. Мультиплексное серологическое тестирование может быть особенно полезным, поскольку оно может одновременно анализировать антитела к нескольким антигенам, что оптимизирует охват патогенов и контролирует изменчивость в организме и индивидуальную реакцию хозяина. Здесь мы описываем sars-CoV-2 IgG 3-плекс флуоресцентной микросферы, который может обнаруживать как антитела IgM, так и IgG к трем основным антигенам SARS-CoV-2 - спайковой (S) белку, спайк-ангиотензинпревращающему ферменту-2 (ACE2), рецептор-связывающему домену (RBD) и нуклеокапсиду (Nc). Было показано, что анализ имеет сопоставимую производительность с эталонным анализом SARS-CoV-2 для IgG в сыворотке, полученной через ≥21 день с момента появления симптомов, но имел более высокую чувствительность с образцами, собранными через ≤5 дней от начала симптомов. Кроме того, используя растворимый ACE2 в формате нейтрализационного анализа, было продемонстрировано ингибирование связывания антител для S и RBD.

Введение

Пандемия COVID-19 подчеркнула важность возможности быстрой разработки и внедрения быстрых, высокопроизводительных, высокоэффективных серологических тестов, которые могут быть использованы для диагностики и эпиднадзора за новыми патогенами, такими как SARS-CoV-2. Мультиплексное серологическое тестирование может быть чрезвычайно полезным в условиях пандемии, поскольку оно может одновременно анализировать антитела к нескольким антигенам, что обеспечивает широкий охват патогенов и контроль за изменчивостью в организме и реакцией хозяина на инфекцию. Недавносообщалосьо разработке мультиплексного флуоресцентного бисероплетного анализа SARS-CoV-2 IgG 3Flex (3Flex), который может обнаруживать антитела к спайково-белку (S), шипово-ангиотензинпревращающий фермент-2 (ACE2) рецептор-связывающий домен (RBD) и нуклеокапсид (Nc) SARS-CoV-2. Было показано, что 3Flex имеет сопоставимую производительность с эталонным анализом SARS-CoV-2 IgG для сыворотки, полученной через ≥21 день с момента появления симптомов, но имел более высокую чувствительность с образцами, собранными через ≤5 дней от начала симптомов. Кроме того, было продемонстрировано ингибирование связывания антител для антигенов S и RBD с использованием растворимого ACE2 в формате нейтрализационного анализа. Технология на основе мультиплексных шариков была широко принята в качестве проверенной технологии для мультиплексного серологического тестирования и имеет явные преимущества для крупномасштабного скрининга, включая короткое время до результатов, требования к небольшим образцам и сокращение трудозатрат2,3,4.

Недавно стал доступен новый прибор анализа потока, который обеспечивает ту же высокоплексную, высокопроизводительную способность системы, которая была продемонстрирована в предыдущей работе1,но с дополнительным преимуществом двух репортерных каналов. Возможность измерения двух флуоресцентных репортерных сигналов в одной реакции позволяет оценить два результата на анализируемый файл для каждого образца и идеально подходит для применения изотипирования, которое обычно должно выполняться в отдельных реакционных скважинах5. Возможность двойного репортера обеспечивает вдвое больше данных для каждого образца в вдвое меньшем количестве реакционных скважин с половиной требований к объему пробы и, таким образом, имеет явное преимущество перед системами с одним репортером. В этом исследовании подробно описывается стандартный протокол серологического анализа и описывается адаптация к анализу нейтрализации. Кроме того, в этом отчете описывается преобразование анализа одного репортера в серологический анализ с двойным репортером, а затем двойной анализ нейтрализации репортера для одновременного измерения нейтрализующих антител изотипов IgG и IgM против антигенов SARS-CoV-2 S, RBD и Nc. Визуальный обзор протокола анализа приведен на рисунке 1.

Протокол

Остаточные образцы сыворотки крови человека, ранее протестированные для диагностических анализов SARS-CoV-2, были использованы в этом исследовании, которое было одобрено Институциональным наблюдательным советом Университета Рочестера.

1. Реагенты и оборудование

  1. Получить антигены коронавируса и человеческие IgG и IgM из коммерческих источников.
  2. Получите наборы бусин (45 и 220) для контроля анализа (AC) у поставщика прибора. Набор из 45 мониторов средней интенсивности флуоресценции (MFI) на инструментах с одним репортером (RP1). Набор бусин переменного тока 220 мониторов коллекции МФО на втором репортером канале (RP2).
  3. Получить обнаружение антител и антиген-специфических сывороток кролика и антител, используемых для подтверждения связи.
  4. Выполняют обнаружение с помощью меченых биотином антител либо стрептавидином, R-фикоэритриновым конъюгатом (SAPE), либо стрептавидиновым конъюгатом флуорофора Super Bright 436 (SASB; возбуждение при 405 нанометрах (нм) и эмиссия при 436 нм).
  5. Получить человеческий белок ACE2 (т.е. рецептор SARS). Перед применением регидратируют лиофилизированный белок ACE2 путем растворения до концентрации 1 мг/мл в воде, не содержит нуклеазы (не обработанной DEPC, автоклавной и 0,2-мкм стерильной фильтрованной) и храните при 4 °C.
  6. Выполняйте все реакции в 96-скважинных необязывных поверхностных (NBS) черных плоскодонных пластинах. Запечатайте пластины алюминиевой уплотнительной лентой с микропластинкой 96 скважин для этапов инкубации анализа. Используйте магнитный пластинчатый сепаратор для этапов промывки анализа.

2. Подготовка контрольных шариков, связанных с антигенами и антителами

  1. Ковалентно соединяют магнитные, полистирольные и цветовые наборы микросфер (диаметр 6,5 мкм) с антигенами S, RBD и Nc, как описано в Cameron et al.1. Коронавирусные антигены соединяются при 10 пмоль/106 бусин (S) и 100 пмоль/106 бусин (RBD и Nc). Управляющие бусины в сочетании с человеческим IgG или IgM генерируются, как описаноранее 1. IgG и IgM соединены при 5 мкг/106 шариках.
  2. После соединения определяют концентрации шариков и разбавляют каждый бульон до 1 х 106 шариков/мл, используя описанные процедуры6.
  3. Выполните подтверждение связи антигена с антиген-специфическими антителами от кролика или с положительными человеческими сыворотами, как описано в Cameron et al.1.
    1. Подтвердите связь IgG человека с биотинилированными античеловеческими реагентами обнаружения IgG / SAPE в анализе и связь IgM с помеченным фикоэритрином (PE) козьим античеловеческим IgM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подтверждение связи выполняется с использованием титрования белково-специфической сыворотки или антитела, поскольку оптимальная концентрация для использования этих реагентов неизвестна. Для сыворотки используются последовательные разбавления, тогда как для антител, поставляемых в виде мг/мл, используются последовательные серии разбавления мкг/мл.
  4. Разбавляйте контрольные бусины (AC), которые контролируют сбор MFI в двух репортерных каналах до концентрации 1 x 106 бусин /мл перед использованием в мультиплексных бисероплетениях.

3. Приготовление смеси из свежих мультиплексных шариков

  1. Готовьте мультиплексные бусины свежими каждый день из отдельных бусин и контролируйте запасы бусин по 1 x 106 бусин / мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мультиплексные бисенные смеси готовятся для доставки 2 500 бусин для каждой области бусины в объеме 50 мкл. Расчеты того, как приготовить мультиплексные бисероплетительные смеси для любого количества реакций, описаны в блоге, опубликованном Angeloni (2020)6.

4. Разбавление проб

  1. Приготовьте разведение образца сыворотки 1:100 путем смешивания 10 мкл сыворотки с 990 мкл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), содержащего 0,05% Tween 20, 0,02% азида натрия и 1% бытового сывороточного альбумина (BSA) (буфер PBS-TBN).
  2. Разбавляют образцы снова в 10 раз, добавляя 20 мкл разбавления 1:100 к 180 мкл PBS-TBN.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы сыворотки состоят из отрицательных сывороток из образцов, собранных в 2019 году до пандемии COVID-19, и положительных сывороток от SARS-CoV-2 ПЦР-положительных пациентов, представляющих низкие и высокие титры антител. Положительные образцы были собраны в период от ≈3 до >60 дней с момента появления симптомов (DFSO). Все образцы сыворотки и IgG-очищенные отрицательные контрольные сыворотки разбавляют до 1:1000, как описано ниже. Для анализов нейтрализации сыворочные сыворочные сыворо разбавляют 1:500, как описано в протоколах нейтрализации ниже (разделы 6 и 8).

5. Протокол серологического анализа с одним репортером

  1. Добавьте 50 мкл мультиплексной бисероплетительной смеси к каждому выделенному колодец 96-скважинной несвязывающей микротитры.
  2. Пипетка 50 мкл сыворотки 1:1000 или PBS-TBN в соответствующие скважины; окончательное разведение сыворотки в скважине составляет 1:2000.
  3. Накройте пластину уплотнением из микропластиной фольги и инкубируют на нагретом пластинчатом шейкере при 37 °C в течение 15 мин с встряхиванием при 600 об/мин.
  4. Снимите пластину с пластинчатого шейкера и поместите на магнитную пластину сепаратора на 2 мин, чтобы отделить шарики от реакционной смеси.
  5. Удерживая пластину на магните, снимите фольгированное уплотнение, осторожно переверните пластину над контейнером для отходов и осторожно вытащите супернатант из колодцев.
  6. Промокните пластину на абсорбирующей бумаге, все еще удерживая пластину на магните.
  7. Промывайте реакционные колодцы, как описано ниже (первая промывка после инкубации пробы).
    1. Снимите пластину с пластинчатого магнита и добавьте 150 мкл PBS-TBN в каждую скважину.
    2. Накройте пластину уплотнением из свежей фольги и встряхните при 37 °C в течение 2 мин при 600 об/мин.
    3. Снимите пластину с шейкера пластин и поместите на магнит пластины на 2 мин, чтобы отделить шарики от реакционной смеси.
    4. Удерживая пластину на магните, снимите фольгированное уплотнение, осторожно переверните пластину над контейнером для отходов и осторожно вытащите супернатант из колодцев.
    5. Промокните пластину на абсорбирующей бумаге, все еще удерживая пластину на магните.
  8. Промывайте реакционные колодцы, как описано ниже (вторая инкубационная промывка после отбора проб).
    1. Снимите пластину с пластинчатого магнита и добавьте 150 мкл PBS-TBN в каждую скважину.
    2. Накройте пластину уплотнением из свежей фольги и встряхните при 37 °C в течение 2 мин при 600 об/мин.
    3. Снимите пластину с шейкера пластин и поместите на магнит пластины на 2 мин, чтобы отделить шарики от реакционной смеси.
    4. Удерживая пластину на магните, снимите фольгированное уплотнение, осторожно переверните пластину над контейнером для отходов и осторожно вытащите супернатант из колодцев.
    5. Снимите пластину с магнита.
  9. Внесите свежую смесь биотин-античеловеческого IgG с SAPE, разбавляя антитело до 0,62 мкг/мл и SAPE до 1 мкг/мл. Добавьте 100 мкл к каждой скважине.
  10. Накройте пластину уплотнением из микропластиной фольги и инкубируют на нагретом пластинчатом шейкере при 37 °C в течение 15 мин с встряхиванием при 600 об/мин.
  11. Снимите пластину с пластинчатого шейкера и поместите на магнитную пластину сепаратора на 2 мин, чтобы отделить шарики от реакционной смеси.
  12. Удерживая пластину на магните, снимите фольгированное уплотнение, осторожно переверните пластину над контейнером для отходов и осторожно вытащите супернатант из колодцев.
  13. Промокните пластину на абсорбирующей бумаге, все еще удерживая пластину на магните.
  14. Промывайте реакционные колодцы, как описано ниже (первая инкубационная промывка антител после обнаружения антител).
    1. Снимите пластину с пластинчатого магнита и добавьте 150 мкл PBS-TBN в каждую скважину.
    2. Накройте пластину уплотнением из свежей фольги и встряхните при 37 °C в течение 2 мин при 600 об/мин.
    3. Снимите пластину с шейкера пластин и поместите на магнит пластины на 2 мин, чтобы отделить шарики от реакционной смеси.
    4. Удерживая пластину на магните, снимите фольгированное уплотнение, осторожно переверните пластину над контейнером для отходов и осторожно вытащите супернатант из колодцев.
    5. Промокните пластину на абсорбирующей бумаге, все еще удерживая пластину на магните.
  15. Промывайте реакционные колодцы, как описано ниже (вторая инкубационная промывка антител после обнаружения).
    1. Снимите пластину с пластинчатого магнита и добавьте 150 мкл PBS-TBN в каждую скважину.
    2. Накройте пластину уплотнением из свежей фольги и встряхните при 37 °C в течение 2 мин при 600 об/мин.
    3. Снимите пластину с пластинчатого шейкера и поместите на сепаратор магнитной пластины на 2 минуты, чтобы отделить шарики от реакционной смеси.
    4. Удерживая пластину на магните, снимите фольгированное уплотнение, осторожно переверните пластину над контейнером для отходов и осторожно вытащите супернатант из колодцев.
    5. Снимите пластину с магнита.
  16. Добавьте 100 мкл PBS-TBN в каждую скважину.
  17. Накройте фольгой и встряхните в течение 2 мин при 37 °C.
  18. Снимите пластину с шейкерной пластины. Затем снимите фольгированный уплотнение и считайте 50 мкл каждой скважины на анализаторе потока в соответствии с Руководством пользователя. Ниже приводится краткое описание.
    1. Выберите раскрывающееся меню в левом верхнем углу экрана и перейдите в раздел Конфигурация пластины.
    2. Выберите Выполнить пластину.
    3. Щелкните значок «Извлечь», чтобы извлечь держатель пластины.
    4. Загрузите пластину на держатель пластины и выберите значок Втянуть, чтобы втянуть держатель пластины.
    5. Щелкните значок Выполнить, чтобы запустить тарелку.

6. Протокол нейтрализации одного репортера

  1. Приготовьте свежую смесь из мультиплексных шариков, как описано в разделе 3 выше.
  2. Разбавляют больного и контролируют сывороточные 1:500 следующим образом.
    1. Разбавить сыворотку 1:100, смешав 10 мкл сыворотки с 990 мкл PBS-TBN.
    2. Разбавить сыворотку еще в 5 раз, добавив 40 мкл сыворотки 1:100 в 160 мкл PBS-TBN.
  3. Добавьте 50 мкл мультиплексной бисероплетительной смеси к каждому выделенному колодец 96-скважинной несвязывающей микротитры.
  4. Добавьте 25 мкл разбавления 2 мкг/мл ACE2 в каждую скважину.
  5. Накройте пластину уплотнением из микропластини и инкубируют на нагретом пластинчатом шейкере при 37 °C в течение 2 мин с встряхиванием при 600 об/мин.
  6. Снимите пластину с шейкерной пластины и снимите уплотнение из фольги.
  7. Добавьте 25 мкл сыворотки 1:500 или PBS-TBN в назначенные скважины.
  8. Накройте пластину уплотнением из микропластиной фольги и инкубируют на нагретом пластинчатом шейкере при 37 °C в течение 15 мин с встряхиванием при 600 об/мин.
  9. Для остальной части процедуры анализа выполните шаги 5.4-5.18.5, как описано выше.

7. Преобразование в двойной репортер IgG и IgM серологический анализ

  1. Приготовьте бусины, связанные с антигенами, как описано в разделе 2 выше.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительный набор шариков в сочетании с человеческим IgM включен для мониторинга добавления реагентов обнаружения анти-IgM, а также дополнительный набор бусин переменного тока (220) для мониторинга сбора MFI для RP2. Все бусины имеют по 1 x 106 бусин /мл для включения в мультиплексные бисероплетение, как описано ниже.
  2. Приготовьте свежие смеси из мультиплексного бисера, как описано в разделе 3 выше.
  3. Разбавляйте образцы сыворотки и IgG-очищенные отрицательные контрольные сыворотки 1:1000, как описано в разделе 4 выше.
  4. Добавьте 50 мкл мультиплексной бисероплетительной смеси к каждому выделенному колодец 96-скважинной несвязывающей микротитры.
  5. Пипетка 50 мкл сыворотки 1:1000 или PBS-TBN в соответствующие скважины. Окончательное разведение сыворотки в скважине составляет 1:2000.
  6. Накройте пластину уплотнением из микропластиной фольги и инкубируют на нагретом пластинчатом шейкере при 37 °C в течение 15 мин с встряхиванием при 600 об/мин.
  7. Снимите пластину с пластинчатого шейкера и поместите на магнитную пластину сепаратора на 2 мин, чтобы отделить шарики от реакционной смеси.
  8. Удерживая пластину на магните, снимите фольгированное уплотнение, осторожно переверните пластину над контейнером для отходов и осторожно вытащите супернатант из колодцев.
  9. Промокните пластину на абсорбирующей бумаге, все еще удерживая пластину на магните.
  10. Промывайте реакционные колодцы, как описано ниже (первая промывка после инкубации пробы).
    1. Снимите пластину с пластинчатого магнита и добавьте 150 мкл PBS-TBN в каждую скважину.
    2. Накройте пластину уплотнением из свежей фольги и встряхните при 37 °C в течение 2 мин при 600 об/мин.
    3. Снимите пластину с шейкера пластин и поместите на магнит пластины на 2 мин, чтобы отделить шарики от реакционной смеси.
    4. Удерживая пластину на магните, снимите фольгированное уплотнение, осторожно переверните пластину над контейнером для отходов и осторожно вытащите супернатант из колодцев.
    5. Промокните пластину на абсорбирующей бумаге, все еще удерживая пластину на магните.
  11. Снова промыть реакционные колодцы PBS-TBN (вторая инкубационная промывка после отбора проб), как описано выше на этапах 7.10.1-7.10.5.
  12. Снимите пластину с магнита.
  13. Сделайте свежую смесь реагентов Detection с необходимой комбинацией реагентов и добавьте 50 мкл или 100 мкл в каждую скважину.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смеси реагентов обнаружения, содержащие античеловеческий IgG, сопряженный с репортерным красителем Brilliant Violet 421 (BV; возбуждение при 405 нм и излучение при 421 нм), использовали при 50 мкл/скважину из-за ограниченного количества имеющихся запасов реагентов. Все остальные смеси реагентов detection используются при 100 мкл/скважина.
  14. Накройте пластину уплотнением из микропластиной фольги и инкубируют на нагретом пластинчатом шейкере при 37 °C в течение 15 мин с встряхиванием при 600 об/мин.
  15. Снимите пластину с пластинчатого шейкера и поместите на магнитную пластину сепаратора на 2 мин, чтобы отделить шарики от реакционной смеси.
  16. Удерживая пластину на магните, снимите фольгированное уплотнение, осторожно переверните пластину над контейнером для отходов и осторожно вытащите супернатант из колодцев.
  17. Промокните пластину на абсорбирующей бумаге, все еще удерживая пластину на магните.
  18. Промыть реакционные колодцы, как описано ниже, PBS-TBN (первая промывка после обнаружения инкубации антител).
    1. Снимите пластину с пластинчатого магнита и добавьте 150 мкл PBS-TBN в каждую скважину.
    2. Накройте пластину уплотнением из свежей фольги и встряхните при 37 °C в течение 2 мин при 600 об/мин.
    3. Снимите пластину с пластинчатого шейкера и поместите на магнитную пластину сепаратора на 2 мин, чтобы отделить шарики от реакционной смеси.
    4. Удерживая пластину на магните, снимите фольгированное уплотнение, осторожно переверните пластину над контейнером для отходов и осторожно вытащите супернатант из колодцев.
    5. Промокните пластину на абсорбирующей бумаге, все еще удерживая пластину на магните.
  19. Снова промыть реакционные колодцы PBS-TBN (вторая промывка после инкубации антител), точно так же, как описано выше в шагах 7.17.1-7.17.5.
  20. Снимите пластину с магнита.
  21. Добавьте 100 мкл PBS-TBN в каждую скважину.
  22. Накройте фольгой и встряхните в течение 2 мин при 37 °C.
  23. Снимите пластину с шейкерной пластины. Затем снимите уплотнение фольги и считывание 50 мкл каждой скважины на анализаторе потока, как описано выше на этапах 5.18.1-5.18-5.

8. Преобразование в двойной анализ нейтрализации репортеров

  1. Используйте связанные шарики, как описано в шаге 7.1 выше.
  2. Приготовьте свежую смесь из мультиплексных шариков, как описано в шаге 7.2.
  3. Образцы сыворотки и IgG-очищенные отрицательные контрольные сыворотки разбавляют 1:500 следующим образом.
    1. Приготовьте разведение 1:100, смешивая 10 мкл сыворотки с 990 мкл PBS-TBN.
    2. Разбавьте образцы 1:100 еще в 5 раз, добавив 40 мкл разведения 1:100 к 160 мкл PBS-TBN.
  4. Добавьте 50 мкл мультиплексной бисероплетительной смеси к каждому выделенному колодец 96-скважинной несвязывающей микротитры.
  5. Добавьте 25 мкл разбавления 2 мкг/мл ACE2 в каждую скважину.
  6. Накройте пластину уплотнением из микропластини и инкубируют на нагретом пластинчатом шейкере при 37 °C в течение 2 мин с встряхиванием при 600 об/мин.
  7. Снимите пластину с шейкерной пластины и снимите уплотнение из фольги.
  8. Добавьте 25 мкл сыворотки 1:500 или PBS-TBN в назначенные скважины.
  9. Накройте пластину фольгированной пломбой и высиживайте на нагретом пластинчатом шейкере при 37 °C в течение 15 мин с встряхиванием при 600 об/мин.
  10. Снимите пластину с пластинчатого шейкера и поместите на магнитную пластину сепаратора на 2 мин, чтобы отделить шарики от реакционной смеси.
  11. Удержив пластину на магните, снимите фольгированное уплотнение, осторожно переверните пластину над контейнером для отходов и осторожно вытащите супернатант из колодцев.
  12. Промокните пластину на абсорбирующей бумаге, все еще удерживая пластину на магните.
  13. Промывайте реакционные колодцы, как описано ниже (первая промывка после инкубации образца).
    1. Снимите пластину с пластинчатого магнита и добавьте 150 мкл PBS-TBN в каждую скважину.
    2. Накройте пластину уплотнением из свежей фольги и встряхните при 37 °C в течение 2 мин при 600 об/мин.
    3. Снимите пластину с пластинчатого шейкера и поместите на магнитную пластину сепаратора на 2 мин, чтобы отделить шарики от реакционной смеси.
    4. Удержив пластину на магните, снимите фольгированное уплотнение, осторожно переверните пластину над контейнером для отходов и осторожно вытащите супернатант из колодцев.
    5. Промокните пластину на абсорбирующей бумаге, все еще удерживая пластину на магните.
  14. Снова промыть реакционные колодцы PBS-TBN (вторая инкубационная промывка после отбора проб), как описано выше на этапах 8.13.1-8.13.5.
  15. Снимите пластину с магнита.
  16. Сделайте свежую смесь реагентов Detection с необходимой комбинацией реагентов и добавьте 50 мкл или 100 мкл в каждую скважину.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смеси реагентов обнаружения, содержащие античеловеческий IgG, конъюгированный с репортерным красителем BV, использовались при 50 мкл/скважину из-за ограниченного количества имеющихся запасов реагентов (см. Таблицу материалов). Все остальные смеси реагентов detection используются при 100 мкл/скважина.
  17. Накройте пластину уплотнением из микропластиной фольги и инкубируют на нагретом пластинчатом шейкере при 37 °C в течение 15 мин с встряхиванием при 600 об/мин.
  18. Снимите пластину с пластинчатого шейкера и поместите на магнитную пластину сепаратора на 2 мин, чтобы отделить шарики от реакционной смеси.
  19. Удержив пластину на магните, снимите фольгированное уплотнение, осторожно переверните пластину над контейнером для отходов и осторожно вытащите супернатант из колодцев.
  20. Промокните пластину на абсорбирующей бумаге, все еще удерживая пластину на магните.
  21. Промыть реакционные колодцы, как описано ниже (сначала было обнаружено после обнаружения инкубации антител).
    1. Снимите пластину с пластинчатого магнита и добавьте 150 мкл PBS-TBN в каждую скважину.
    2. Накройте пластину уплотнением из свежей фольги и встряхните при 37 °C в течение 2 мин при 600 об/мин.
    3. Снимите пластину с пластинчатого шейкера и поместите на магнитную пластину сепаратора на 2 мин, чтобы отделить шарики от реакционной смеси.
    4. Удержив пластину на магните, снимите фольгированное уплотнение, осторожно переверните пластину над контейнером для отходов и осторожно вытащите супернатант из колодцев.
    5. Промокните пластину на абсорбирующей бумаге, все еще удерживая пластину на магните.
  22. Снова промыть реакционные колодцы PBS-TBN (вторая промывка после инкубации антител обнаружения), точно так же, как описано выше на этапах 8.21.1-8.21.5.
    1. Снимите пластину с пластинчатого магнита и добавьте 150 мкл PBS-TBN в каждую скважину.
    2. Накройте пластину уплотнением из свежей фольги и встряхните при 37 °C в течение 2 мин при 600 об/мин.
    3. Снимите пластину с пластинчатого шейкера и поместите на сепаратор магнитной пластины на 2 минуты, чтобы отделить шарики от реакционной смеси.
    4. Удержив пластину на магните, снимите фольгированное уплотнение, осторожно переверните пластину над контейнером для отходов и осторожно вытащите супернатант из колодцев.
    5. Снимите пластину с магнита.
  23. Добавьте 100 мкл PBS-TBN в каждую скважину.
  24. Накройте фольгой и встряхните в течение 2 мин при 37 °C.
  25. Снимите пластину с шейкерной пластины. Затем снимите уплотнение фольги и считывание 50 мкл каждой скважины на анализаторе потока, как описано выше на этапах 5.18.1-5.18-5.

Результаты

Оптимизация серологического анализа одного репортера.
Стратегия соединения для всех антигенов SARS-CoV-2 описана в Cameron, et al., 20201 и в шаге 2.1 выше. Стратегия подтверждения соединения описана на этапе 2.3 выше. Для эффективной связи значения средней интенсивности флуоресценции (МФО) должны быть значительно выше, чем реакция (реакции) отрицательного контроля без сыворотки/без антител, и должны демонстрировать дозовый ответ на снижение сигнала МФО с уменьшением количества реагента обнаружения. МФО приблизительно 1000 единиц МФО или более по сравнению с фоновой МФО обычно указывают на эффективную связь с белками и зависят от концентрации и специфичности используемого реагента обнаружения. Используя этот метод, подтверждение связи антигенов S, RBD и Nc было протестировано для двух партий бусин(рисунок 2). Сигналы МФО для всех антигенов были значительно выше фоновой МФО и показывали дозовый ответ с титрованием реагентов обнаружения. Данные также показали хорошую воспроизводимость уровней МФО между двумя различными партиями связанных бусин.

Оптимизация анализа одного репортера была выполнена, как описано в Cameron, et al., 20201. Каждый антиген тестировали в различных концентрациях связи с различными разведениями нескольких образцов сыворотки, представляющих высокие, средние, низкие и отрицательные образцы. Кроме того, поскольку анализ измеряет титры IgG, в качестве дополнительного отрицательного образца была использована сыворотка, удаленная IgG. Результаты репрезентативного ряда разбавления образца с различными уровнями связи антигенов показаны на рисунке 3. Эта начальная серия разбавления была протестирована с фиксированной концентрацией реагентов обнаружения для получения потенциального диапазона репрезентативных антиген-специфических и фоновых уровней МФО. На 000 данных были определены дополнительные диапазоны разбавления проб и уровни связи антигенов, которые были дополнительно протестированы с дополнительными образцами (данные не показаны).

Затем концентрацию детектируемого реагента оптимизировали для использования с различными сывороточными разведениями и уровнями связи антигенов. Репрезентативные данные с использованием 6 положительных и 2 отрицательных образцов показаны на рисунке 4. После дополнительного тестирования с несколькими сотнями отрицательных образцов сыворотки до COVID-19 для окончательного протокола анализа были выбраны окончательные оптимальные уровни связи антигенов и концентрации регентов обнаружения, как описано в разделе 5.

Преобразование в один анализ нейтрализации репортера
Преобразование однопортрового серологического анализа в нейтрализующий анализ достигалось путем добавления инкубационного этапа с использованием ACE2 (в качестве конкурирующего реагента) с шариками перед добавлением образца сыворотки. При титровании количества добавленного ACE2 наблюдалось ингибирование связывания IgG с антигенами S и RBD, как показано на рисунке 5. В то время как сывороподражения 11 пациентов имели разные титры IgG, каждый из них показал значительное снижение сигнала MFI с увеличением концентрации ACE2. Как и ожидалось, ACE2 влияет только на сигналы MFI S и RBD, но не на антиген Nc.

Процент остаточного сигнала МФО относительно 0 мкг/мл ACE2 для всех образцов показан на рисунке 6. Для большинства образцов потеря сигнала >30% наблюдалась для S и RBD с увеличением концентрации ACE2. Как и ожидалось, влияние ACE2 на сигнал Nc не произошло.

Преобразование в двойной репортерный серологический анализ IgG и IgM
Для анализа двойного репортера IgG и IgM стандартные условия анализа одного репортера использовались для тестирования различных комбинаций антител и репортеров для двух репортерских каналов. Канал RP1 аналогичен предыдущим приборам анализа потока с обнаружением «оранжевой» флуоресценции для репортерных красителей, таких как PE. Второй канал, RP2, использует фиолетовый лазер возбуждения, который может быть использован для обнаружения «синей» флуоресценции красителей, возбужденных при 402 нм с пиками спектров излучения в диапазоне 421-441 нм.

Несколько различных комбинаций античеловеческих антител IgG и IgM были протестированы в различных концентрациях со стандартными 2000-кратными условиями разбавления и инкубации образцов, подробно описанными в разделе 6. Первоначальное испытание анти-IgM, сопряженного с репортерным красителем DyLight 405 (DL 405; возбуждение при 400 нм и излучение при 420 нм) для канала RP2, проводилось с использованием набора из 11 ПЦР-положительных образцов с DFSO в диапазоне от 5 до >60 дней и образца сыворотки, снятой IgG. Этот реагент обнаружения не производил высокий сигнал в канале RP2, как показано на рисунке 7A,B, C. Для образцов с высоким IgM RP2 MFI самые высокие сигналы были замечены для RBD и Nc(рисунок 7B,C). Хотя титры IgM должны быть повышены в это время в некоторых образцах, наблюдаемые уровни MFI не превышали 140 единиц MFI с реагентом обнаружения IgM. Кроме того, контрольная шарика для IgM не имели значительного динамического диапазона для MFI при использовании DL 405, сопряженного с анти-IgM, по сравнению с полиэтиленовым анти-IgM RP1 репортером, используемым при тех же концентрациях(рисунок 7D).

Поскольку подходящий реагент обнаружения RP2 с репортерной маркировкой для IgM был недоступен, оригинальный биотин анти-IgG с SASB был протестирован для использования в канале RP2. Сигнал для IgG в канале RP2 с SASB не имел того же динамического диапазона, что и у SAPE, но он все же имел подходящий диапазон для измерения титров IgG для S, RBD и Nc(рисунок 8). Эти данные привели к тестированию различных комбинаций реагентов для детектирования RP1 IgM и RP2 IgG, как описано ниже.

Преобразование в двойной анализ нейтрализации репортеров
Серологический анализ с двойным репортером преобразовывали в анализ нейтрализации путем добавления инкубационного этапа с ACE2 и бусинами перед добавлением образца сыворотки. Использовали 2-кратную серию разбавления ACE2, начиная с 16 мкг/мл, а затем тестировали с наборами из 11 образцов и очищенными сыворочками, как описано выше. Кроме того, 3 различные комбинации смесей антител для обнаружения RP1 IgM и RP2 IgG были протестированы на наборе из 11 образцов и очищенных контрольных сывороточной сыворотки. Окончательные комбинации и концентрации реагентов, определенные как оптимальные, подробно описаны в таблице 1.

Для обнаружения IgG биотин против человека IgG / SASB, используемый в оригинальном анализе одного репортера, был протестирован вместе с другим анти-IgG, конъюгированным с репортерным красителем BV. В то время как конъюгат BV имел высокие сигналы RP2 MFI, интенсивность сигнала MFI для титра IgG варьировалась в зависимости от титрования ACE2(рисунок 9A,C, E). Комбинация биотина против человека IgG/ SASB имела более последовательное снижение сигнала MFI во время титрования ACE2 по сравнению с конъюгатом BV, демонстрируя реакцию дозы, хотя уровни MFI были ниже. Флуктуация сигнала конъюгатом BV в концентрациях ACE2 также мешала определению процента ингибирования ACE2 в диапазоне титров IgG по сравнению с комбинацией биотина против человека IgG/SASB(рисунок 9B,D, F). Образцы с низким уровнем сигналов MFI, такие как образец DFSO 3, не имеют достаточно высоких титров для оценки эффективности этих реагентов или измерения нейтрализующей способности IgG.

Для определения титров IgM в канале RP1 PE-конъюгированный анти-IgM сравнивали с античеловеческим IgM, сопряженным с репортерным красителем DyLight 549 (DL 549; возбуждение при 562 нм и излучение при 576 нм) при концентрациях, перечисленных в таблице 1. Из этих двух реагентов PE anti-IgM показал более высокие MFIs, чем те, которые генерируются DL 549 античеловеческим IgM для тестируемых образцов(рисунок 9A,C, E). Контрольный шарик IgM, измеряющий добавление этих реагентов, имел различные средние МФО в размере ≈17 000 для PE anti-IgM и 2 723 для сопряжения DL 549. Даже с этими различиями влияние различных концентраций ACE2 на МФО можно было измерить с помощью сопряженного DL 549. Для определения ACE2-процентного ингибирования связывания IgM наблюдалась небольшая, но незначительная разница между двумя реагентами обнаружения IgM(рисунок 9B,D, F).

СочетаниеДокладчикКонечная концентрация в скважине (мкг/мл)
РП1РП2
1ПЭ анти-IgM2-
Биотин-Иг-0.62
САСБ-4
2DyLight 549 Античеловеческий IgM1-
Бриллиант Фиолетовый 421 Античеловеческий IgG-1
3DyLight 549 Античеловеческий IgM1-
Биотин-Иг-0.62
САСБ-4

Таблица 1: Список протестированных комбинаций репортерных красителей RP1 и RP2. Несколько различных репортерных красителей RP1 и RP2 были оценены для измерения титров IgG и IgM. Три комбинации, показанные выше, были протестированы в различных режимах обнаружения RP1 и для оптимизации анализа нейтрализации. Для комбинаций RP2 с использованием SASB показаны концентрации для биотинилированного антитела обнаружения и SASB. *Конечная концентрация представляет собой конечную концентрацию в реакционной скважине.

figure-results-1
Рисунок 1:Блок-схема, выделяющая основные этапы протокола анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2:Подтверждение связи антигенов. Антигены соединяли при 100, 10 и 1 пмоль/106 шариках. Для антигенов S и RBD использовались анти-S сыворотки кролика, которые были обнаружены с помощью PE anti-rabbit IgG. Для Nc был использован белок G-очищенный кролик поликлональный анти-Nc. Показаны кривые титрования для шариков в сочетании с 10 пмоль S(A),100 пмоль RBD(B)и 100 пмоль Nc(C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3:Оптимизация разведения сыворотки с различными уровнями связи антигенов. Образцы сыворотки, представляющие собой высокие, средние, низкие и отрицательные образцы, были протестированы с различным антигеном pmol /10 6 шариковых связок. 4-кратное титрование сыворотки было протестировано с мультиплексной смесью бусин, связанных с антигеном, с использованием протокола анализа, описанного в разделе 5. Показаны значения MFI кривых титрования для S(A),RBD(B)и Nc(C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Рисунок 4:Определение оптимального разведения сыворотки и обнаружение концентрации реагента. Восемь образцов сыворотки, включая отрицательных пациентов (2 образца) и низко- и высоко-положительных (6 образцов), были протестированы в дополнительных разведениях сыворотки с тремя различными концентрациями реагентов обнаружения. Результаты MFI показаны для S(A),RBD(B)и Nc(C). На основе этих и других данных (не показаны) был выбран образец разведения 1:2000 и концентрация антител для обнаружения биотина 0,62 мкг/мл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-5
Рисунок 5:Оптимизация анализа нейтрализации одного репортера. Модификацию одиночного репортерного серологического анализа на нейтрализующий анализ обнаружения антител проводили путем добавления инкубационного этапа с ACE2 в качестве конкурента, как описано в разделе 6. Набор из 11 образцов, начиная от низко- до высокоположительных титрных сывороток, и образец сыворотки IgG-полосатый тестировали с двукратной серией разбавления ACE2, начиная с 4 мкг/мл, с использованием стандартных условий анализа. В этом диапазоне концентраций ACE2 снижение MFI можно увидеть при увеличении ACE2 для S(A)и RBD(B),но не для Nc(C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-6
Рисунок 6:Процентное ингибирование сигнала с ПОМОЩЬЮ ACE2. Показан процент остаточных сигналов для набора из 11 выборок (из рисунка 4). Для каждого образца, независимо от его титра IgG, было достигнуто максимальное снижение сигнала МФО ≥30% для S(A)и RBD(B)при самой высокой концентрации ACE2. Для Nc-антигена(C)не наблюдалось значимого ингибирования сигнала с любым количеством испытуемого ACE2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-7
Рисунок 7:Испытание DyLight 405 против IgM в качестве реагента обнаружения RP2 IgM. Набор из 11 образцов и IgG-очищенные сыворотки были использованы для тестирования DL 405-конъюгированного анти-IgM в качестве реагента обнаружения RP2. Показаны сигналы RP2 IgM MFI для S(A),RBD(B)и Nc(C). Самый высокий сигнал MFI для любого антигена с любым образцом составил примерно 140 единиц MFI для RBD с образцом H(B). Даже сигнал на контрольном наборе бусин IgM составлял менее 1000 MFI в канале RP2 во всем диапазоне титров антител и не показывал увеличенного динамического диапазона, наблюдаемого с антителом обнаружения PE анти-IgM в канале RP1(D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-8
Рисунок 8:Оптимизация SASB в качестве репортера RP2 с Биотином анти-IgG. Набор из 11 образцов и IgG-очищенные сыворотки были использованы для тестирования серии разбавления SASB со стандартным 0,62 мкг/мл биотина анти-IgG. Показаны результирующие МФО IgG в канале RP2 для S(A),RBD(B)и Nc(C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-9
Рисунок 9:Сравнение трех различных комбинаций RP1 IgM и RP1 IgG смесей детектирования. Три различные смеси антител для обнаружения были протестированы на 11 образцах и IgG, очищенных от сывороток. Используемые комбинации и конечные концентрации описаны в таблице 1. Все образцы были протестированы с 2-кратным разбавлениями ACE2, начиная с 16 мкг/мл. Показаны данные для образцов в DFSO за 3, 12 и 30 дней. Сигналы MFI для RP1 IgM (оранжевый) и RP2 IgG (синий) показаны в A (DFSO 3), C (DFSO 12) и E (DFSO 30). Остаточные МФУ ACE2% показаны в B (DFSO 3), D (DFSO 12) и F (DFSO 30). Сигналы, представляющие снижение >30% по сравнению с элементами управления Без ACE2, подсвечиваются светло-зеленым цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Это исследование расширило функциональность мультиплексного флуоресцентного микросферного анализа 3Flex, который качественно оценивает реакцию IgG на инфекцию SARS-CoV-21. В то время как многие серологические анализы на COVID-19 обнаруживают один антиген, этот анализ одновременно оценивает антигены S, RBD и Nc и включает внутренний контроль изотипа антител7. Кроме того, ACE2 используется в качестве индикатора для выявления нейтрализующих титров антител к SARS-CoV-2.

Анализы на несколько антигенов могут быть особенно полезны в будущем для распознавания иммунных реакций между инфицированными и вакцинированными людьми. При SARS-CoV-2, если оценивать только антитела S и RBD, было бы невозможно определить, было ли это связано с прошлой инфекцией или с ответом антител к вакцинации. Ни одна из используемых в настоящее время вакцин не нацелена на антиген Nc, поэтому, оценивая антигены S/RBD и Nc, можно отличить прошлую вирусную инфекцию (Nc- и S/RBD-положительную) от ответа на вакцинацию (только S/RBD-положительный; Nc-отрицательный).

В текущем исследовании серологические и нейтрализуемые анализы 3Flex (разделы 5 и 6) были перенесены на новый прибор анализа двойного репортерного потока (разделы 7 и 8). Типичные протоколы иммуноанализа для мультиплексных анализов на основе шариков аналогичны стандартным протоколам ИФА, следуя сопоставимым этапам инкубации образцов, инкубации антител / репортера и анализа результатов8. Предыдущие исследования также продемонстрировали, как стандартные анализы ИФА могут быть перенесены на платформу мультиплексирования на основе бисера9.

Протоколы анализа могут быть легко перенесены с предшествующие однопортажуные приборы на новую систему двойного репортера, о чем свидетельствуют результаты, полученные для тестовых образцов и элементов управления(рисунок 4 и рисунок 5). В серологическом анализе все положительные образцы сыворотки показали характерное дозочувствительное снижение сигнала, соответствующее как более высокому разбавлению образца, так и более низкой концентрации антител для обнаружения, тогда как сигналы для отрицательных образцов оставались на фоновых уровнях. Аналогичным образом, для анализа нейтрализации снижение сигналов для S и RBD, но не для Nc, соответствовало увеличению концентраций конкурента ACE2, тогда как очищенная сыворотка IgG была гораздо менее затронута добавлением ACE2. Предварительная инкубационная обработка шариков с ACE2 в течение 2 мин до добавления образца сыворотки (как описано в разделах 6 и 8) также сравнивалась с объединением шариков с ACE2 и сывороткой одновременно и производила небольшую разницу в результатах (данные не показаны). Однако, поскольку результаты, полученные с помощью шариков плюс прединкрубационная ступень ACE2, были более последовательными, это была окончательная процедура, принятая для протокола нейтрализации анализа (разделы 6 и 8).

Поскольку двойная репортерная система включает в себя второй флуоресцентный репортерный канал, оба анализа были преобразованы в изотипирование для одновременного измерения ответов IgG и IgM. Функция двойного репортера анализатора потока позволяет получать флуоресцентные сигналы от двух реагентов обнаружения репортеров для каждого анализируемого вещества в мультиплексе для каждого образца, эффективно удваивая данные, генерируемые на образец в анализе. Для разработки и оптимизации протоколов двойного репортерного анализа было оценено несколько коммерчески доступных репортерных красителей и антител обнаружения для нового канала RP2(рисунок 7 и рисунок 8)для определения наилучшего доступного варианта (вариантов). Анти-IgM антитело, конъюгированное с репортерным красителем DL 405, не работало хорошо в канале RP2(рисунок 7),поэтому биотин анти-IgG с SASB впоследствии оценивали для обнаружения в канале RP2(рисунок 8). Три комбинации реагентов для детектирования RP1 и RP2 сравнивали в двойном анализе нейтрализации репортеров(таблица 1 и рисунок 9)для определения наиболее эффективных комбинаций для одновременного обнаружения нейтрализующих антител IgG и IgM. Хотя существовали значительные различия в интенсивности сигнала между каналом RP1 с использованием PE-anti IgM и каналом RP2 с использованием DL 549 anti-IgM, не было существенной разницы в измерении процентного ингибирования связывания ACE2.

Признается ряд ограничений нынешнего метода и этого исследования. Во-первых, образцы, протестированные и использованные при разработке и оптимизации метода, были ограничены наборами из 8-11 образцов. Больше образцов будет протестировано в расширенных исследованиях, чтобы убедиться, что метод полностью оптимизирован. Во-вторых, было протестировано ограниченное количество репортерских флуорофоров и репортерских пар. Дальнейшее тестирование всех доступных репортеров во всех возможных комбинациях позволит определить, какие реагенты могут быть успешно использованы в этом методе. Анти-IgG антитело, конъюгированное с биотином, отличалось от анти-IgG-антитела, конъюгированного с репортером BV 421. Таким образом, хотя изменчивость интенсивности сигнала для BV 421 anti-IgG существовала, она могла быть обусловлена специфичностью антитела и не связана с репортерным красителем. Тестирование других доступных BV 421-конъюгированных антител может идентифицировать другое антитело, которое будет хорошо работать в канале RP2. Будущие исследования также будут оценивать комбинацию ПЭ анти-IgM с BV 421 античеловеческим IgG для обнаружения в RP1 и RP2 соответственно. Наконец, даже при двойной репортерной способности прибора анализы ограничены двумя изотипами (двумя параметрами) на реакцию. Если необходимо измерить дополнительные изотипы или желательно полное изотипирование, то дополнительные реакции с использованием тех же двух репортерных каналов должны быть запущены в отдельных скважинах.

Технология мультиплексирования на основе бисера позволяет быстро и гибко проектировать анализ с простым внедрением в рутинные лабораторные рабочие процессы3,4,10. Это исследование продемонстрировало легкость переноса ранее описанных серологических и нейтрализующих анализов 3Flex для SARS-CoV-2 на систему анализа потока для измерения IgG с помощью одного репортера или с небольшой модификацией, одновременно измеряя ответы IgG и IgM с использованием двух репортеров. Опция двойного репортера имеет явные преимущества перед платформами с одним репортером, поскольку она может предоставлять в два раза больше данных на образец, используя половину объема образца и половину количества реакционных скважин. С соответствующими репортерными красителями и антителами обнаружения анализы изотипирования могут быть легко разработаны и выполнены на приборе анализа двойного репортерного потока.

Раскрытие информации

Стивен Анджелони и Шерри Данбар являются сотрудниками корпорации Luminex, которая производит некоторые из реагентов и инструментов, которые использовались в этом исследовании. Публикация этой статьи в открытом доступе была спонсирована корпорацией Luminex

Благодарности

Этот отчет был профинансирован корпорацией Luminex (Остин, техас). Авторы благодарят Мэтью Сильвермана PhD (Biomedical Publishing Solutions, Delray Beach, FL) за помощь в научном редактировании.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ACE2 (человек) (рек.)AdipoGen Life SciencesAG-40B-0192-3050
Biotin-SP (длинный спейсер) AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ специфичные для фрагментовJackson ImmunoResearch Laboratories109-065-098
Бычья сыворотка АльбуминMilliporeSigmaA7888Sigma-Aldrich
Branson 1800 Очиститель/ультразвуковая терапия для водяной баниРазличное
Brilliant Violet 421 AffiniPure Donkey Anti-Human IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories709-675-149
Corning 96-луночный черный плоскодонный полистирол NBS микропластинаCorning3650
Corning 96-луночная микропластина алюминиевая герметизирующая лента, нестерильнаяCorning6570
DyLight 405 AffiniPure Goat Anti-Human IgM, Fc5μ   специфичный фрагментJackson ImmunoResearch Laboratories109-475-043
DyLight 549 AffiniPure F(ab')2 Goat Anti-Human IgM Fc5μ специфичныйJackson ImmunoResearch Laboratories109-506-129Снят с производства, но доступен у нескольких поставщиков
eBioscience Streptavidin Super Bright 436 ConjugateThermoFisher Scientific62-4317-82
Инкубационный шейкер для микропланшетов FisherbrandThermoFisher Scientific02-217-757Fisher Scientific
Goat Anti-rabbit IgG (H+L) Перекрестно-адсорбированное вторичное антитело, ПЭThermoFisher ScientificP-2771MP
Магнитный пластинчатый сепаратор LuminexLuminex CorporationCN-0269-01
Бусины MagPlexLuminex CorporationMC100XX-ID
PE AffiniPure F(ab')2 козий античеловеческий IgM Fc5μ специфическиеJackson ImmunoResearch Laboratories109-116-129
Фосфат буферизованный физиологический растворMilliporeSigmaP3813Sigma-Aldrich
SARS Антитела к нуклеокапсидному белкуNovos BiologicalsNB100-56683Неконъюгированный, кролик, поликлональный, белок G очищенный
SARS Нуклеокапсидный белок АнтителаNovos BiologicalsNB100-56049Неконъюгированный, кролик, поликлональный, Протеин А очищенный
SARS Spike Protein АнтителоNovos BiologicalsNB100-56047Неконъюгированный, кролик, поликлональный, Белок G очищенный
SARS Spike Protein АнтителоNovos BiologicalsNB100-56048Неконъюгированный, кролик, поликлональный, Белок G очищенный
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1 Антитело, кролик MAbSinoBiological40150-R007
Азид натрияMilliporeSigmaS2002Sigma-Aldrich
Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE)ThermoFisher ScientificS21388
Трубчатый револьвер / вращательпремиум-класса ThermoFisher Scientific88881001
TWEEN 20MilliporeSigmaP9416Sigma-Aldrich
xMAP Наборантител CouplngLuminex Corporation40-50016
xMAP INTELLIFLEX DR-SELuminex CorporationINTELLIFLEX-DRSE-RUO

Ссылки

  1. Cameron, A., et al. A multiplex microsphere IgG assay for SARS-CoV-2 using ACE2-mediated inhibition as a surrogate for neutralization. Journal of Clinical Microbiology. 59 (2), 02489(2020).
  2. Waterboer, T., et al. Multiplex human papillomavirus serology based on in situ-purified glutathione s-transferase fusion proteins. Clinical Chemistry. 51 (10), 1845-1853 (2005).
  3. Pickering, J. W., et al. A multiplexed fluorescent microsphere immunoassay for antibodies to pneumococcal capsular polysaccharides. American Journal of Clinical Pathology. 117 (4), 589-596 (2002).
  4. Ayouba, A., et al. Development of a sensitive and specific serological assay based on Luminex technology for detection of antibodies to Zaire Ebola virus. Journal of Clinical Microbiology. 55 (1), 165-176 (2017).
  5. Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M. Isotype determination of antibodies. Current Protocols in Immunology. Vastl, J. 116, 1-7 (2017).
  6. Angeloni, S. Multiplex Bead Mixes Made Easy with an Excel-Based Bead Calculator. , Available from: https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/ (2020).
  7. EUA Authorized Serology Test Performance. FDA. , Available from: https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance (2020).
  8. Indirect ELISA protocol. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf (2021).
  9. Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method. Journal of Visualized Experiments. (65), e4084(2012).
  10. Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 872-876 (2002).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

IgG IgMACE2

Похожие статьи