Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Изготовление кристаллических наноцеллюлозных встроенных чернил агарозного биоматериала для культуры тучных клеток, полученных из костного мозга

2.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62519

⸱

11 мая 2021 г.

 ,  ,  , 
1Nanotechnology Research Center, National Research Council Canada, 2Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Alberta

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол выделяет метод быстрой оценки биосовместимости кристаллической наноцеллюлозы (ЧПУ) / агарозных композитных гидрогелевых биоматериалных чернил с тучными клетками костного мозга мыши с точки зрения жизнеспособности клеток и фенотипической экспрессии рецепторов клеточной поверхности, Kit (CD117) и высокоаффинного рецептора IgE (FcεRI).

Аннотация

Трехмерная (3D) биопечать использует композиты на основе гидрогеля (или чернила биоматериала), которые наносятся в виде рисунка, образуя субстрат, на который наносятся клетки. Поскольку многие чернила биоматериала могут быть потенциально цитотоксичными для первичных клеток, необходимо определить биосовместимость этих гидрогелевых композитов до их использования в дорогостоящих процессах 3D-тканевой инженерии. Некоторые методы 3D-культивирования, включая биопечать, требуют, чтобы клетки были встроены в 3D-матрицу, что затрудняет извлечение и анализ клеток на предмет изменений жизнеспособности и экспрессии биомаркеров без механического повреждения. Этот протокол описывает в качестве доказательства концепции метод оценки биосовместимости кристаллической наноцеллюлозы (ЧПУ), встроенного в агарозный композит, изготовленный в 24-луночную культуральную систему, с тучными клетками, полученными из костного мозга мыши (BMMCs), с использованием проточных цитометрических анализов жизнеспособности клеток и экспрессии биомаркеров.

После 18 ч воздействия матрицы ЧПУ/агарозы/D-маннитола жизнеспособность BMMC не изменялась по проницаемости йодида пропидия (PI). Однако БММК, культивируемые на субстрате ЧПУ/агарозы/D-маннитола , по-видимому, несколько увеличивают экспрессию высокоаффинного IgE-рецептора (FcεRI) и рецептора фактора стволовых клеток (Kit; CD117), хотя это, по-видимому, не зависит от количества ЧПУ в композите биочернила. Жизнеспособность BMMC также оценивалась после воздействия гидрогелевых каркасов, которые были изготовлены из коммерческих чернил биоматериала, состоящих из фибриллярной наноцеллюлозы (FNC) и альгината натрия с использованием 3D-экструзионного биопринтера. В течение 6-48 ч субстраты FNC/alginate не оказывали неблагоприятного влияния на жизнеспособность BMMCs, определяемую проточной цитометрией и анализами микротитров (XTT и лактатдегидрогеназа). Этот протокол описывает эффективный метод быстрого скрининга биохимической совместимости чернил-кандидатов для биоматериала на предмет их полезности в качестве 3D-каркасов для послепечатного посева тучными клетками.

Введение

Недавний интерес к системам 3D-культур и 3D-биопечати сосредоточил внимание на гидрогелях и гидрогелевых композитах. Эти композиты служат вязкими, но пористыми биомиметиками и могут состоять из содержания до 99% воды по массе, что сопоставимо с биологическими тканями1,2,3. Эти особенности гидрогелевых композитов, таким образом, позволяют расти клеткам, не влияя на их жизнеспособность и функцию. Одним из таких композитов является кристаллическая наноцеллюлоза (ЧПУ), которая использовалась в качестве армирующего материала в гидрогелевых композитах, клеточных каркасах при разработке имплантатов биоматериала, а также в двумерных (2D) и 3D in vitro клеточных культурах4,5. По большей части матрицы, состоящие из ЧПУ, не являются открыто цитотоксичными для эпителиальных клеток роговицы человека6, эпителиальных клеток кишечника7, мезенхимальных стволовых клеток человеческого костного мозга8 или нейроноподобных клеток9. Однако метаболическая активность и пролиферация мезенхимальных стволовых клеток, полученных из костного мозга человека, снижается в корреляции с повышенной вязкостью древесных наноцеллюлозных композитов, что позволяет предположить, что состав матрицы должен быть тщательно проверен на предмет ее вредного воздействия на функции клеток8.

Аналогичным образом, ЧПУ может вызывать воспалительные реакции у макрофагов при интернализации, что может иметь серьезные последствия в системах 3D-культуры иммунных клеток10,11. На самом деле, существует очень мало данных о том, как ЧПУ может влиять на другие иммунные клеточные реакции, особенно аллергические воспалительные реакции, которые инициируются тучными клетками. Тучные клетки представляют собой гранулированные лейкоциты, которые экспрессируют высокоаффинный рецептор IgE, FceRI, ответственный за активацию воспалительных реакций на аллергены. Их пролиферация и дифференцировка зависят от фактора стволовых клеток (SCF), который связывает тирозиновый рецептор Kit. Тучные клетки получены из клеток-предшественников костного мозга, которые входят в кровообращение и впоследствии мигрируют периферически, чтобы повсеместно рассеяться во всех тканях человека12. Поскольку тучные клетки функционируют в 3D-тканевой среде, они являются идеальным кандидатом на иммунные клетки для изучения иммунологических процессов в 3D-моделях тканей in vitro. Однако на сегодняшний день не существует жизнеспособной 3D-модели ткани in vitro, содержащей тучные клетки.

Из-за высокочувствительной природы тучных клеток и их склонности вызывать провоспалительные реакции на внешние раздражители, требуется тщательное рассмотрение составляющих 3D-матрицы и метода биопечати введения тучных клеток в 3D-каркас, как обсуждается далее. Тканевые конструкции могут быть биофабрикцинированы из двух широких категорий биоматериалов, т.е. биочернил и чернил биоматериалов. Различие заключается в том, что биочернила представляют собой насыщенные клетками гидрогелевые композиты, тогда как чернила биоматериала представляют собой гидрогелевые композиты, которые лишены клеток, как определено Groll et al.13,14. Следовательно, 3D-конструкции, напечатанные с помощью биочернил, содержат клетки, предварительно встроенные в гидрогелевую матрицу, тогда как 3D-конструкции, напечатанные чернилами биоматериала, должны быть засеяны клетками после печати. Биофабрикация культивировочных каркасов из биочернил на основе гидрогеля / чернил биоматериала чаще всего выполняется с использованием экструзионных 3D-биопринтеров, которые выдавливают чернила биочернила / биоматериала через микромасштабное сопло под давлением через пневматический или механически управляемый поршень14. Экструзионные биопринтеры изготавливают 3D-каркасы, нанося биочернила в 2D-узоры поперечного сечения, которые последовательно укладываются друг на друга в подходе «снизу вверх».

Чтобы быть совместимыми с экструзионной биопечатью, чернила на основе биочернила/биоматериала на основе гидрогеля должны обладать тиксотропными (разбавляющими сдвиг) свойствами, в результате чего составляющие гидрогелевые полимеры биочернила/биоматериала текут как жидкость через микроканальное сопло при воздействии напряжения сдвига, но возвращаются в вязкое, гелеобразное состояние при снятии напряжения сдвига15 . Из-за высокого содержания воды полимеры биочернил / чернил биоматериала на основе гидрогеля должны быть сшиты, физически или ковалентно, для поддержания архитектуры и структурной целостности 3D-биопечатной структуры. В случае биочернил, нагруженных клетками, клетки непосредственно подвергаются химическим напряжениям во время процесса сшивания. Процесс экструзии клеток, инкапсулированных в гидрогелевую матрицу биочернила, также подвергает клетки стрессу сдвига, что может привести к снижению жизнеспособности и/или гибели клеток. После того, как 3D-модель ткани была биопечатана, трудно различить уровни цитотоксичности, вызванные самой гидрогелевой матрицей, и процессами экструзии и сшивки соответственно. Это особенно сложно в контексте 3D-каркасов, где клетки предварительно встроены в гидрогелевую матрицу, что затрудняет удаление клеток для последующих анализов, что нанесет ущерб жизнеспособности тучных клеток.

Более мягкий подход к созданию 3D-тканевых конструкций, содержащих тучные клетки, включает в себя посев клеток в предварительно напечатанные, пористые чернильные 3D-каркасы биоматериала из суспензии клеточной культуры, которая использует врожденную способность тучных клеток мигрировать из циркуляции в периферические ткани. Преимущества этого подхода к посеву клеток двояки: (i) тучные клетки не подвергаются сдвиговым и химическим нагрузкам в результате процессов экструзии и сшивки соответственно, и (ii) клетки могут быть легко удалены из 3D-каркаса после воздействия путем тщательной промывки для анализа без негативного влияния на их жизнеспособность. Дополнительным преимуществом посева и анализа жизнеспособности тучных клеток на 3D-биопечатных, пористых гидрогелевых каркасах в отличие от 2D-гидрогелевых дисков является то, что 3D-биопечатные гидрогелевые каркасы рекапитулируют микромасштабные топографические особенности тканей in vivo , которые не присутствуют в объемных, 2D-плоских гидрогелевых дисках. Этот подход является подходящим, быстрым и экономически эффективным подходом к определению потенциально катастрофических цитотоксических эффектов матриц гидрогеля биочернила на тучные клетки, а также на другие иммунологические клетки до инвестирования в дорогостоящие эксперименты по 3D-тканевой инженерии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол состоит из пяти разделов: (1) выделение костного мозга мыши и дифференцировка тучных клеток костного мозга мыши (BMMCs), (2) изготовление гидрогелевых субстратов с ЧПУ / агарозой / D-маннитом в 24-луночной системе и культура BMMC на субстратах, (3) удаление BMMC из субстратов С ЧПУ / агарозы / D-маннитола гидрогеля и анализ жизнеспособности и экспрессии биомаркеров с использованием проточной цитометрии, (4) 3D-биопечать гидрогелевых каркасов из коммерчески доступных фибриллярных наноцеллюлозных (FNC)/альгинатно-натриевых композитных биоматериальных чернил и (5) культивирование БММК на каркасах ФНК/альгината натрия гидрогеля и анализ жизнеспособности с использованием проточной цитометрии, XTT и микротитерных анализов лактатдегидрогеназы (ЛДГ).

1. Генерация культуры BMMC

ПРИМЕЧАНИЕ: Мышей усыпляли асфиксией CO2 после изофлурановой анестезии. Были выделены большеберцовая и бедренная кости, и был собран весь костный мозг. Все исследования на животных проводились в соответствии с Руководящими принципами и политикой Канадского совета по уходу за животными с одобрения Комитета по уходу и использованию животных в области здравоохранения Университета Альберты.

  1. Готовят полную питательную среду RPMI-1640, добавляя добавки, перечисленные в таблице 1 , к указанным конечным концентрациям. Отрегулируйте рН среды до 7,4-7,6 с помощью NaOH, фильтруйте-стерилизуйте с помощью одноразового фильтра для бутылок (размер пор 0,2 мкм) и храните при температуре 4 °C в темноте до 2 месяцев.
  2. Получайте бедренные кости от мышей в соответствии с протоколами и процедурами местного Комитета по уходу за животными университета.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании бедренные кости были выделены у мышей C57BL/6, но любой штамм может быть использован, если он имеет отношение к исследованию.
  3. С помощью ножниц удалите кожу и мышцы из тазобедренного сустава, а затем осторожно вытяните бедренную кость, слегка выкрутив из тазобедренного сустава (рисунок 1). Будьте осторожны, чтобы не отломить головку бедренной кости. Отрежьте большеберцовую кость от бедренной кости на медиальной фабелле ножницами. Удалите лапу, разрезав чуть выше пяточной кости и выбросьте.
  4. С помощью скальпеля удалите кожу и хрящи с кусочков бедренной и большеберцовой костей. Используя ножницы, сделайте чистый разрез на каждом конце бедренной и большеберцовой костей, обнажив красный костный мозг внутри. При необходимости удалите малоберцовую кость в этот момент, но обратите внимание, что это может помочь в манипуляциях с большеберцовой костью во время гиперемии костного мозга.
  5. Приготовьте иглу весом 26 г со шприцем luer-lock объемом 5 мл и заполните примерно 5 мл полной среды, подготовленной, как описано выше.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент неполный RPMI без добавок также может быть использован для экономии на реагентах.
  6. Удерживая щипцами бедренную или большеберцовую кость, вставьте иглу в один конец кости и аккуратно надавите на шприц. Держите кость над стерильной конической трубкой объемом 50 мл и осторожно введите примерно 5 мл среды в кость, оказывая некоторое давление. Наблюдайте, как кусочки костного мозга выпадают из другого конца кости тонкими красными лентами и в коническую трубку.
  7. Раскрутите аспираты и повторно суспендируйте в полной среде или переведите непосредственно в стерильную культуральную колбу T175 cm2 , содержащую 50 мл полной среды RPMI-1640. Поддерживают аспираты в полной среде RPMI-1640 с 30 нг/мл мышиного рекомбинантного интерлейкина (IL)-3.
  8. Через 1 день наблюдают за культурами под световым микроскопом. Культура будет состоять из гетерогенной популяции клеток различной формы и размеров и даже более крупных кусочков костного мозга. Подкармливайте клеточные культуры, добавляя 15 мл свежей среды каждые 3-5 дней с использованием полной среды RPMI-1640, как описано выше, и гарантируйте, что плотность клеток никогда не превышает 1 × 106 клеток / мл. Один раз в неделю вращайте клетки при 200 × г в течение 5 мин при комнатной температуре, повторно суспендируйте в свежей полной среде RPMI-1640 и разделите 1:4 на 50 мл среды в свежих колбах T175.
  9. Через 4 недели определяют чистоту клеток путем измерения поверхностной экспрессии рецепторов CD117 (Kit) и FceRI с помощью проточной цитометрии, как описано ниже (раздел 3.2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Через 4 недели 99% клеток должны быть двойными положительными для CD117 (Kit) и FcεRI.
  10. Через 4 недели и далее поддерживайте BMMC с 20 нг/мл IL-3 в полной среде RPMI-1640. Примерно через 6 недель клетки перестанут делиться и больше не будут требовать расщепления. Подкармливайте культуры каждые 3–5 дней, гранулируйте клетки центрифугированием один раз в неделю и повторно суспендируйте в свежей полной среде RPMI-1640.

2. Изготовление гидрогелевых субстратов с ЧПУ/агарозой/D-маннитолом и культуры BMMC

  1. В стеклянной бутылке добавьте 0,2 г порошка агарозы в фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) (2% мас./об.) до конечного объема 10 мл и кипятите в течение 1 мин при 100 °C для растворения.
  2. Растворите 2,5 г порошка с ЧПУ в PBS до конечного объема 10 мл для получения 25% мас./об.смеси.
  3. Растворить 2 г порошка с ЧПУ в PBS до конечного объема 10 мл для получения 20% мас./об.смеси и последовательно разбавлять 20% мас./об.смеси для приготовления 10, 5 и 2% мас./об. смесей с ЧПУ.
  4. Нагревайте 25, 20, 10, 5 и 2% мас./об смесей с ЧПУ до 37 °C в течение 10 мин (рисунок 2A).
  5. Добавьте 0,46 г D-маннита в горячий раствор агарозы (4,6% мас./об.) и растворите.
  6. Смешайте предварительно нагретые 25, 20, 10, 5 и 2% мас./об. смеси CNC-PBS с горячим раствором агарозы/D-маннитола в отдельных конических пробирках в соотношении 1:1, чтобы получить конечные концентрации ЧПУ 12,5, 10, 5, 2,5 и 1% мас./об.в в гидрогелевых смесях.
  7. Работая быстро, добавляют 500 мкл/лунку вышеуказанных растворов, приготовленных на стадии 2.6 в квадрузикате, в 24-луночную культуральную пластину и оставляют настояться в течение 30 мин при комнатной температуре для облегчения полимеризации (рис. 2В).
  8. Аккуратно нанесите 1000 мкл суспензии BMMC при плотности 1,1 × 106 клеток/мл поверх гидрогелевых подложек микропипеттором и избегайте прикосновения геля кончиком пипетки, так как это повредит поверхность геля и создаст частицы.
  9. Инкубировать BMMC на гидрогелевых субстратах в стерильном инкубаторе (5% CO2, увлажненная атмосфера) при 37 °C в течение 18 ч.

3. Проточный цитометрический анализ

  1. Проточный цитометрический анализ жизнеспособности BMMC путем исключения PI
    1. Осторожно удалите культуральную среду, содержащую BMMMc, из верхней части CNC/агарозы/D-маннита, избегая геля, и перенесите клетки в микрофрагменную трубку объемом 1,5 мл.
    2. Промыть BMMMc дважды PBS (pH 7,4), содержащим 0,5% мас./об. бычьего сывороточного альбумина при 300 × г в течение 5 мин при комнатной температуре, и повторно суспендировать в 180 мкл PBS-0,5% мас./об BSA до конечной плотности 1,5 × 106 клеток/мл. Перенесите ячейки на пластину с круглым дном из 96 скважин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтруйте и стерилизуйте все растворы PBS-0,5% мас./об BSA дважды с помощью шприцевого фильтра размером 0,2 мкм и храните при температуре 4 °C.
    3. Добавьте 20 мкл PBS-0,5% мас./об BSA или 10x PI (100 мкг/мл), приготовленного в PBS-0,5% мас./об BSA, к клеткам до конечной концентрации 10 мкг/мл и инкубируйте в течение 1 ч при 4°C или 15 мин при комнатной температуре в темноте. Получение флуоресцентных данных с помощью проточного цитометра, оснащенного аргоновым ионным лазером (488-514 нм) и полосовым фильтром, чтобы обеспечить обнаружение флуоресцентного излучения при 578 нм. Получение 20 000 событий на образец при скорости потока 30 мкл/мин при комнатной температуре. Проанализируйте данные, как описано ниже (разделы 3.2.7-3.2.10).
  2. Проточный цитометрический анализ BMMMc для экспрессии Kit (CD117) и поверхностного рецептора FcεRI
    1. Осторожно удалите культуральную среду, содержащую BMMMc, из верхней части CNC/агарозы/D-маннита, избегая геля, и перенесите клетки в микрофрагменную трубку объемом 1,5 мл.
    2. Дважды промыть БММК фильтрованным ПБС-0,5% БСА при 300 × г в течение 5 мин при комнатной температуре и повторно суспендировать в 180 мкл ПБС, содержащего 0,5% мас./об.БСА (1,5 × 106 клеток/мл). Перенесите повторно суспендированные ячейки на 96-луночную пластину с круглым дном.
    3. Добавьте 20 мкл 10x рабочих растворов антител к клеткам для достижения конечной концентрации 0,06 мкг/мл CD117 (c-Kit)-фикоэритрина (PE) и 0,06 мкг/мл FcεRIα-аллофикоцианина (APC) соответственно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 10x рабочие растворы антител должны быть приготовлены в стерилизованном фильтром PBS-0,5% мас./v BSA.
    4. Добавьте 20 мкл 10x контрольных рабочих растворов изотипа, содержащих либо крысиный IgG2b κ isotype control-PE, либо армянский хомяк IgG isotype control-APC, чтобы отделить лунки, содержащие клетки, которые не были окрашены ни одним из конъюгатов антитело-флуорофор на этапе 3.2.3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Контроль изотипа, крыса IgG2b κ контроль изотипа-PE и армянский хомяк IgG изотип control-APC служат для контроля неспецифического прикрепления антител к BMMC. Поскольку BMMMc не экспрессируют высокие уровни FcR, редко обнаруживается высокая фоновая флуоресценция с контрольными антителами изотипа. Подготовьте 10-кратные рабочие растворы для управления изотипом в стерилизованном фильтром PBS-0,5% мас./об BSA.
    5. Инкубировать 96-луночную пластину круглого дна в течение 1 ч при 4 °C в темноте.
    6. Промыть ячейки, добавив в каждую лунку 200 мкл свежего PBS-0,5% мас./об. буфера BSA, и центрифугу при 300 × г в течение 5 мин при комнатной температуре. Повторите шаг стирки еще раз. Осторожно удалить надосадочный материал, не касаясь ячейки гранулы; оставьте после себя немного супернатанта, чтобы гарантировать, что гранула клетки остается нетронутой.
    7. После промывки повторно суспендируют клетки в 100 мкл 0,5% мас./об. BSA, 0,05% мас./об.азида натрия в PBS (рН 7,4), который был стерильно отфильтрован дважды с помощью шприцевого фильтра размером 0,2 мкм. Получение флуоресцентных данных в каналах детектора PE и APC с помощью проточного цитометра, как описано выше на этапе 3.1.3.
    8. Анализируйте данные с помощью программного обеспечения, способного просматривать и анализировать файлы цитометрических данных потока с расширением «.fcs».
    9. Начните анализ с построения прямого рассеяния (FSC) вдоль оси x и бокового рассеяния (SSC) вдоль оси Y и затвора для сохраненной популяции клеток с диапазоном FSC log10 1,5-5,0 и диапазоном SSC log10 0,75-3,25 в необработанных и неокрашенных ячейках, как показано на рисунке 3A(i),(ii).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это служит для обеспечения того, чтобы обломки клеток с низкими значениями FSC и SSC были исключены из анализа. Тучные клетки обычно являются очень зернистыми (с высоким SSC) клетками и большими (с высоким FSC) по сравнению с другими иммунологическими типами клеток, такими как моноциты и лимфоциты.
    10. Затем генерируйте точечные графики FSC и SSC и профили гистограмм необработанных образцов, которые были окрашены красителем, антителами или контролем изотипа, и получайте среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) в каналах PE или APC в соответствии с спектром излучения специфического конъюгата антитело-флуорофор или используемого красителя. Применять один и тот же набор затворов и параметров ко всем образцам BMMC, инкубированным с различными субстратами С ЧПУ/агарозой/D-маннитолом и окрашенным соответствующими элементами контроля изотипа, антителами или красителем; получить МФО.
      ПРИМЕЧАНИЕ: По существу, точечные графики FSC и SSC необработанных окрашенных образцов должны быть неотличимы от необработанных/неокрашенных образцов, полученных на этапе 3.2.9, для обеспечения того, чтобы процедура окрашивания не изменяла размер ячейки (измеряемый FSC) или гранулярность (измеряемую SSC) (рисунок 3A(i),(ii)).
    11. Рассчитайте средние MFI и стандартную среднюю погрешность (SEM) для каждой выборки из 4 независимых экспериментов с последующей генерацией графиков с использованием программного пакета статистического анализа.
    12. Подготовьте наложения гистограмм в программном обеспечении для анализа цитометрических данных потока (рисунок 3B, 4A(ii),B(ii)).

4.3D Биопечать субстратов FNC/гидрогеля альгината натрия

ПРИМЕЧАНИЕ: 3D-биопринтер, используемый в этом исследовании, представляет собой пневматическо-экструзионную систему, оснащенную двумя независимыми печатающими головками с контролируемой температурой. Чернила биоматериала, используемые для 3D-биопечати гидрогелевых каркасов, состоят из (а) высокогидратированной фибриллярной наноцеллюлозы (FNC), которая морфологически похожа на коллаген, (б) альгинат натрия и (c) D-маннит. Он поставляется в виде стерильной гидрогелевой суспензии в картриджах по 3 мл, к которым могут быть прикреплены стерильные конические сопла для биопечати luer-lock (22, 25 или 27 G).

  1. Используйте этот протокол с печатающими головками и печатной кроватью при комнатной температуре, где комнатная температура составляет 20-25 °C.
  2. Храните струйные картриджи с биоматериалом при температуре 4 °C для поддержания стабильности гидрогелевого композита. Перед началом 3D-биопечати извлеките картридж (3 мл) из холодильника и дайте ему уравновеситься до комнатной температуры.
  3. Установка картриджа Bioink на 3D-биопринтер INKREDIBLE+
    1. Снимите синие торцевые колпачки с картриджа с биоматериалом объемом 3 мл (рисунок 5B(i)) и прикрепите стерильную коническую сопло для биопечати весом 22 г (синий) к концу картриджа Bioink с блокировкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо прикрепить желаемое коническое сопло для биопечати к картриджу биочернила перед установкой картриджа и выполнением последующих этапов калибровки, так как невыполнение этого требования приведет к неправильной калибровке оси Z 3D-биопринтера.
    2. Подключите трубку подачи воздуха для печатающей головки 1 (PH1, слева) к противоположному концу картриджа и вставьте картридж с прикрепленным коническим соплом для биопечати в вертикальный слот PH1 (рисунок 5A(ii)).
    3. Плотно установите картридж в PH1 с коническим соплом для биопечати, простирающимся под печатающей головкой. Затяните винт на PH1 по часовой стрелке до тех пор, пока палец не затянется, чтобы зафиксировать картридж Bioink на месте. Обратите внимание, что 3D-биопечать может быть выполнена с PH2, оставленным пустым.
  4. Калибровка осей x-y-z 3D-биопринтера
    1. Включите 3D-биопринтер и запустите программное обеспечение биопринтера на ПК, подключенном к 3D-биопринтеру через кабель USB 2.0.
    2. В программном обеспечении нажмите кнопку CONNECT , чтобы синхронизировать программное обеспечение с 3D-биопринтером.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Синхронизация выполняется успешно, когда ультрафиолетовые светодиодные индикаторы печатающей головки включаются и выключаются, а вентилятор фильтра HEPA выключается и снова включается. Программное обеспечение должно быть синхронизировано с 3D-биопринтером перед самонаведением осей биопринтера и калибровкой начальной точки, как описано в последующих шагах.
    3. Соблюдайте четыре опции в главном меню управления 3D-биопринтера: (i) ПОДГОТОВИТЬ BIOPRINT, (ii) BIOPRINT, (iii) UTILITIES MENU и (iv) STATUS SCREEN. Выберите опцию ПОДГОТОВИТЬ БИОПЕЧАТЬ , затем прокрутите вниз до и выберите опцию HOME AXES .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Затем 3D-биопринтер переместит сборку печатающей головки назад и влево для калибровки осей Y и X соответственно. После этого, когда печатающие головки будут приостановлены в крайнем левом положении, биопринтер поднимет печатную кровать до тех пор, пока калибровочный переключатель оси Z (расположенный на печатной кровати) не вступит в контакт с коническим соплом биопечати, установленным на печатающей головке 1
    4. После успешной калибровки осей x-y-z наблюдайте за небольшим опусканием печатной ленты и перемещением печатающих головок выше центральной точки печатной кровати (рисунок 5A(i)).
  5. Калибровка начальной точки биопринтера для биопечати в 24-луночных пластинах
    1. Извлеките стерильную 24-луночную культуральную пластину из герметичной пластиковой упаковки и отметьте точку в центральной точке скважины D1 на нижней стороне пластины постоянным маркером. Снимите крышку пластины и поместите 24-луночную культуральную пластину на печатную грядку с колодцем D1, расположенным в переднем левом углу печатной кровати.
    2. В главном меню управления выберите МЕНЮ УТИЛИТЫ , а затем выберите ПЕРЕМЕСТИТЬ ОСЬ. Перемещайте печатающие головки с шагом 1 мм вдоль осей x и Y до тех пор, пока коническое сопло для биопечати PH1 не окажется непосредственно над точкой, отмеченной под колодцем D1. При необходимости точно настройте положение конической биопечатной насадки над точкой, перемещая печатающие головки с шагом 0,1 мм.
    3. Записывайте координаты x- и y конической биопечати сопла непосредственно над центром скважины D1, как указано на экране панели управления 3D-биопринтера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В случае используемого здесь биопринтера INKREDIBLE+ 3D координаты x и y следующие: x : -46.5 и y : -27.5. Эти координаты служат отправной точкой в центре скважины D1 для биопечати в 24-луночной пластине.
    4. Затем поднимите печатное полотно с шагом 1 мм до тех пор, пока дно скважины D1 почти не коснется конического сопла для биопечати, установленного в печатающей головке 1. При необходимости настройте движение печатной ленты с шагом 0,1 мм (рисунок 5A(ii)). Затем в меню УТИЛИТЫ выберите опцию КАЛИБРОВКА ПО ОСИ Z , а затем выберите и подтвердите опцию КАЛИБРОВКА STORE Z .
    5. Вернитесь в главное меню и выберите опцию ПОДГОТОВИТЬ БИОПЕЧАТЬ . Прокрутите вниз до и выберите параметр CALIBRATE Z .
      ПРИМЕЧАНИЕ: 3D-биопринтер теперь будет опускать печатное полотно после успешного выполнения калибровки по оси Z (рисунок 5A(iii)).
  6. Обновление файла G-кода 24-луночной пластины с правильными координатами начальной точки
    1. Откройте предоставленный файл геометрического кода пластины (G-код) на 24 скважины в программном обеспечении биопринтера (Дополнительный файл 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот 24-луночный файл G-кода кодирует печать 2-слойных прямолинейных конструкций 5 x 5 x 1 мм в каждой скважине (рисунок 5C(i),(iii)). Предоставленные файлы G-кода можно использовать с любым программным обеспечением для 3D-биопечати.
    2. Обратите внимание, что строка 1 файла G-кода читает G0 X-50.0 Y-33.5 ; Центральное положение скважины D1. Обновите координаты x и y на строке 1 значениями, полученными на шаге 4.5.3, т.е. строка 1 теперь должна читать G0 X-46.5 Y-27.5; Центральное положение скважины D1. Сохраните файл под новым именем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура служит для калибровки файла G-кода таким образом, чтобы печать началась в центре скважины D1 на основе координат x,y конкретного используемого 3D-биопринтера. Этот подход может быть использован для калибровки 24-луночного файла G-кода пластины для печати с помощью любого экструзионного 3D-биопринтера. Для целей этого исследования была напечатана только левая половина 24-луночной пластины, т.е. скважины A1-3, B1-3, C1-3 и D1-3. Также предоставляется отдельный файл G-кода, который кодирует печать 2-слойных прямолинейных конструкций 5 x 5 x 1 мм в сетке 3 x 4 (Дополнительный файл 2, рисунок 5C(ii)).
  7. Регулировка давления экструзии для печатающей головки 1 (PH1)
    1. Убедитесь, что пневматический насос плотно подключен к заднему воздухозаборному порту биопринтера INKREDIBLE+ 3D, и включите пневматический насос.
    2. Вытащите переднюю ручку управления, расположенную на правой стороне биопринтера INKREDIBLE+ 3D.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Передняя ручка управления регулирует давление для PH1, в то время как задняя ручка управления регулирует давление для PH2.
    3. Обратите внимание на цифровые манометры для PH1 и PH2, расположенные на передней панели биопринтера, каждый из которых считывает около 0 кПа. Медленно поворачивайте ручку управления вперед по часовой стрелке, пока давление, указанное на левом манометре для PH1, не достигнет 12 кПа (рисунок 5A(iii)).
    4. Поместите сложенную папиросную бумагу или кусок водонепроницаемой уплотнительной пленки под сопло для печати установленного картриджа, стараясь не коснуться печатного сопла.
    5. В главном меню управления 3D-биопринтером выберите ПОДГОТОВИТЬ BIOPRINT.
    6. Перейдите к пункту ВКЛЮЧИТЬ PH1 и выберите ВКЛЮЧИТЬ ЕГО. Обратите внимание, что чернила биоматериала начинают выдавливаться из печатного сопла. При необходимости увеличьте давление экструзии, вращая ручку управления по часовой стрелке до тех пор, пока чернила биоматериала не будут экструдированы в непрерывную нить, и запишите новую настройку давления. Работайте быстро, чтобы избежать траты чернил биоматериала.
    7. Выберите ВЫКЛЮЧИТЬ PH1 , чтобы остановить экструзию чернил биоматериала, удалите папиросную бумагу или пленку, содержащую экструдированные чернила биоматериала, с печатной кровати и закройте дверцу биопринтера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 3D-биопринтер автоматически включает подачу давления воздуха на PH1 во время печати в соответствии с инструкциями файла G-кода.
  8. 3D биопечать прямолинейных гидрогелевых подложек в формате 24-луночной пластины
    1. В главном меню управления на 3D-биопринтере выберите UTILITIES MENU. Перейдите и выберите DISABLE SD PRINT, что позволит программному обеспечению биопринтера передавать файлы G-кода на 3D-биопринтер для печати.
    2. Нажмите кнопку LOAD в программном обеспечении биопринтера и выберите обновленный файл G-кода пластины на 24 скважины, сохраненный на шаге 4.6.2.
    3. На правой панели управления в программном обеспечении выберите вкладку ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЙ ПРОСМОТР и нажмите кнопку ПЕЧАТЬ , чтобы начать биопечать в скважине D1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании файла G-кода пластины сетки 3 x 4, биопечать будет завершена в скважине A3 24-луночной пластины (рисунок 5C(ii),D), в отличие от скважины A6, если напечатана полная пластина из 24 скважин.
    4. По завершении биопечати прямолинейных конструкций накройте крышкой 24-луночную пластину и переместите ее в шкаф биобезопасности класса II.
    5. Погружайте каждую прямолинейную конструкцию в две капли стерильного раствора CaCl2 объемом 50 мМ (рисунок 5B(ii)) и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это служит для ионного сшивания альгинатных полимерных цепей с ионами Ca2+ и позволяет прямолинейным конструкциям сохранять свою структурную целостность.
    6. Осторожно аспирируйте раствор CaCl2 из каждой конструкции и промывайте один раз в 1 мл 1x PBS (pH 7,4), чтобы удалить избыток CaCl2 (рисунок 5D).
    7. Чтобы предотвратить обезвоживание биопечатных гидрогелевых конструкций, поддерживайте 3D-биопечатные прямолинейные конструкции в свежем 1x PBS до тех пор, пока BCMC не будут готовы к посеву на конструкции (рисунок 5D).

5. Инкубация БММК на 3D биопечатных прямолинейных каркасах и проверка жизнеспособности

  1. Инкубация BMMC на 3D-биопечатных прямолинейных гидрогелевых каркасах
    1. Посевные аликвоты BMMMc на 3D-биопечатные прямолинейные каркасы в трех экземплярах в течение четырех различных длительностей, например, 6, 18, 24 и 48 ч, так что все обработки заканчиваются одновременно. Используйте BMMC, засеянные в пустые скважины в трех экземплярах в течение тех же периодов времени, что и необработанные контрольные элементы.
    2. Асептически переносят БММК из колбы для культивирования T175 см2 в стерильную коническую трубку объемом 50 мл и гранулируют БММК при 200 × г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    3. Повторно суспендировать гранулу в 50 мл свежей полной среды RPMI, содержащей 20 нг/мл IL-3, и рассчитать плотность живых клеток, подсчитав аликвоту трипан окрашенных в синий цвет BMMMc с использованием гемацитометра.
    4. Исходя из плотности клеток, рассчитанной на стадии 5.1.3, готовят 6 мл аликвоты суспензии BMMC при конечной плотности 1 × 106 клеток/мл.
    5. Для инкубационной установки продолжительностью 48 ч аспирируйте PBS из скважин A1-3, содержащих 3D-биопечатные прямолинейные гидрогелевые каркасы, и пипетку 1 мл суспензии BMMC (1 × 106 клеток /мл) в каждую скважину. Кроме того, пипетка 1 мл Суспензии БММК (1 × 106 клеток/мл) в скважины А4-6 без биопечатных конструкций для использования в качестве необработанного контроля. Инкубировать оставшиеся скважины, содержащие биопечатные каркасы (B1-3, C1-3, D1-3) в RPMI без добавок для предотвращения обезвоживания до тех пор, пока не будет достигнуто соответствующее время для посева BMMC в течение 24, 18 и 6 ч продолжительности обработки. Заполняйте скважины без биопечатных каркасов (B4-6, C4-6, D4-6) 1 мл PBS до тех пор, пока не будет достигнуто соответствующее время для посева с BMMC для 24, 18 и 6-часовых временных точек.
    6. Инкубируйте плиту из 24 скважин при 37 °C в 5% увлажненной атмосфере CO2 .
    7. Для инкубационной установки продолжительностью 24 ч аспирировать ранее существовавшую культуральную среду/буфер из скважин B1-6 и посеять 1 мл суспензии BMMC (1 × 106 клеток/мл) в эти скважины. Верните тарелку в инкубатор.
    8. Для инкубационной установки продолжительностью 18 ч аспирировать ранее существовавшую культуральную среду/буфер из скважин С1-6 и засеять 1 мл суспензии BMMC (1 × 106 клеток/мл) в эти скважины. Верните тарелку в инкубатор.
    9. Для инкубационной установки 6 ч аспирировать ранее существовавшую культуральную среду/буфер из скважин D1-6 и посеять 1 мл суспензии BMMC (1 × 106 клеток/мл) в эти скважины. Верните тарелку в инкубатор.
    10. Для завершения инкубации дозируйте образцы из каждой скважины 24-луночной пластины для (i) окрашивания и анализа PI с помощью проточной цитометрии, (ii) анализа жизнеспособности клеток XTT и (iii) анализа высвобождения LDH. Поэтому убедитесь, что пластина с круглым дном из 96 скважин и необходимые микрофрагменные трубки объемом 1,5 мл маркированы задолго до конечной точки инкубации.
  2. Отбор проб клеток для метаболического анализа XTT
    1. Тщательно повторно суспендируйте БММК в питательной среде в каждой скважине, стараясь не повредить и не фрагментировать 3D-биопечатные гидрогелевые каркасы.
    2. Асептически переносят 40 мкл однородной суспензии BMMC из каждой скважины в стерильные 1,5 мл микрофьюжные трубки, содержащие 760 мкл свежей полной среды RPMI (конечный объем = 800 мкл), и вихрь кратковременно перемешивают.
    3. Дозируйте 100 мкл разбавленных суспензий BMMC в трех экземплярах в плоскодонную 96-луночную микротитровую пластину, которая подходит для регистрации измерений поглощения (см. Таблицу материалов) на микропластинчатом спектрофотометре.
    4. Дозируйте 50 мкл рабочего раствора XTT в каждую скважину, содержащую суспензию ячейки BMMC, используя многоканальную микропипетку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Готовят рабочий раствор XTT путем смешивания 5 мл реагента XTT со 100 мкл электронно-связующего реагента. Разморозьте эти компоненты при -20 °C на водяной бане при температуре 37 °C непосредственно перед использованием.
    5. Инкубируйте плиту из 96 скважин при 37 °C в 5% увлажненной атмосфере CO2 в течение 24 ч.
    6. В конце инкубации снимите из инкубатора 96-луночную пластину и дайте остыть до комнатной температуры. Запись значений поглощения на микропластинчатом спектрофотометре при 450 нм с вычитанием фона при 650 нм.
  3. Отбор проб супернатанта для анализа лактатдегидрогеназы (ЛДГ)
    1. Переложите оставшиеся суспензии BMMC (960 мкл) из каждой скважины 24-луночной пластины в микрофьюжные трубки и гранулируйте ячейки при 200 × г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    2. Пипетка три 100 мкл аликвоты супернатанта клеточной культуры из каждой микрофьюжной трубки в 96-луночную микротитрную плоскодонную пластину. Выбросьте оставшиеся супернатанты из каждой микропластинки и сохраните гранулы BMMC для дальнейшего окрашивания PI в разделах 5.4.1-5.4.8.
    3. Пипетка 50 мкл рабочего раствора ЛДГ в каждые 100 мкл аликвоты супернатанта.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к Дополнительному файлу 3 для приготовления реагентов для анализа ЛДГ.
    4. Инкубировать в течение 1 ч в темноте при комнатной температуре.
    5. Пипетка 50 мкл 1 М уксусной кислоты в каждую лунку для остановки реакции.
    6. Запись значений поглощения на микропластинчатом спектрофотометре при 490 нм с вычитанием фона при 680 нм.
  4. Проточный цитометрический анализ жизнеспособности BMMC путем исключения йодида пропидия (PI)
    1. Повторно суспендировать гранулы BMMC в буфере промывки потока (PBS [pH 7,4], содержащем 0,5% мас./об. BSA), и гранулировать ячейки при 300 × г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    2. Повторите этап стирки с буфером промывки потока еще раз.
    3. Повторно суспендируйте каждую гранулу BMMC в 400 мкл буфера промывки потока.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всего будет 24 повторно суспендированных образца BMMC: 12 образцов BMMC инкубированы на биопечатных гидрогелевых субстратах (4 временные точки в трех экземплярах) и 12 образцов BMMC, инкубированных в скважинах без биопечатных конструкций (4 временные точки в трех экземплярах).
    4. В круглодонной 96-луночной микротитровой пластине пипетка 20 мкл проточного буфера промывки в скважины А1-12 и В1-12. В той же микротитровой пластине пипетка 20 мкл 10x PI окрашивающего раствора (100 мкг/мл PI в буфере промывки потока) в скважины C1-12 и D1-12.
    5. Дозируйте 180 мкл из 12 образцов BMMC, инкубированных на биопечатных гидрогелевых субстратах, в скважины A1-12 (один образец на скважину). Дозировать 180 мкл из 12 образцов BMMC, инкубированных без биопечатных гидрогелевых субстратов, в скважины B1-12 (один образец на скважину). Используйте образцы BMMC, дозированные в скважины A1-12 и B1-12, в качестве незапятнанных контрольных элементов для каждого состояния обработки (всего 24 контрольных элемента).
    6. Дозируйте 180 мкл из 12 образцов BMMC, инкубированных на биопечатных конструкциях, в скважины C1-12 (один образец на скважину). Дозируйте 180 мкл из 12 образцов BMMC, инкубированных без биопечатных конструкций, в скважины D1-12 (один образец на скважину).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы BMMC в скважинах C1-12 и D1-12 будут окрашиваться при конечной эффективной концентрации PI 10 мкг/мл (всего 24 окрашенных образца).
    7. Инкубировать пластину либо в течение 1 ч при 4 °C, либо 15 мин при комнатной температуре в темноте.
    8. В конце инкубационного периода проанализируйте образцы непосредственно с микротитерной пластины на проточном цитометре, как описано ранее в разделе 3.1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Одной из наиболее важных характеристик успешной биоматериалной чернил или культурального субстрата является биосовместимость. Прежде всего, субстрат не должен вызывать клеточную гибель. Существует несколько микротитров и проточных цитометрических методов количественной оценки жизнеспособности и некроза клеток; однако эти методы не поддаются анализу клеток, встроенных в гидрогелевую матрицу. В этом протоколе вышеупомянутое ограничение обходится путем посева BMMC на гидрогелевой субстрат или биопечатный каркас. После опред...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Изготовление 3D-биомиметических тканей требует успешного объединения биочернила, который имитирует компоненты внеклеточного матрикса, с клеточным компонентом (компонентами) для создания физиологических аналогов тканей in vivo . Это обусловливает необходимость использования первичных клеток, а не трансформированных клеток, при изготовлении физиологических биомиметических тканей. Первичные иммунологические клетки, такие как тучные клетки, однако, особенно восприимчивы к цитотоксическим эффектам и фенотипическим из...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Эта работа была поддержана Национальным исследовательским советом Канады и Alberta Innovates.

Благодарности

Мы благодарим Alberta Innovates за предоставление ЧПУ, а также Кена Харриса и Дже-Янг Чо за их технические консультации при подготовке матрицы CNC/agarose/D-mannitol. Мы также благодарим Бена Хоффмана, Хизер Уинчелл и Николь Диамантидес за их технические консультации и поддержку в настройке и калибровке 3D-биопринтера INKREDIBLE+.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
A
Acetic Acid (glacial)Sigma AldrichAX0074-6
Agarose (OmniPur)EMD Millipore Corporation2125-500GM
Контроль изотипа IgG армянского хомяка, APC (клон: eBio299Arm)Thermo Fisher Scientific17-4888-82
B
b-меркаптоэтанолFisher ScientificO3446I-100
b-никотинамидадениндинуклеотид натриевая соль (NAD)Sigma AldrichN0632-5G
BD 5 мл шприц (наконечник Люэра-Лока)BD309646
BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 inBD305111
BioLite 24 Well MultidishThermo Fisher Scientific930-186
BioLite 96 Well MultidishThermo Fisher Scientific130-188
BioLite 175 см2 колба вентилируемаяThermo Fisher Scientific130-191
Шкаф биобезопасности класса IIMicrozone Corp., КанадаBK-2-6-B3
BSA, фракция V (OmniPur)EMD Millipore Corporation2930-100GM
C
C57BL/6 мышейThe JacksonLaboratory 000664
CD117 (c-Kit) Моноклональное антитело, PE (Клон: 2B8)Thermo Fisher Scientific12-1171-82
CELLINK BIOINK (3 x 3 мл картриджа)CELLINK LLCIK1020000303
CELLINK CaCl2 Сшивающий агент - стерильный флакон 1 x 60 млCELLINK LLC
CELLINK Пустые картриджи 3cc с торцевыми и наконечниковыми крышкамиCELLINK LLCCSC0103000102
CELLINK HeartWare для ПКCELLINK LLCВерсия 2.4.1
CELLINK INKREDIBLE+ 3D БИОПРИНТЕРCELLINKLLC S-10003-001
CELLINK Стерильные стандартные конические сопла для биопечати 22GCELLINK ООО
CELLINK Стерильные стандартные конические сопла для биопечати 25GCELLINK LLC
CELLINK Стерильные стандартные конические сопла для биопечати 27GCELLINK LLC
Набор для пролиферации клеток II (XTT) (Roche)Sigma Aldrich11465015001
центрифуга (настольная)Eppendorf5804R
Corning Costar  96 Хорошо прозрачная плоскодонная необработанная микропластина PSSigma AldrichCLS3370
CO2Инкубатор Binder GmbH,Германия 9040-0113
Проточный цитометр CytoFLEXBeckman CoulterA00-1-1102
D
D-маннитол (MilliporeSigma Calbiochem)Fisher Scientific44-390-7100GM
F
Falcon 15 мл полистирольные конические пробирки, стерильныеCorning352095
Falcon 50 мл полистирольные конические пробирки, стерильныеCorning352070
FceR1 альфа-моноклональное антитело, APC (клон: MAR-1)Thermo Fisher Scientific17-5898-82
Фетальная бычья сыворотка (FBS), квалифицированная, горячая инактивированопрограммное обеспечение Thermo Fisher Scientific12484028
FlowJoBecton Dickinson & Co. СШАверсии 10.6.2
G
GraphPad PrismGraphPad Software, LLCВерсия 8.4.3
H
Hemacytometer (Улучшено VWR15170-208
HEPES Натриевая сольFisher ScientificBP410-500
I
Iodonitratrazolium chloride (INT)Sigma AldrichI10406-5G
L
L-Glutamine 200 mM (Gibco)Thermo Fisher Scientific25030-081
Литий L-лактатSigma AldrichL2250-100G
M
MEM Заменимые аминокислоты 100 мл 100x (Gibco)Thermo Fisher Scientific11140-050
1-метокси-5-метилфеназиния метилсульфат (MPMS)Sigma AldrichM8640
Микропробирки (1,7 мл прозрачные)AxygenMCT-175-C
Микропробирки (2,0 мл прозрачные)AxygenMCT-200-C
MilliQ Academic (для производства сверхчистой воды MilliQ)MilliporeZMQS60001
N
Nalgene Rapid-Flow 90 мм Filter Unit (размер пор 0,2 мм, 500 мл)Thermo Fisher Scientific566-0020
Шприцевой фильтр Nalgene (0,2 мм PES, 25 мм)Thermo Fisher Scientific725-2520
P
Пенициллин стрептомицин 100 мл (Gibco)Thermo Fisher Scientific15140-122
PBS pH 7,4, без кальция/магния, 500 мл (Gibco) Thermo Fisher Scientific10010-023
Йодид пропидия, 1,0 мг/мл (Invitrogen) Thermo Fisher ScientificP3566
R
Rat IgG2b каппа Контроль изотипа, PE (клон: eB149/10H5)Thermo Fisher Scientific12-4031-82
Рекомбинантная мышиная IL-3PeproTech, Inc. 213-13
RPMI-1640 Medium 1X + 2,05 мМ L-глютамин (HyClone)GE HealthcareSH30027.01
S
Sarstedt 96 лунка с круглым основанием PS прозрачная микротестовая пластина (82.1582.001)Fisher ScientificNC9913213
Азид натрия, 500 гFisher ScientificBP922I-500
Пируват натрия (100 мМ) 100X (Gibco)Thermo Fisher Scientific11360-070
T
Tris Base (2-амино-2(гидроксиметил)-1,3-пропандиол)Sigma Aldrich252859
раствор трипана синего (0,4%, для микроскопии)Sigma Aldrich93595
V
Микропланшетный спектрофотометр VARIOSKAN LUX (Тип: 3020)Thermo Fisher ScientificVLBL00D0
CL1010006001 NZ4220005001 NZ4250005001 NZ4270005001 трубки

Ссылки

  1. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
  2. Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: Scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
  3. Lee, K. Y., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering. Chemical Reviews. 101 (7), 1869-1879 (2001).
  4. Halib, N., Ahmad, I. Nanocellulose: Insight into health and medical applications. Handbook of Ecomaterials. , Springer. Cham. 1345-1363 (2019).
  5. Alonso-Lerma, B., et al. High performance crystalline nanocellulose using an ancestral endoglucanase. Communications Materials. 1 (1), 57(2020).
  6. Tummala, G. K., Lopes, V. R., Mihranyan, A., Ferraz, N. Biocompatibility of nanocellulose-reinforced PVA hydrogel with human corneal epithelial cells for ophthalmic applications. Journal of Functional Biomaterials. 10 (3), 35(2019).
  7. Fey, C., et al. Bacterial nanocellulose as novel carrier for intestinal epithelial cells in drug delivery studies. Materials Science and Engineering: C. 109, 110613(2020).
  8. Ojansivu, M., et al. Wood-based nanocellulose and bioactive glass modified gelatin-alginate bioinks for 3D bioprinting of bone cells. Biofabrication. 11 (3), 035010(2019).
  9. Jonsson, M., et al. Neuronal networks on nanocellulose scaffolds. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (11), 1162-1170 (2015).
  10. Samulin Erdem, J., et al. Cellulose nanocrystals modulate alveolar macrophage phenotype and phagocytic function. Biomaterials. 203, 31-42 (2019).
  11. Menas, A. L., et al. Fibrillar vs crystalline nanocellulose pulmonary epithelial cell responses: Cytotoxicity or inflammation. Chemosphere. 171, 671-680 (2017).
  12. Halova, I., Draberova, L., Draber, P. Mast cell chemotaxis chemoattractants and signaling pathways. Frontiers in Immunology. 3, 1-19 (2012).
  13. Groll, J., et al. A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks. Biofabrication. 11 (1), 013001(2019).
  14. Schwab, A., et al. Printability and shape fidelity of bioinks in 3D bioprinting. Chemical Reviews. 120 (19), 11028-11055 (2020).
  15. Jungst, T., Smolan, W., Schacht, K., Scheibel, T., Groll, J. Strategies and molecular design criteria for 3D printable hydrogels. Chemical reviews. 116 (3), 1496-1539 (2016).
  16. Sasaki, D. T., Dumas, S. E., Engleman, E. G. Discrimination of viable and non-viable cells using propidium iodide in two color immunofluorescence. Cytometry. 8 (4), 413-420 (1987).
  17. Usov, I., et al. Understanding nanocellulose chirality and structure-properties relationship at the single fibril level. Nature Communications. 6 (1), 7564(2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

3DXTT
Изготовление кристаллических наноцеллюлозных встроенных чернил агарозного биоматериала для культуры тучных клеток, полученных из костного мозга
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.