В городе Vivo Двухфотонная визуализация мегакариоцитов и проплацелетов в костном мозге черепа мыши

Alicia Bornert; Fabien Pertuy; François Lanza; Christian Gachet; Catherine Léon

doi:10.3791/62515

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

В городе Vivo Двухфотонная визуализация мегакариоцитов и проплацелетов в костном мозге черепа мыши

4.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62515

⸱

28 июля 2021 г.

Alicia Bornert¹ , Fabien Pertuy¹ , François Lanza¹ , Christian Gachet¹ , Catherine Léon¹

¹INSERM, EFS Grand Est, Université de Strasbourg

В этой статье

Краткое содержание

Здесь описан метод визуализации мегакариоцитов и проплацетов в костном мозге черепа живых мышей с помощью двухфотонной микроскопии.

Аннотация

Тромбоциты вырабатываются мегакариоцитами, специализированными клетками, расположенными в костном мозге. Возможность изображения мегакариоцитов в режиме реального времени и их родной среды была описана более 10 лет назад и проливает новый свет на процесс образования тромбоцитов. Мегакариоциты распространяются на удлиненные протрузии, называемые проплацелетами, через эндотелиальную выстилку синусоидальных сосудов. В данной работе представлен протокол для одновременного изображения в режиме реального времени флуоресцентно меченых мегакариоцитов в костном мозге черепа и синусоидальных сосудах. Этот метод основан на незначительной операции, которая сохраняет череп нетронутым, чтобы ограничить воспалительные реакции. Голова мыши обездвижена кольцом, приклеенным к черепу, чтобы предотвратить движения от дыхания.

С помощью двухфотонной микроскопии мегакариоциты можно визуализировать на срок до нескольких часов, что позволяет наблюдать клеточные протрузии и проplatelets в процессе удлинения внутри синусоидальных сосудов. Это позволяет количественно оценить несколько параметров, связанных с морфологией выступов (ширина, длина, наличие сужающих областей) и их поведением удлинения (скорость, регулярность или наличие пауз или фаз втягивания). Этот метод также позволяет одновременно регистрировать циркулирующие тромбоциты в синусоидальных сосудах для определения скорости тромбоцитов и направления кровотока. Этот метод особенно полезен для изучения роли генов, представляющих интерес, в образовании тромбоцитов с использованием генетически модифицированных мышей, а также поддался фармакологической проверке (изучению механизмов, оценке препаратов при лечении нарушений выработки тромбоцитов). Он стал бесценным инструментом, особенно для дополнения исследований in vitro, поскольку теперь известно, что образование проплатлетов in vivo и in vitro зависит от разных механизмов. Было показано, например, что микротрубочки in vitro необходимы для удлинения проплатлетов как такового. Однако in vivoони скорее служат каркасом, удлинению которого в основном способствуют силы кровотока.

Введение

Тромбоциты вырабатываются мегакариоцитами - специализированными клетками, расположенными в костном мозге. Точный способ высвобождения мегакариоцитами тромбоцитов в циркуляции долгое время оставался неясным из-за технической проблемы в наблюдении событий в реальном времени через кость. Двухфотонная микроскопия помогла преодолеть эту проблему и привела к значительным достижениям в понимании процесса образования тромбоцитов. Первые наблюдения in vivo мегакариоцитов были сделаны фон Андрианом и его коллегами в 2007 году с визуализацией флуоресцентных мегакариоцитов через череп^1. Это стало возможным благодаря тому, что костный слой в лобно-....