Методическая статья

Анализ молекулярной пружинной константы с помощью зондовой спектроскопии биомембранных сил

DOI:

10.3791/62490

⸱

20 ноября 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering, The University of Sydney, 2Charles Perkins Centre, The University of Sydney, 3Heart Research Institute, 4Department of Chemistry, The Hong Kong University of Science and Technology, 5School of Aerospace, Mechanical and Mechatronic Engineering, Faculty of Engineering, The University of Sydney

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Биомембранный силовой зонд (BFP) - это метод динамической силовой спектроскопии in situ (DFS). BFP может быть использован для измерения пружинной постоянной молекулярных взаимодействий на живых клетках. Этот протокол представляет весенний постоянный анализ молекулярных связей, обнаруженных BFP.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Биомембранный силовой зонд (BFP) недавно появился как наноинструмент для нативной клеточной поверхности или динамической силовой спектроскопии in situ (DFS), который может измерять кинетику одномолекулярного связывания, оценивать механические свойства взаимодействий лиганд-рецептор, визуализировать динамические конформационные изменения белка и более захватывающе разъяснять механизмы механозонирования клеток, опосредованные рецепторами. Совсем недавно BFP был использован для измерения пружинной постоянной молекулярных связей. Этот протокол описывает пошаговую процедуру выполнения анализа DFS с константой молекулярной пружины. В частности, обсуждаются два режима работы BFP, а именно режимы Bead-Cell и Bead-Bead. Этот протокол фокусируется на получении пружинных констант молекулярной связи и клетки из необработанных данных DFS.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В качестве метода DFS с живыми клетками BFP разрабатывает эритроцит человека (RBC; Рисунок 1) в сверхчувствительный и настраиваемый преобразователь силы с совместимым постоянным диапазоном пружин при 0,1-3 пН/нм1,2,3. Для зондирования взаимодействия лиганд-рецептор BFP позволяет проводить измерения DFS при ~1 пН (10-12 Н), ~3 нм (10-9м) и ~0,5 мс (10-3 с) в силе, пространственном и временном разрешении 4,5. Его экспериментальная конфигурация состоит из двух противоположных микропипет, а именно зонда и мишени. Микропипетка Probe аспирирует эрицит, и шарик приклеивается на его вершине посредством взаимодействия биотин-стрептавидин. Шарик покрыт интересующих лигандами(рисунок 1А). Микропипетка-мишень аспирирует либо клетку, либо бусину, несущую интересующих рецептор, соответствующий режимам Бисероплетение(Рисунок 1В)и Бусина-Бусина(Рисунок 1С),соответственно5.

Построение, сборка и экспериментальные протоколы DFS были подробно описаныранее 1,6. Вкратце, сенсорный цикл BFP состоит из 5 этапов: подход, ущемление, контакт, втягивание и диссоциат(рисунок 1D). Горизонтальная вершинная позиция RBC обозначается как ΔxRBC. В начале безударная (с нулевой силой) деформация RBC ΔxRBC равна 0(таблица 1). Затем мишень приводится в движение пьезотранслятором для впрызания и втягивания из шарика зонда(рисунок 1D). Зонд RBC сначала сжимается мишенью с отрицательной деформацией RBC ΔxRBC < 0. В событии Связи стадия втягивания переходит из сжимающей в растягиваемую фазу с положительной деформацией RBC ΔxRBC > 0(рис. 2C и D). Согласно закону Гука, несущая сила BFP может быть измерена как F = kRBC × ΔxRBC, где kRBC (Таблица 1)— константа пружины RBC BFP. При разрыве связи и завершении цикла одного касания шарик зонда возвращается в положение с нулевой силой при ΔxRBC = 0(рисунок 1D).

Чтобы определить kRBC,мы измеряем и регистрим радиусы внутреннего отверстия микропипетки зонда(Rp),RBC(R0)и круговой области контакта(Rc)между RBC и шариком зонда(рисунок 1A). Затем kRBC вычисляется по модели Эвана (Eq. 1) 7,8 с использованием программы LabVIEW, которая действует как виртуальный инструмент (VI) для работы BFP(рисунок S1A)8,9.

Уравнение статического равновесия для kRBC в гидродинамике, показывающее переменные и логарифмические члены. (Экв. 1)

Установив БФП и получив исходные данные DFS, мы представляем, как анализировать пружинную константу пары лиганд-рецептор или клеток. Исходные данные DFS о взаимодействии гликозилированного белка Thy-1 и клетки K562, несущей интегрин, α5β1 (Thy-1-α5β1; Фиг.3А и 3В)10и фибриноген и интегрин с шариковым покрытием αIIbβ3 (FGN-αIIbβ3; Рисунок 3C) 11,12 были использованы для демонстрации режимов анализа Бисероплетняя клетка и Бисероплета, соответственно.

Экспериментальная подготовка BFP
Для получения подробной информации об экспериментальной подготовке и приборах BFP, пожалуйста, обратитесь к ранее опубликованным протоколам3. Короче говоря, человеческий эриртикат был биотинилирован с использованием Biotin-PEG3500-NHS в буфере углерода / бикарбоната. Интересуемые белки были ковалентно соединены с боросиликатными стеклянными шариками с использованием MAL-PEG3500-NHS в фосфатном буфере. Для прикрепления к биотинилированному эрициту шарик зонда также покрывают стрептавидином (SA) с использованием MAL-SA. Пожалуйста, ознакомьтесь с Таблицей материалов и Таблицей 2.

Для сборки BFP(рисунок 1, слева)третья микропипетка, названная «Помощник», будет использоваться для доставки шарика зонда и приклеивания его к вершинеRBC 1,3. Ковалентное взаимодействие между шариком зонда с покрытием SA и биотинилированным RBC намного сильнее, чем интересуящее связь лиганд-рецептор. Таким образом, диссоциатная стадия может быть интерпретирована как разрыв связи лиганд-рецептор, а не отделение шарика зонда от эрицита.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Получение анализируемых событий DFS

  1. Запустите эксперимент в программном обеспечении (например, LabVIEW VI) для управления BFP и настройки параметров(рисунок S1A).
  2. Наблюдайте за повторяющимися касаниями шариков/ячеек в программном обеспечении для монитора BFP(рисунок S1B).
  3. Проверьте и достигните частоты сцепления ≤ 20% в течение первых 50 касаний, настроив силу столкновения и время контакта, с помощью которых он гарантирует, что ≥ 89% событий сцепления DFS опосредованы одиночными связями12,13,14.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой пары Бисероплетения и Ячейки/Бусины мы выполняем 200 повторяющихся сенсорных циклов. Для получения качества публикуемых данных мы обычно выполняем n ≥ 3 пары Бисера-Бусина или Бисер-Ячейка.
    1. Сохраните данные в виде Force vs. Time в папку, направленную пользователем, к концу каждой пары, запрашиваемую программным обеспечением для управления BFP и настройки параметров.
  4. Соберите необработанные данные Force vs. Time событий Bond, как показано на рисунке 2A,используя платформу сбора BFP(рисунок S1C).
    1. Откройте программное обеспечение для анализа данных BFP. Нажмите на желтый значок папки и выберите соответствующий файл необработанных данных, дважды щелкнув по ним.
  5. Запустите программу, а затем нажмите кнопку вверх и вниз, чтобы переключаться между событиями. Используйте критерии исключения выбросов(рисунок S2),чтобы отсеять недопустимые события. Выберите экспортируемый тип данных в формате Force vs. Time и нажмите кнопку Экспорт данных графиков.

2. Преобразуйте кривую «Сила против времени» в кривую «сила против смещения»

  1. Экспортируйте сегмент данных, соответствующий этапу Retract, в электронную таблицу(рисунок 2A, квадратная область),которая имеет отношение к анализу пружинной константы.
  2. Построение кривой силы и времени с помощью программного обеспечения для работы с электронными таблицами. Чтобы получить кривую «Сила против смещения», преобразуйте значениявремени (рисунок 2A, ось x)в значения полного смещения (Δxtot)путем умножения значений времени на скорость пьезодвижения (т.е. 4000 нм/с по заданному значению).
  3. Обнулите первую точку данных, вычитая наименьшее значение смещения из каждого приобретенного значения смещения. Это горизонтальное преобразование не влияет ни на восходящие склоны стадии втягивания, ни на последующее вычисление пружинной константы.
  4. Примечательно, что BFP рассматривается как последовательная пружинная система, в которой Δxtot (Таблица 1)суммируют деформации RBC, ΔxRBC (Таблица 1),молекулярную связь, Δxmol (Таблица 1),и Целевую ячейку, Δxячейку (Таблица 1),как Экв. 2:
    Уравнение статического равновесия Δxtot=ΔxRBC+Δxmol+Δxcell, математическая формула. (Экв. 2)
  5. Построй кривую «Сила (F) против смещения (Δxtot)», как показано на рисунке 2B.

3. Весенний cnstant анализ бисерно-клеточного режима

  1. В кривой «Сила против смещения» можно идентифицировать два различных помоя, где каждый из них может представлять фазу сжатия и фазу растяжений. Подогнать линию регрессии к каждой группе данных(рисунок 2B),где больший линейный наклон соответствия представляет собой общую константу пружины на фазе сжатия(рисунок 2B, красный),обозначаемую как k1 (таблица 1); и меньший линейный наклон соответствия представляет собой общую константу пружины на фазе растяжений(рисунок 2B, синий),обозначаемую как k2 (таблица 1).
  2. Для пружин, соединенных последовательно на этапе 2.2 описания, выражают обратную величину полнойконстанты пружины, ktot(таблица 1),как сумму пружинной константы, обратной РБК, kRBC (Таблица 1),молекулярной связи, kмоль (Таблица 1),и Целевой ячейки, kячейки (Таблица 1). Во время сжимающей фазы режима «шарик-клетка» молекулярная связь не растягивается, поэтому kмоль не принимается во внимание. Обратная k tot в этом сценарии (1/k1)выражается как
    Уравнение, представляющее кинетику клетки в биологии; Диаграмма кинетических констант: k1, kRBC, kcell. (Экв. 3).
    В примере данных предварительно определено k RBC (по умолчанию 0,25 пН/нм). kячейка может быть получена из экв. 3 с приобретенными k1 и kRBC (рис. 3B).
  3. Во время фазы растяживания образуется адгезия между парой лиганд-рецептор. Выражают обратнуюktot в этом сценарии (1/k2)как
    Уравнение сопротивления последовательно, показывающее 1/k2 = 1/kRBC + 1/кмоль + 1/kcell, использованное в исследовании кинетики. (Экв. 4)
    где k2 (Таблица 1)представляет собой общую постоянную пружины во время фазы растязывки.
  4. Получить kмоль из вычитания 1/k1 из 1/k2 (сравните Eq. 3 и Eq. 4).

4. Весенний постоянный анализ режима бисера-бисера

  1. Подогнать линию регрессии к данным фазы сжатия для получения k1 (аналогично рисунку 2B, красный). Следует отметить, что в режиме Бисера-Бусина ячейка Target заменяется стеклянной бусиной, покрытой интересующих рецептором(рисунок 1C). Поскольку деформация шарика незначительна, член1/k-клетки может быть удален из Eq. 3 и Eq. 4 соответственно. Обратный k-тот фазы сжатия (1/k1)может быть выражен как:
    Уравнение, показывающее взаимосвязь: 1/k1 = 1/kRBC; ключ для констант кинетической скорости в биохимическом анализе. (Экв. 5)
  2. Подогнать линию регрессии к данным фазы растязания для получения k2 (аналогично рисунку 2B, синий). Обратная k-тота растягиваемой фазы (1/k2)может быть выражена как:
    Уравнение скорости реакции, диаграмма обратных констант скорости; Термины k2, kRBC, kmol для кинетического анализа. (Экв. 6)
  3. Получить kмоль из вычитания 1/k1 из 1/k2 (сравните Eq. 5 и Eq. 6).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой работе мы продемонстрировали протокол анализа пружинных констант BFP. Для режима анализа «шарик-клетка» мы проанализировали kмоль молекулярной связи между гликозилированным белком Thy-1, покрытым на шарике зонда, и интегрином α5β1, экспрессируемым на клетке Target K562 (Thy-1-integrin α5β1; Рисунок 3А) 10.K-ячейка также получена из режима Шарик-Ячейка (K562 Cell;

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Таким образом, мы предоставили подробный протокол анализа данных для предварительной обработки необработанных данных DFS и получения констант молекулярной пружины в режимах анализа BFP Bead-Bead и Bead-Cell. Представлены биомеханические модели и уравнения, необходимые для определения молекулярных и клеточных пружинных констант. Хотя изучаются различные интегрины, kмоль, измеренный режимом Бисера-Бусина и режимом Бисера-Ячейка, обладает значительными различиями в диапазоне(Рисунок ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов для представления информации о настоящем исследовании.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Гийома Троадека за полезную дискуссию, Zihao Wang за консультации по аппаратному обеспечению и Sydney Manufacturing Hub, Грегга Суанинга и Саймона Рингера за поддержку нашего лабораторного стартапа. Эта работа была поддержана Австралийским исследовательским советом Discovery Project (DP200101970 - L.A.J.), Программой наращивания сердечно-сосудистого потенциала Нового Южного Уэльса (грант исследователя в начале и середине карьеры - L.A.J.), премией Сиднейского исследовательского акселератора (SOAR - L.A.J.), Инвестиционным грантом Ramaciotti Foundations Health Investment Grant (2020HIG76 - L.A.J.), Грантом идей Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям (APP2003904 - L.A.J.) и Фондом стартапов факультета инженерных разработок Университета Сиднея и схемой крупного оборудования (L.A.J.). Лайнинг Арнольд Джу является членом Австралийского исследовательского совета DECRA (DE190100609).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
3-Меркаптопропилтриметоксисилан (MPTMS)Uct, Specialties, LLC4420-74-0Функционализация стеклянных шариков
Anhy. Двухосновной фосфат натрия (Na2HPO4)Sigma-AldrichS7907Фосфатный буферный препарат
BFP сбор данных VILabVIEWBFP контроль и настройка параметров
BFP анализ данных VILabVIEWBFP анализ исходных данных
Biotin-PEG3500-NHSJenKemA5026-1RBC биотинилирование
Боросиликатные стеклянные шарикиDistrilab Particle Technology, Нидерланды9002Функционализация стеклянных шариков
Бычий сывороточный альбуминSigma-AldrichA0336Лиганд Функционализация
Камера VILabVIEWBFP monitoring
D-глюкозаSigma-AldrichG7021Tyrode' s буферный препарат
HepesSigma-AldrichH3375Tyrode' s буферный препарат
MAL-PEG3500-NHSJenKemA5002-1Функционализация стеклянных шариков
Хлорид калия (KCl)Sigma-AldrichP9541Tyrode' s буферный препарат
Бикарбонат натрия (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761Карбонат/бикарбонатный буферный препарат; Тирод s Буферный препарат
Карбонат натрия (Na2CO3)Sigma-AldrichS2127Карбонат/бикарбонатный буферный препарат
Sodium Chloride (NaCl)Sigma-AldrichS7653Tyrode' s буферный препарат
Натрия фосфат одноосновной моногидрат (2PO4• H2O)Sigma-AldrichS9638Фосфатный буферный препарат
стрептавидин-малеимидSigma-AldrichS9415Функционализация стеклянных шариков

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chen, Y., et al. Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell. The Journal of Visualized Experiments. (102), e52975(2015).
  2. Su, Q. P., Ju, L. A. Biophysical nanotools for single-molecule dynamics. Biophysics Reviews. 10 (5), 1349-1357 (2018).
  3. Ju, L. Dynamic Force Spectroscopy Analysis on the Redox States of Protein Disulphide Bonds. Methods in Molecular Biology. 1967, 115-131 (2019).
  4. An, C., et al. Ultra-stable Biomembrane Force Probe for Accurately Determining Slow Dissociation Kinetics of PD-1 Blockade Antibodies on Single Living Cells. Nano Letters. 20 (7), 5133-5140 (2020).
  5. Chen, Y., Ju, L., Rushdi, M., Ge, C., Zhu, C. Receptor-mediated cell mechanosensing. Molecular Biology of the Cell. 28 (23), 3134-3155 (2017).
  6. Ju, L., Chen, Y., Rushdi, M. N., Chen, W., Zhu, C. Two-Dimensional Analysis of Cross-Junctional Molecular Interaction by Force Probes. Methods in Molecular Biology. 1584, 231-258 (2017).
  7. Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces. Biophysical Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).
  8. Ju, L., Zhu, C. Benchmarks of Biomembrane Force Probe Spring Constant Models. Biophysical Journal. 113 (12), 2842-2845 (2017).
  9. Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces. Biophysical Journal. 68, 2580(1995).
  10. Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex. Nature Communications. 5, 4886(2014).
  11. Passam, F., et al. Mechano-redox control of integrin de-adhesion. Elife. 7, (2018).
  12. Chen, Y., et al. An integrin alphaIIbbeta3 intermediate affinity state mediates biomechanical platelet aggregation. Nature Materials. 18 (7), 760-769 (2019).
  13. Chen, Y., Lee, H., Tong, H., Schwartz, M., Zhu, C. Force regulated conformational change of integrin αVβ3. Matrix Biology. 60, 70-85 (2017).
  14. Liu, B., Chen, W., Zhu, C. Molecular force spectroscopy on cells. Annual Review of Physical Chemistry. 66, 427-451 (2015).
  15. Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation. Biophysical Journal. 74 (1), 492-513 (1998).
  16. Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. The N-terminal flanking region of the A1 domain regulates the force-dependent binding of von Willebrand factor to platelet glycoprotein Ibα. Journal of Biological Chemistry. 288 (45), 32289-32301 (2013).
  17. Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals. Elife. 5, 15447(2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Biomembrane Force ProbeMolecular Spring ConstantDynamic Force SpectroscopySingle Molecule BindingLigand Receptor InteractionCell MechanosensingBead Cell ModeBead Bead ModeForce Versus DisplacementHooke s Law

Похожие статьи