Этот протокол представляет собой сравнение двух различных протоколов индукции для дифференциации стволовых клеток пульпы зубов человека (hDPSC) к линиям поджелудочной железы in vitro:интегративный протокол и неинтегративный протокол. Интегративный протокол генерирует больше инсулин-продуцирующих клеток (IPC).
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
In vitro Индукция стволовых клеток пульпы зубов человека к линиям поджелудочной железы
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
По состоянию на 2000 год успех трансплантации островков поджелудочной железы с использованием протокола Эдмонтона для лечения сахарного диабета I типа все еще сталкивался с некоторыми препятствиями. К ним относятся ограниченное число трупных доноров поджелудочной железы и долгосрочное использование иммунодепрессантов. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) считаются потенциальным кандидатом в качестве альтернативного источника генерации островковых клеток. Наши предыдущие доклады успешно проиллюстрировали создание индукционных протоколов для дифференциации стволовых клеток пульпы зубов человека (hDPSC) к инсулин-продуцирующие клетки (IPC). Однако эффективность индукции сильно варьировалась. В этой статье мы демонстрируем сравнение эффективности индукции поджелудочной железы hDPSC с помощью интегративных (микроэкологические и генетические манипуляции) и неинтегративных (микроэкологические манипуляции) протоколов индукции для доставки IPC, полученных из hDPSC (hDPSC-IPCs). Результаты показывают различную эффективность индукции для обоих подходов индукции с точки зрения 3-мерной колониальной структуры, выхода, маркеров мРНК поджелудочной железы и функционального свойства при многодозовом вызове глюкозы. Эти результаты будут поддерживать будущее создание клинически применимой платформы для производства IPC и линии поджелудочной железы.
Введение
Сахарный диабет является постоянной глобальной проблемой. В докладе Международной федерации диабета (IDF) подсчитано, что глобальная распространенность диабета увеличится со 151 миллиона в 2000 году до 415 миллионов в 2015году 1,2. Последнее эпидемиологическое исследование предсказало, что предполагаемая распространенность диабета во всем мире увеличится с 451 миллиона в 2017 году до 693 миллионов в 2045году1. Успех трансплантации островков поджелудочной железы с использованием протокола Эдмонтона был впервые продемонстрирован в 2000 году, когда было показано, что он поддерживает эндогенную выработку инсулина и стабилизирует нормогликемическое состояние у пациентов с диабетом I типа3. Тем не менее, применение протокола Эдмонтона по-прежнему сталкивается с проблемой узкого места. Ограниченное количество трупных доноров поджелудочной железы является основной проблемой, поскольку каждому пациенту с диабетом I типа требуется не менее 2-4 островковых доноров. Кроме того, длительное применение иммунодепрессантов может вызвать опасные для жизни побочные эффекты4,5. Чтобы решить эту проблему, разработка потенциальной терапии диабета в последнее десятилетие в основном была сосредоточена на генерации эффективных инсулин-продуцирующих клеток (IPC) из различных источников стволовых клеток6.
Стволовые клетки стали альтернативным методом лечения многих заболеваний, в том числе диабета I типа, который вызван потерей бета-клеток. Трансплантация МПК является новым перспективным методом контроля уровня глюкозы в крови у таких пациентов7. В данной статье представлены два подхода к генерации IPC, интегративные и неинтегтивные индукционные протоколы. Протокол индукции имитировал естественный процесс развития поджелудочной железы, чтобы получить зрелые и функциональные IPC8,9.
Для этого исследования hDPSC были охарактеризованы проточной цитометрией для обнаружения поверхностных маркеров MSC, многолинейным дифференцированным потенциалом и RT-qPCR для определения экспрессии свойства стволовости и пролиферативных маркеров генов (данные не показаны)8,9,10. hDPSC были индуцированы к окончательным эндодерме, эндодерме поджелудочной железы, эндокринным и панкреатическим бета-клеткам или IPC(рисунок 1),соответственно7. Чтобы индуцировать клетки, в качестве основного протокола использовался трехступенчатый индукционный подход. Этот протокол получил название неи интегративного протокола. В случае интегративного протокола существенный фактор транскрипции поджелудочной железы, PDX1,был переэкспрессирован в hDPSC с последующей индукцией сверхэкспрессированного PDX1 в hDPSC с использованием трехступенчатого протокола дифференциации. Разница между неимте интегративным и интегративным протоколом заключается в сверхэкспрессии PDX1 в интегративном протоколе, а не в неите интегративном протоколе. Дифференциация поджелудочной железы сравнивалась между интегративными и неигративными протоколами в этом исследовании.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Эта работа была выполнена в соответствии с Хельсинкской декларацией и одобрена Комитетом по этике исследований человека, факультет стоматологии Университета Чулалонгкорн. Человеческие DPSC (hDPSC) были выделены из тканей пульпы зубов человека, извлеченных как из премоляров, так и из моляров из-за проблем с зубами мудрости. Информированное согласие было получено от пациентов по утвержденному протоколу (HREC-DCU 2018/054).
1. Интегративный индукционный протокол
- Получение лентивирусного вектора, несущего PDX1
- Используйте человеческие эмбриональные почки (HEK) 293FT клетки для вирусной упаковки. Культивировать и поддерживать эти клетки в модифицированной орлиной среде (DMEM) Dulbecco, дополненной 10% фетальной бычий сывороткой (FBS), 1% L-глутамином и 1% антибиотиком-антимикотиком.
- Генерация PDX1-лентивирусныхвекторов путем совместной трансфекции 10 мкг каждой из плазмид упаковки и оболочки и 20 мкг целевой плазмиды гена в клетки HEK293FT с использованием системы трансфекции фосфата кальция, например, psPAX2, pMD2. G, и человеческий pWPT-PDX111. Убедитесь, что клетки на 80%-90% сливаются во время инфекции.
- Собирают среду, содержащую лентивирусные частицы, через 48 и 72 ч после трансфекции.
- Фильтровать собранную среду через фильтр 0,45 мкм; концентрировать вирусы центробежным фильтром при номинальном отсечке молекулярной массы 100 кДа (НМЗКО).
- Сверхэкспрессия PDX1
- Используйте проход 3-5 hDPSC, которые на 70-80% сливаются. Трипсинируйте и подсчитывайте ячейки с помощью счетчика ячеек. Посейте 1 x 106 hDPSC на 60 мм тканевую культуру посуды и инкубируют в течение ночи.
- Через 24 ч добавляют свежие вирусные частицы, полученные на стадии 1.1.4, для трансдукции предварительно обработанных полибренов клеток (4 мкг/мл полибрена, 30 мин при 37°С и 5% CO2)при желаемой кратности инфекции (MOI). Например, в данном случае используется МВД 20. Выдерживают клетки в инкубаторе клеточных культур в течение 24 ч при 37 °C с 5% CO2.
- После 24-х ч периода заражения выбросьте среду, содержащую вирусные частицы. Добавьте свежие культуральная среда и продолжайте выращивать клетки в течение 48 ч. Все культуры поддерживаются при 37 °C и 5% CO2.
- Проверьте агрегированную морфологию трансфекционных клеток, прежде чем перейти к этапу индукции. Трансдукция PDX1 подтверждается анализом экспрессии генов(Дополнительный рисунок 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте морфологию клеток под микроскопом, прежде чем переходить к следующим шагам. - Соберите и перейдите к трехступенчатой индукционной протоколе (этап 1.3) в качестве подхода к микроэкологии.
- Трехступенчатый индукционный протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Трехступенчатый протокол индукции привел к серии дифференцировки поджелудочной железы hDPSC к окончательной эндодерме, эндодерме поджелудочной железы / эндокринным и бета-клеткам / IPC поджелудочной железы с использованием безывороточной среды (SFM)-A, SFM-B и SFM-C, соответственно.- Выбрасывают питательную среду, а затем промывают трансдуцированные hDPSC 1x фосфат-буферным раствором (PBS).
- Добавляют к клеткам 0,25% раствор трипсина-ЭДТА и инкубируют в течение 1 мин при 37 °C, 5% CO2.
- Добавьте культурную среду, чтобы остановить активность трипсина, и осторожно промыть клетки, чтобы получить одноклеточную суспензию. Подсчитайте клетки и аликвот 1 х 106 клеток в каждую собирающей трубку.
- Центрифугируют клеточную суспензию при 468 х г (относительная центробежная сила: RCF), 4 °C, в течение 5 мин. Выбросьте супернатант и сохраните ячейку гранулы.
- Повторно суспендируют гранулу в 3 мл первой индукционной среды поджелудочной железы, т.е. безсыворочной среды (SFM)-A. Засеять клетки на культурную пластину с низким прикреплением (60 мм). Поддерживайте клетки при 37 °C и 5% CO2 в течение 3 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Понаблюдайте за морфологией клеток под инвертным микроскопом, прежде чем перейти к следующему шагу. - Удалите SFM-A и добавьте 3 мл второй индукционной среды, т.е. SFM-B. Выдерживая клетки в течение следующих 2 дней при 37 °C, 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Понаблюдайте за морфологией клеток под инвертным микроскопом, прежде чем перейти к следующему шагу. - Удалите SFM-B и добавьте 3 мл третьей индукционной среды, т.е. SFM-C. Поддерживайте клетки в течение следующих 5 дней в инкубаторе клеточных культур, поддерживаемом при 37 °C с 5% CO2. Меняйте среду каждые 48 ч. Наблюдать их морфологию через 5 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая индукционная среда дополняется различными реагентами, как описано; SFM-A: 1% бычий сывороточный альбумин (BSA), 1x инсулин-трансферрин-селен (ITS), 4 нМ активина А, 1 нМ бутирата натрия и 50 мкМ бета-меркаптоэтанола; SFM-B: 1% BSA, 1x ITS и 0,3 мМ таурина; и SFM C: 1,5% BSA, 1x ITS, 3 мМ таурина, 100 нМ глюкагоноподобных пептидов (GLP)-1, 1 мМ никотинамида и 1x ненезаменимых аминокислот (NEAA). - Обязательно проверяйте морфологию клеток под инвертным микроскопом после каждого шага. Клетки станут более агрегированными и будут плавать как колонии.
- Соберите колонии клеток для дальнейшего анализа. Проверьте морфологию и размер колонии. Выполнение анализа экспрессии генных маркеров поджелудочной железы и функционального анализа (анализ секреции С-пептида, стимулируемого глюкозой).
2. Неинте интегративный индукционный протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Неинтегративный протокол является магистральный протокол для доставки IPC с трехступенчатым процессом индукции в качестве подхода микроэкологии индукции8,9.
- Используют пассаж 3-5 hDPSC при 70%-80% конфлюции.
- Выбросьте питательную среду и промыть hDPSC 1x PBS.
- Добавьте 0,25% раствор трипсина-ЭДТА в клетки и инкубировать в течение 1 мин при 37 °C, 5% CO2.
- Добавьте культурную среду, чтобы остановить активность трипсина, и осторожно пипетку клеток, чтобы получить одноклеточную суспензию. Подсчитайте ячейки и аликвоты 1 х 106 клеток в каждую коллекционную трубку.
- Центрифугировать клеточную суспензию при 468 х г (RCF), 4 °C, 5 мин. Выбросьте супернатант.
- Повторно суспендируют гранулы в SFM-A и высевываем на культурную пластину с низким креплением (60 мм). Культивькуйте клетки при 37 °C и 5% CO2 в течение 3 дней. Проверьте морфологию клеток под инвертным микроскопом.
- Удалите SFM-A, добавьте SFM-B (день 3), а затем поддерживайте клетки в течение следующих 2 дней при 37 °C, 5% CO2.
- Удалите SFM-B, добавьте SFM-C (день 5), а затем поддерживайте клетки в течение следующих 5 дней при 37 °C, 5% CO2. SFM-C меняется каждые 48 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая индукционная среда дополняется различными реагентами, как описано; SFM-A: 1% BSA, 1x ITS, 4 нМ активина А, 1 нМ бутирата натрия и 50 мкМ бета-меркаптоэтанола; SFM-B: 1% BSA, 1x ITS и 0,3 мМ таурина; и SFM C: 1,5% BSA, 1x ITS, 3 мМ таурина, 100 нМ GLP-1, 1 мМ никотинамида и 1x NEAA. - Обязательно проверяйте морфологию клеток под инвертным микроскопом после каждого шага и на 10-й день.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки станут более агрегированными и будут плавать как колонии. - Соберите колонии клеток для дальнейшего анализа. Проверьте морфологию и размер колонии. Выполнение анализа экспрессии генных маркеров поджелудочной железы и функционального анализа (анализ секреции С-пептида, стимулируемого глюкозой).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В этой статье сравнивались результаты обоих протоколов индукции. Диаграммы обоих протоколов индукции проиллюстрированы на рисунке 2A,C. В обоих протоколах оценка проводилась под световым микроскопом, а изображения анализировались с помощью ImageJ. hDPSC смогли сформировать колониеподобные структуры с первого дня индукции в обоих протоколах индукции. Морфология колонии была круглой и плотной, и все колонии плавали в сосудах культуры на протяжении всего периода индукции
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Достижение более высокого производства IPC из МСК играет важную роль в терапии диабета. Критические этапы интегративного протокола зависят от качества клеток, которые будут использоваться для трансдукции, и качества трансдуцированных клеток. Некоторые клеточные требования, которые должны быть проверены для успешной трансдукции, обеспечивают здоровье клеток, управление банком клеток и клетки находятся в митотически активном состоянии. Кроме того, мониторинг жизнеспособности трансдуцированных клеток также играет важную рол...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
SK, WR и QDL были поддержаны Отделом исследований ветеринарных стволовых клеток и биоинженерии, Фондом пожертвований Ratchadaphiseksomphot, Университетом Чулалонгкорн. TO и PP были поддержаны Chulalongkorn Academic Advancement в егопроекте 2-го века. CS был поддержан грантом, поддерживающий исследования факультета ветеринарных наук, академического продвижения Chulalongkorn в его проекте2-го века, Ветеринарного исследовательского подразделения стволовых клеток и биоинженерии, Фонда пожертвований Ratchadaphiseksomphot, Университета Чулалонгкорн и Государственного исследовательского фонда.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Cell Culture | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific Corporation, США | 15240062 | |
| Corning® 60 мм TC-обработанный Culture Dish | Corning® | ||
| Дульбекко' s Модифицированная среда Eagle (DMEM) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 12800017 | |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 10270106 | |
| GlutaMAX™ | Thermo Fisher Scientific Corporation | 35050061 | |
| Порошок фосфатно-солевого буфера (PBS), pH 7,4 | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | Одна упаковка используется для приготовления 1 л раствора PBS со стерильным DDI |
| Trypsin-EDTA (0,25%) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 25200072 | |
| Lentiviral Vector Несущий PDX1 препарат | |||
| Amicon® Центробежный фильтр Ultra-15 | Merck Millipore, США | UFC910024 | |
| человека pWPT-PDX1 плазмида | Addgene | 12256 | Подарок от Дидье Троно; http://n2t.net/addgene:12256; RRID: Addgene_12256 |
| Millex-HV Шприцевой фильтрующий блок, 0,45 &микро; m | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| pMD2.G плазмида | Addgene | 12259 | Подарок от Дидье Троно; http://n2t.net/addgene:12259; RRID: Addgene_12259 |
| полибреновый реагент для инфекции / трансфекции | Merck Millipore | TR-1003-G | |
| psPAX2 plasmid | Addgene | 12260 | Подарок от Дидье Троно; http://n2t.net/addgene:12260; RRID: Addgene_12260 |
| Three-Step Induction Protocol | |||
| Activin A Рекомбинантный человеческий белок | Merck Millipore | GF300 | |
| Бета-меркаптоэтанол | Thermo Fisher Scientific Corporation | 21985-023 | |
| Бычий сывороточный альбумин (BSA, фракция Cohn V, без жирных кислот) | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Глюкагоноподобный пептид (GLP)-1 | Sigma-Aldrich | G3265 | |
| Инсулин-трансферрин-селен (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Никотинамид | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Заменимые аминокислоты (NEAAs) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 11140-050 | |
| Чашка для необработанных клеточных культур, 60 мм | Eppendorf | 30701011 | |
| Бутират натрия | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| Таурин | Sigma-Aldrich | T0625 |
Ссылки
- Cho, N. H., et al. IDF diabetes atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
- Danaei, G., et al. National, regional, and global trends in fasting plasma glucose and diabetes prevalence since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 370 country-years and 2.7 million participants. Lancet. 378 (9785), 31-40 (2011).
- Diabetes Care. Minimizing hypoglycemia in diabetes. Diabetes Care. 38 (8), 1583(2015).
- Health Quality Ontario. Islet transplantation: an evidence-based analysis. Ontario Health Technology Assessment Series. 3 (4), 1-45 (2003).
- Brennan, D. C., et al. Long-term follow-up of the Edmonton protocol of islet transplantation in the United States. American Journal of Transplantation. 16 (2), 509-517 (2016).
- Korsgren, O. Islet encapsulation: Physiological possibilities and limitations. Diabetes. 66 (7), 1748-1754 (2017).
- Kuncorojakti, S., Srisuwatanasagul, S., Kradangnga, K., Sawangmake, C. Insulin-Producing Cell Transplantation Platform for Veterinary Practice. Frontiers in Veterinary Science. 7, 4(2020).
- Sawangmake, C., Nowwarote, N., Pavasant, P., Chansiripornchai, P., Osathanon, T. A feasibility study of an in vitro differentiation potential toward insulin-producing cells by dental tissue-derived mesenchymal stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (3), 581-587 (2014).
- Sawangmake, C., Rodprasert, W., Osathanon, T., Pavasant, P. Integrative protocols for an in vitro generation of pancreatic progenitors from human dental pulp stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 530 (1), 222-229 (2020).
- Kuncorojakti, S., et al. Alginate/Pluronic F127-based encapsulation supports viability and functionality of human dental pulp stem cell-derived insulin-producing cells. Journal of Biological Engineering. 14, 23(2020).
- Ritz-Laser, B., et al. Ectopic expression of the beta-cell specific transcription factor Pdx1 inhibits glucagon gene transcription. Diabetologia. 46 (6), 810-821 (2003).
- Pampusch, M. S., Skinner, P. J. Transduction and expansion of primary T cells in nine days with maintenance of central memory phenotype. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), (2020).
- Fraga, M., et al. Factors influencing transfection efficiency of pIDUA/nanoemulsion complexes in a mucopolysaccharidosis type I murine model. International Journal of Nanomedicine. 12, 2061-2067 (2017).
- Balak, J. R. A., et al. Highly efficient ex vivo lentiviral transduction of primary human pancreatic exocrine cells. Scientific Reports. 9 (1), 15870(2019).
- Balaji, S., Zhou, Y., Opara, E. C., Soker, S. Combinations of Activin A or nicotinamide with the pancreatic transcription factor PDX1 support differentiation of human amnion epithelial cells toward a pancreatic lineage. Cellular Reprogramming. 19 (4), 255-262 (2017).
- Spaeth, J. M., et al. Defining a novel role for the Pdx1 transcription factor in islet β-Cell maturation and proliferation during weaning. Diabetes. 66 (11), 2830-2839 (2017).
- Bastidas-Ponce, A., et al. Foxa2 and Pdx1 cooperatively regulate postnatal maturation of pancreatic β-cells. Molecular Metabolism. 6 (6), 524-534 (2017).
- Zhu, Y., Liu, Q., Zhou, Z., Ikeda, Y. PDX1, Neurogenin-3, and MAFA: critical transcription regulators for beta cell development and regeneration. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 240(2017).
- Ma, D., et al. Culturing and transcriptome profiling of progenitor-like colonies derived from adult mouse pancreas. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 172(2017).
- Tiedemann, H. B., Schneltzer, E., Beckers, J., Przemeck, G. K. H. Hrabe de Angelis, M. Modeling coexistence of oscillation and Delta/Notch-mediated lateral inhibition in pancreas development and neurogenesis. Journal of Theoretical Biology. 430, 32-44 (2017).
- Xu, B., et al. Three-dimensional culture promotes the differentiation of human dental pulp mesenchymal stem cells into insulin-producing cells for improving the diabetes therapy. Frontiers in Pharmacology. 10, 1576(2019).
- Grimm, D., et al. Tissue engineering under microgravity conditions-use of stem cells and specialized cells. Stem Cells and Development. 27 (12), 787-804 (2018).
- Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 10 (1), 1190(2020).
- Li, X. Y., Zhai, W. J., Teng, C. B. Notch signaling in pancreatic development. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 48(2015).
- Motoyama, H., et al. Treatment with specific soluble factors promotes the functional maturation of transcription factor-mediated, pancreatic transdifferentiated cells. PLoS One. 13 (5), 0197175(2018).
- Baldan, J., Houbracken, I., Rooman, I., Bouwens, L. Adult human pancreatic acinar cells dedifferentiate into an embryonic progenitor-like state in 3D suspension culture. Scientific Reports. 9 (1), 4040(2019).
- Wedeken, L., et al. Adult murine pancreatic progenitors require epidermal growth factor and nicotinamide for self-renewal and differentiation in a serum- and conditioned medium-free culture. Stem Cells and Development. 26 (8), 599-607 (2017).
- Trott, J., et al. Long-term culture of self-renewing pancreatic progenitors derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1675-1688 (2017).
- Kim, J. S., et al. Construction of EMSC-islet co-localizing composites for xenogeneic porcine islet transplantation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 497 (2), 506-512 (2018).
- Gauthaman, K., et al. Extra-embryonic human Wharton's jelly stem cells do not induce tumorigenesis, unlike human embryonic stem cells. Reproductive BioMedicine Online. 24 (2), 235-246 (2012).
- Schiesser, J. V., Wells, J. M. Generation of beta cells from human pluripotent stem cells: are we there yet. Annals of the New York Academy of Sciences. 1311, 124-137 (2014).
- Chmielowiec, J., Borowiak, M. In vitro differentiation and expansion of human pluripotent stem cell-derived pancreatic progenitors. The Review of Diabetic Studies. 11 (1), 19-34 (2014).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
