Описанный протокол описывает процедуру получения белкового комплекса HiBiT-рецептор-связывающего домена и его применение для быстрого и чувствительного обнаружения антител к SARS-CoV-2.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Обнаружение рецептор-связывающего домена антитела SARS-CoV-2 с помощью биорепортера на основе HiBiT
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Появление пандемии COVID-19 увеличило потребность в более совершенных серологических методах выявления для определения эпидемиологического воздействия тяжелого острого респираторного синдрома коронавируса 2 (SARS-CoV-2). Растущее число инфекций SARS-CoV-2 повышает потребность в лучших анализах обнаружения антител. Современные методы обнаружения антител ставят под угрозу чувствительность для скорости или являются чувствительными, но отнимают много времени. Большая часть SARS-CoV-2-нейтрализующих антител нацелена на рецептор-связывающий домен (RBD), один из первичных иммуногенных компартментов SARS-CoV-2. Недавно мы спроектировали и разработали высокочувствительный, биолюминесцентный RBD (NanoLuc HiBiT-RBD) для обнаружения антител к SARS-CoV-2. В следующем тексте описывается процедура получения комплекса HiBiT-RBD и быстрый анализ для оценки наличия антител, нацеленных на RBD, с использованием этого инструмента. Благодаря долговечности белкового продукта HiBiT-RBD в широком диапазоне температур и более короткой экспериментальной процедуре, которая может быть завершена в течение 1 ч, протокол можно рассматривать как более эффективную альтернативу для обнаружения антител к SARS-CoV-2 в образцах сыворотки крови пациента.
Введение
Недавнее появление нового коронавируса SARS-CoV21 вызвало более 2 800 000 смертельных случаев и 128 миллионов инфекций по состоянию на 30 марта 20212 года. Из-за отсутствия надежной и хорошо отлаженной процедуры лечения для клинической терапии SARS-CoV-2 было предпринято много усилий по ограничению дальнейшей передачи вируса и, что более важно, по разработке эффективного и надежного лечения или вакцины3. На сегодняшний день в испытаниях, о которых сообщила Всемирная организация здравоохранения4, насчитывается более 50 вакцин-кандидатов на вакцину от COVID-19. Выя....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол, описанный ниже, придерживается всех этических принципов в соответствии с протокольным кодом 20200371-01H.
1. Производство и оценка биорепортера HiBiT-RBD
- Производство достаточного количества биорепортера HiBiT-RBD
- Подготовка к культуре клеток
- Приготовьте полную модифицированную среду Dulbecco Eagle (DMEM), содержащую 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицина. Затем согрейте среду на водяной бане с температурой 37 °C.
- Включите шкаф биологической безопасности (BSC) и используйте этанол 70% v/v для стерилизации поверхности шкафа.
- Культивиру....
- Подготовка к культуре клеток
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Сигналы как от HiBit-RBD-содержащего клеточного лизата, так и от супернатанта трансфектированных клеток были записаны (рисунок 2) для оценки соответствующего источника белка. HiBiT-RBD и LgBit использовались отдельно в качестве элементов управления, и данные показали низкий фон по сравнению с сильным сигналом, когда обе части были объединены. Следовательно, взаимодействие HiBiT-RBD с LgBiT необходимо для генерации активного фермента для переваривания субстрата и биолюминесцентной активности .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Растущее число людей, инфицированных SARS-CoV-2, и продолжающиеся усилия по глобальной вакцинации требуют чувствительных и быстрых серологических тестов, которые могут быть использованы в крупномасштабных серообследовании. Недавние исследования показывают, что биорепортеры на основе расщепленной нанолюциферазы могут быть использованы для разработки таких анализов. Недавно мы разработали биорепортер HiBiT-RBD для разработки теста, который можно использовать для быстрого и надежного обнаружения специфических антител к SARS.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Мы ценим и благодарим за техническую помощь Сяохун Хэ, Рикардо Мариуса, Джулии Петрик, Брэдли Остина и Кристиано Танезе Де Соуза. Мы также благодарим Мину Гахремани за графический дизайн. Мы также хотели бы поблагодарить всех людей, которые приняли участие и сдали свои образцы крови для этого исследования. DWC частично поддерживается факультетом uOttawa и кафедрой медицины.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 5x Пассивный буфер для лизиса | Promega | E194A | 30 мл |
| Bio-Plex Ручная магнитная шайба | Bio-Rad | 171020100 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | |
| Dual-Glo люциферазная система | Promega | E2940 | 100 мл набор |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Sigma | F1051 | |
| HiBiT-RBD Плазмида | gacggatcgggagatcccgatcctatggt gcactctcagtacaatctgctgccgcata gttaagccagtatctgctgctggttggtgg aggtcgctgagtgagtagta agcgcgaaaattta agctacaacaaggcaaggctgctgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttaggtttttg cgctgcttcgcgtg cgctcttcgcgatgatacgggccagatatacgc gtgacattgattgactagttattaatagt aatcaattacgggtcattagttcatagcccat atattggagttccgcgttacataacttacggtaa atggcgcgctggctgaccgcccggctgaccc ccgcccattgacgtcaatgaccc atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtattatttacggtaaactgcactt tggcagtacatcaagtatcatatgccaagta cgccccctattgacgtcaatgacgtaaaatgg cccgcctggcatgcatgaccttat gggactttttggcagtacatctactatg gggactttggcagtacatcattat tagtcatcgctattattatggtgatgcgttt ggcagtacatcaatgggcgtttg actcacgggagtttg acgtcaatgggagtttggcaccaaatc aacgggactttccaaaatgtcgtaaatgtcgtaacacggg ccccattgacgcaaatggcgta ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg aaattaatacgactcactatagggagacccaa gctggctagcgtttaaacttaagcttgaccga gctcggatccgaccATGGAGACAGA CACACTCCTGCTATGGGTACTGC TGCTGGGTTCCAGGTTCCACC TGGTGACtctggctctagcggctggctctctct agcggcggcATGGTGAGCGGCTG GCGGCTGTTCAAGAAGATTAGC tctagcggcGACTACAAGGACCA ACGACGACTACAAGGACGAC GACGACAAGggcagcggctctccggca gcagggaggagggaggctctgggga ggctgggagggagga ggctcggcggcaaatgtg cccattcggcggcgagggagatg ttgccagcgtatgcctggaaccggaagaga atctctaattgcgtggggcgactatagcgtgct gtacaatagcctccttctctctacctttaagt gctatggcgtcccccacaaaagctgaacgac ctgtgcttcaccaacgtgtacgccgactctttttgtacgccgacttttgt gatcaggggcgatgaggtgcgccagatcgc acctggacgacaggcaagatcgactac aactataagctgccagatttcaccggct gcgtgatcgcctggaatagcaaatctggatt ccaaagtggcggcaactacaattatctct cggctgtgttcagaagaagaacctgaagccctt tgagcgggatatcagcacaccaccagag gcaggcgagatccaccttgcaagggaggagg ttccagcctaaaatggcgtgggctatcagcca tacagggtggtgctctctttттттgagctg cacgcacctgcaaccgtcctctggacacatc gagggcccacatgctggagatggccatc atcaccatccatcaccactgatag cggccgctcgagtctagggcccgtttaaac ccgctcagcctcgactgtgttctagtt gccagcttctagtt gccagccatgtgccggg ccttccttgaccctggaccc tgtcctttcctaatgaaatgaggaaattgcat cgcattgtgtctgagtaggtgga ggattgggga ggattggg gatgggtggggg gatgggtgggctctggtgagggaa agaaccagctggggctctagggggtatcccca cgcgcctagcggcggcgcattaagcgcggcg ggtgtggtgttacgcgcggcg ggtggtgaccgctac acttgccagccgcccggcccg ctttcttccctttccctctt tccccgtcaagctctaaatcgggggcttta gggttccggatttagtgttacggcaccgacc ccaaaaaactttagttagggtgtgagacggtttttcgcc ctttgacgtgtttcgcc ctttgacgtggagtggagtcccctttttttaatg gactcttgttccaaactggaacaccaacc ctatctcggtctatttattttttattattattggttaaaaatgagctg Атттаааааааттаааааааааа; cgcatgattgaacaagatggattgcacgcagg ttctccggcgctggtggggtggc tatgactgggcacaaatcggctct gatgccgcggctgtcagcggttttttgtcaagaccggg tgccctgaatgaactgcaggcaggcagcg cggctatcggcggcggggcct tgcgcagctgcgtcactgaagcg ggaagggactggc ggggcaggatctcctgtcatctcaccttg ccgagaaagtatccatggctgctgcatgctgcaatg agcgagcacgtactcggatggaagccggtct tgtcgatcaggatgatggacgaagagcat caggggctcgcgcgccgaactgttcgcca ggctcaaggcgcgcatgcccgcgagg atctcgtcgtgacccatggcgatgcctgctg ccgaatatcatggtggaaatggccttt ctggattcatcgactgtggccgggggtgt ggcgggggggt ggcggaccgcctatcaggacatagtggct acccgtgatggtgaagagctggcggcg aatgggctgctgctcctcgtgctttacgg tatcgccgctcgattcgcgcgcc ttctatcgcctttgcgcgcc ttctatcgcctttgacgagttcttctgagcg ggactctgggggttcgaaatgaccggaag cgacgcccaacctgccatcgaggat TCCACCGCCGCCTTCTATGAAAAGGTTGGGCTT CGGAATCGTTTTCCGGGGGGGGGGGGATGA TCCTCCAGCGGGGGATGAGT TCTCGCCCCCCAACTTTTTTTTGCAGCTTA TAATGGTTAAAAAAGCAAAGCACAA ATTTCAAAAAAGTTTTTTTTCACTGCATT CTAGTTGGTGTGTGTGTGTGTGTATTCATCATAT CTTATGTGTCTATACCGTCGATTATT AGAGCTGGCGTGTGTATTATTC CTGTGAAATTATTC CTGTGAAATTATTATTATTC CTGTGAAATTATTCCGCAATCCACACAC AACATACGAGCCGGAAGGAAGCATAAAAG CCTGGGGTGAAAAG CCTGGGGTGCTAACTCACAT TAATTGCGTGTTGCCTCACTGCCCCCCCTCTCT gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaa tcggccaacgcggggagaggcgttttgcg tattgggcgcttccgctcc gctgcgctcggtcgttcggctgcggcggt atcagctcactcaaaggcggtaatacgttc cacagaatcagggaagaa catgtgagcaaggccagcaagcaaggccag gaaccgtgaaaggccag gaaccgtaggccg gaacctgaaggccttt tccataggctccgccccctgcccctgccctgacgagcatcac aaaaatcgacgctcaagtcagagggcgaa acccgaggactataaagataccaggcgtt tccccctggaagctccctt ccgaccctgctct ТТТТТКККТТКГГГГАагГТГГтггГКГКГгГТГтГТГгГТГтГТГгГТГТгГТКГГТкгГТГТкгГТКГгГТГКГгГТКГГТкгГТКГТТ АгтГТГТГтГТКГГтГТКГтГТКГГтГТГГтГТГГтГГаГТГ ctcaagaagatcctttgatcttttttctacggt ctgacgctcagtggaaaaactcacttaa gggattttggtcatgagattatcaaaaggatct tcacctagatccttttaaagtt ttaaatcaatctaaaaagtatgaaaactt ggtctgacagtgagtcagtcaatgtaatcagg cacctatctcagcgatctcttcatttctcatcca tagttgcactccccgtcccgtcgtcgt gccgggaagctagtaagtagttcgccagtt aatagtttttgcccaacgttgttgccattgctacag gcatcgtggtgtcacgctcgtgtggtatgg cttcattcagctccggttcccaacgatcaaggc gagttacatgatcccccatgttgtgcaaaag cggttagctccttcggtcctccgatcgtgtca gaagtaagttggccgcagttatcactcatggt tatggcagcactgcatgcataatttactgtgtcatg ccatccgtaagatgctttttgactggtgagtatgcg gcaccgagtgctctgctgcggcggcggccaattaa a aagtgctccatggaaaacgtggggc gaaaactctcaaggattaccgctgcttgagat ccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaact gatcttcagcattttttttcacccgtttc tgggtgagcaaaaggaaaagcaaaatgc cgcaagggaaggcgacgga aatgttgaatactactcttcctttttttcaat attattgaagcattcaggtattc tcatgagcggatacatatttgaattttt agaaaaaggggttccgcgca catttccgaaaagtgccgaaagtgcc | ||
| LgBiT | Promega | N3030 | |
| пенициллин стрептомицин | Thermo Fisher Scientific | ||
| Магнитные бусины Pierce Protein G | Thermo Fisher Scientific | 88848 | |
| PolyJet In Vitro ДНК Реагент для трансфекции | Signagen | SL100688,5 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike нейтрализующее антитело, мышиный маб | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Synergy Mx Микропланшетный ридер | BioTek | 96-луночный планшетный ридер люминометр | |
| Трипсин-ЭДТА | Thermo Fisher Scientific | 2520056 | 0,25% |
Ссылки
- Ullah, H., Ullah, A., Gul, A., Mousavi, T., Khan, M. W. Novel coronavirus 2019 (COVID-19) pandemic outbreak: A comprehensive review of the current literature. Vacunas. , (2020).
- Coronavirus update (Live). Worldometer. , Available from: https://www.worldometers.info/coronavirus/ (2021).
- Cacciapaglia, G., Cot, C., Sannino, F.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
